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检测Pristionchus及其他线虫的捕食性摄食行为

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DOI：

10.3791/54404

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2016年9月4日

 ,  ,  , 
1Department for Evolutionary Biology, Max-Planck Institute for Developmental Biology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

行为学实验为理解神经元功能提供了强有力的工具。本文介绍了几种用于量化模式线虫Pristionchus pacificus及其近缘种中捕食性摄食行为的实验方案。此外，我们还提供了分析捕食性摄食适应性特征的方法，包括口器结构和齿状结构。

摘要

本方案提供了多种用于分析和量化线虫捕食性摄食行为的方法。包括多种线虫物种，如 Pristionchus pacificus 表现出复杂行为, 最显著的特征之一是捕食其他线虫的幼虫。然而，这些行为在模式生物中并不存在 秀丽隐杆线虫， 迄今为止，随着可靠的动物行为检测方法的发展，它们才刚刚被详细描述。 1这些捕食行为依赖于表型可塑但形态固定的口器类型，因此对这些动物进行准确鉴定和分类至关重要。在 P. pacificus 存在两种口型：狭口型和宽口型表型 2，只有宽口型（eurystomatous）个体具有额外的牙齿，并能够杀死其他线虫的幼虫。通过分离出大量大小匹配的猎物幼虫，并将其暴露于捕食性线虫，可在准确鉴定口型的线虫上开展“尸体检测”和“咬击检测”实验。这些检测方法可用于快速量化捕食成功率，并对参与捕食行为的单个线虫进行详细的行为学分析。此外，结合高速相机的使用，还可实现对咽部活动（包括牙齿运动和泵吸动态）变化的可视化观察。

引言

具有小型但复杂的 nervous systems 的线虫已被证明是研究神经生物学诸多方面的有力工具，包括行为研究。这些研究大多集中于模式生物 秀丽隐杆线虫 其中已成功解析和分析了多种不同的行为，包括机械感知 3，趋化性 4，热趋向性 5,6 和趋磁性 7 影响交配 8,9，学习 10 摄食行为 11然而，其他亲缘关系较远的线虫物种表现出一些在杆形目线虫中未观察到的行为 秀丽隐杆线虫 或者表现出更复杂的层次，这引发了关于其进化与调控机制的相关问题。一个这样的例子可以在远缘相关的双胃线虫目线虫中观察到 Pristionchus pacificus 其表现出的摄食行为和节律远比观察到的复杂 秀丽隐杆线虫 1. 尽管这两个物种具有同源的咽部神经元 12伴随着这些额外的摄食行为， P. pacificus 还表现出更广泛的食性，因为它们是积极的捕食者，能够通过捕食其他线虫的幼虫来补充其以细菌为主的饮食。幸运的是 P. pacificus 已开发为比较与整合进化生物学的模式体系，因此目前已有多种分子与遗传工具可供使用，包括一个已完成全序列测定并加以注释的基因组 13，包括转基因在内的分子与遗传工具 14 和 CRISPR/Cas9 15,16 以及详细且注释完善的系统发育树 17 包含25个以上近缘物种，以及其新近发现的姊妹种。此外，众多物种的生态学 Pristionchus 物种包括 P. pacificus 具有明确的定义，目前已描述了多个物种，它们与鳃金龟科甲虫存在腐生共栖关系，这种宿主常与其他线虫物种共同利用。 18. P. pacificus 因此为解析新行为的演化及其生态学意义提供了一个极佳的模型系统。

为了分析如P. pacificus等线虫物种的捕食行为，我们开发了多种新的行为检测方法，以便于观察和量化其捕食动作。由于P. pacificus具有双型口器结构，且该结构显著影响其捕食行为，因此准确鉴定其形态类型至关重要1,2。窄口型（stenostomatous）形态具有一个单一的钝性背齿，不参与任何捕食性摄食行为；而宽口型（eurystomatous）形态则具有一个更大的爪状背齿以及一个额外的对向亚腹齿，二者协同作用，可有效刺破猎物的角质层。在不同Pristionchus物种之间以及P. pacificus内部，捕食性的宽口型与非捕食性的窄口型个体比例存在差异；然而，在P. pacificus野生型菌株（PS312）中，宽口型口器形态的比例通常为70–90%2。此外，口器形态的比例可能因不同环境因素（包括已知因素如饥饿和某些小分子信号，以及未知因素）的影响而发生波动，因此，准确鉴定并分离出具有捕食能力的宽口型个体，对于成功开展捕食行为检测至关重要。

除了描述捕食性口器形态外，我们还开发了一种"取食行为检测法"，用于直接观察和量化包括咬合、杀戮及摄食事件在内的捕食行为。在此方法中，通过过滤新近饥饿培养物获得猎物线虫，并将其与具有捕食能力的成年P. pacificus共同孵育，在短时间内进行联合观察。此外，我们还开发了一种高通量的"尸体检测法"，通过间接观察捕食事件，实现对捕食行为的快速筛选。该方法利用幼虫尸体的存在作为检测捕食活动的工具。这两种检测方法均为观察和测量P. pacificus等线虫物种的捕食行为提供了简便且高度可重复的技术手段。

方案

1. 口器形态表型分析

  1. 在琼脂糖垫上鉴定线虫口器形态
    注意：为观察线虫的口器形态，需使用温和麻醉法将线虫固定在琼脂糖垫上，并按以下步骤操作。
    1. 在6 cm标准线虫培养基（NGM）平板上培养和维持线虫种群（如 P. pacificus），并以 E. coli OP50 菌苔作为食物来源19。
    2. 制备琼脂糖垫：取0.06 g琼脂糖加入3 ml H2O中，置于15 ml离心管内，配制成3 ml的2%琼脂糖溶液。该溶液可在4 °C下保存长达一年。
    3. 使用微波炉彻底熔化琼脂糖，或 alternatively 使用设定温度为 > 88°C的加热块进行熔化。
    4. 琼脂糖完全熔化后，加入10 µl 10%叠氮化钠溶液，并充分混匀。注意：干燥的叠氮化钠具有反应活性，所有形态的叠氮化钠均有毒性。
    5. 使用1 ml微量移液器，将不少于300 µl的液态琼脂糖-叠氮化钠混合液滴加至标准玻璃载玻片中央。
    6. 在琼脂冷却前，迅速将另一张载玻片覆盖于液滴之上，压平形成琼脂糖垫。根据需要重复此步骤制备多个垫片。
    7. 使用前，通过滑动方式将两张载玻片分开。注意：若琼脂糖垫制备过早，可能过于干燥，从而损伤线虫。
    8. 将线虫转移至麻醉用琼脂糖垫时，先在垫中央滴加一滴M9缓冲液（2–3 µl）。用挑针将2–3条年轻的 P. pacificus 成虫转移至M9液滴中，再小心盖上盖玻片。此时 P. pacificus 线虫将被固定于琼脂糖中，便于观察。
    9. 将含有麻醉线虫的载玻片置于合适的显微镜下，使用63X微分干涉差（Nomarski）光学系统进行观察。根据以下特征分类口器形态：存在额外的亚腹齿、增大的背齿以及宽阔的口器开口，表明为广口型（eurystomatous）个体；而仅具单一背齿且口器开口较窄者，则为狭口型（stenostomatous）个体（图1）。
      注意：为保持线虫健康，其在琼脂糖垫上的停留时间不应超过5分钟。
    10. 完成口器形态鉴定后，根据需要回收广口型或狭口型线虫：轻轻滑动移除盖玻片，用挑针小心从琼脂糖垫上挑取目标个体（可在挑针上沾取少量 E. coli OP50 以增加黏附性），转移至新鲜NGM平板上。待线虫从麻醉状态恢复，出现正常运动行为后，即可用于后续捕食实验。
  2. 快速口器表型鉴定
    注意：随着经验积累，也可无需麻醉处理，直接通过高倍体视显微镜（150X）进行口器形态鉴定。
    1. 将线虫置于含有 E. coli OP50 菌苔的标准NGM平板上，并将平板放置于显微镜观察区域。
    2. 观察口器大小与宽度的差异。注意：在此放大倍数下无法观察到齿状结构，因此口器形态的判断仅依据口器开口的宽窄程度。

2. 咬合实验

注意：叮咬实验可实现对捕食行为的详细分析。

  1. 在标准NGM平板（6 cm）上培养并维持线虫种群，并以细菌菌苔作为食物来源 E. coli OP50 19.
  2. 通过培养大量选定的猎物线虫幼虫来制备检测用平板，例如 秀丽隐杆线虫 或选择具有适当生态相关性的猎物。注意：成虫 秀丽隐杆线虫 体型过大，不适合作为猎物，因此使用幼虫阶段非常重要。
    1. 维持 秀丽隐杆线虫 或在标准NGM平板上以细菌菌苔为食的其他潜在猎物物种 大肠杆菌 OP50，直至种群处于新鲜饥饿状态，从而获得大量年轻的L1幼虫。
      注意：饥饿处理的时间取决于多种环境和实验因素，包括用于起始培养的线虫数量、培养基中食物的量 E. coliOP50 添加量及环境温度。
  3. 用M9缓冲液洗涤四块或更多块新鲜饥饿的猎物平板，将线虫溶液通过两个20 µm滤器过滤，以去除所有大型动物和任何残留的卵，然后收集至15 ml离心管中。溶液中应仅剩下小型幼虫。
  4. 形成幼虫沉淀物：将过滤后的猎物在377 x g离心1分钟。
  5. 将3 µl纯线虫沉淀液转移至不含任何物质的6 cm NGM平板上 E. coliOP50 存在并静置至少 30 分钟，使幼虫充分扩散以制备检测平板。
    注意：标准检测平板上每3 µl纯线虫沉淀物包含 > 3,000只猎物幼虫。这足以使捕食者与猎物之间频繁接触。
  6. 筛选具有目标口器形态的捕食性线虫（方案1）。
  7. 使用标准的线虫挑取技术及体视显微镜 19将正确分类的捕食者转移至检测培养板中。转移捕食者时，应尽量减少随其转移的OP50细菌量，以最大限度降低细菌污染。转移后静置15分钟，使线虫恢复因转移操作所致的应激状态，并检查其是否表现出野生型运动行为，以确认线虫未在转移过程中受损。
    注意：无需进行饥饿处理 P. pacificus因为它们即使在以细菌为食且营养充足的情况下，仍能高效捕食其他线虫的幼虫。
  8. 恢复后，使用体视显微镜观察捕食者10分钟。利用该设备观察并记录不同的摄食事件，例如 叮咬，其特征是捕食者限制猎物的移动； 杀伤，通过检测猎物外骨骼的开口；以及 喂养，根据可观察到的猎物内脏被消耗情况进行分类（图2A, B 和 视频 1).
  9. 重复实验，筛选并观察至少10条独立的捕食性线虫，以确保准确性。

3. 尸体检测

注意：尸体检测有助于更快速地量化捕食行为。

  1. 在标准 NGM 平板上培养并维持线虫种群，并以 E. coli OP50 菌苔作为食物来源19。制备前述检测平板的三个重复样本（见方案 2.1 - 2.5）。
  2. 根据方案 1 所述方法筛选具有目标口器形态的捕食性线虫。采用标准的线虫挑取技术，在体视显微镜下将 5 条具有目标口器形态的捕食性线虫转移至每个检测平板中。让捕食者与猎物共同孵育 2 小时。
  3. 孵育 2 小时后，检查检测平板上是否存在空壳虫体（图 2B 和 C）。通过观察虫体是否丧失运动能力，并结合明显的形态学缺陷（如内脏外泄或虫体片段缺失）来确认空壳虫体的存在。

4. 咽部和牙齿运动的分析

  1. 在标准NGM平板上培养并维持线虫种群，并以细菌菌苔作为食物来源 E. coli OP50 19按照前述方法制备检测平板（方案 2.1 - 2.5）。若标准的 6 cm NGM 平板无法置于物镜与显微镜载物台之间，可使用盛有 2 ml NGM 的小型 35 mm 培养皿盖作为合适的替代方案。
  2. 根据方案1所述，筛选具有所需口器形态的捕食性线虫。使用标准的线虫挑取技术，在体视显微镜下将一只分类正确的捕食性线虫转移至检测平板中。静置15分钟，使线虫从转移操作造成的应激状态中恢复。
  3. 在显微镜下以40 - 63倍诺马尔斯基（Normaski）物镜观察捕食性动物，并使用高速相机记录视频 2 和 3记录至少20只动物在50 Hz条件下的咽泵运动和齿状结构运动，持续15秒，以确保定量准确。以所需速度回放录制的视频，用于计数单个咽泵和齿状结构运动事件。
    注意：泵动现象出现在位于咽部中段的咽球部，而齿的运动仅可在口部开口处观察到，且只能从背侧齿观察到。

结果

在成功鉴定出P. pacificus的合适口器形态后，可明显观察到广口型与狭口型个体之间的差异（图3），仅广口型个体会表现出捕食性杀戮行为，而在狭口型个体中，该行为似乎完全被抑制。此外，广口型个体在取食细菌与猎物时的牙齿活动及咽部泵动也存在明显差异（图4以及视频2和视频3）。在捕食性取食过程中，其咽部泵动速率低于取食细菌时的速率，且牙齿运动与咽部泵动呈一对一的对应关系。这可能表明存在关键的调控机制，用于调节对不同食物类型的摄食行为响应。

线虫形态学比较，显微镜图像，广口型与狭口型形态。
图1. P. pacificus具有影响摄食行为的口器二态性。（A） 广口型口器具有捕食能力，口部开口较宽，背侧牙齿呈大型爪状（假色为红色）；（B） 具有较大的相对钩状腹侧下牙（假色为蓝色）。（C） 狭口型口器仅能以细菌为食，口部开口较窄，背侧牙齿呈燧石状（假色为红色）；（D） 无腹侧下牙（*）。Nomarski图像放大倍数为63倍，比例尺为10 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

线虫的显微镜图像；各图显示形态与分布；生物学研究结果。
图2. 捕食实验。 (A) P. pacificus 咬食并杀死其他线虫（如 C. elegans）的幼虫。(B) 在咬食实验中，可通过体视光学显微镜观察捕食者（*）的咬食次数，并记录成功杀死及摄食事件。尸体也清晰可见（圆圈所示）。(C) 在尸体检测实验中，幼虫尸体（箭头所示）可轻易与活体幼虫区分。B图中的比例尺为1 mm，C图中的比例尺为150 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

比较广口型和狭口型取食行为及尸体的柱状图；统计数据可视化。
图3. 对C. elegans猎物进行取食行为和尸体检测的结果。（A） 取食行为仅在广口型口器形态中明显，狭口型个体未表现出该行为。误差线表示10次重复实验的标准差。（B） 与狭口型个体无取食行为一致，尸体检测也仅在广口型个体的检测平板上发现尸体。误差线表示5次重复实验的标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。

摄食泵速率与饮食柱状图；细菌摄食与捕食过程中的咽泵与齿部运动。
图4. 宽口型个体在捕食性摄食期间的咽泵速率与齿部运动。 仅当宽口型个体进行捕食性摄食时，才可观测到齿部运动。此现象同时伴随咽泵频率的降低。误差线表示10次重复实验的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

Caenorhabditis elegans，显微镜图像展示线虫研究，模式生物研究。
视频 1. 使用体视显微镜观察咬合实验中的杀伤行为。（右键单击可下载）。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）的显微镜图像，显示用于遗传学研究分析的精细结构。
视频 2. 高速摄像机拍摄的视频 P. pacificus 杀灭 秀丽隐杆线虫 幼虫。 （右键单击以下载）。

显微镜下的根尖、细胞结构、生长分析、植物生物学、显微图像。
视频 3. 捕食过程中牙齿运动的高速摄像放大画面。（右键单击可下载）。

讨论

线虫为研究神经生物学和行为提供了强大的体系，其中秀丽隐杆线虫（C. elegans）至今仍是主要的研究工具。然而，包括P. pacificus在内的许多其他线虫物种表现出一些在模式生物C. elegans中缺失或复杂程度不同的行为，从而引发了关于这些行为进化与调控机制的有趣问题。在包括P. pacificus在内的多种线虫物种中存在的一种额外行为，是能够通过捕食性取食来补充其细菌性食谱1, 20。因此，我们开发并描述了一种详细的实验方案，用于快速、简便地表征线虫中此前尚未分析的这类捕食行为。

首先，我们提供了用于筛选线虫口器结构变异的方法。正确识别口器类型是成功开展捕食实验的关键第一步，因为至少在该属内 Pristionchus 只有宽口型动物才具备捕食性摄食能力。最好通过以下方式鉴定口型形态 "快速口腔表型分析" 参照第1.2步中的方案，因为该方法侵入性更小，因此更不易干扰捕食行为。然而，建议首先通过在琼脂垫上使用麻醉动物进行鉴定，以熟悉不同的口器结构（第1.1步方案）。

在确定目标口器形态后，我们描述了两种用于量化捕食性摄食行为的检测方法。一种是快速、高通量的"尸体检测"（方案3），另一种则更为耗时但能进行更深入的行为分析，即"咬食检测"（方案2）。这两种方案均具有高度灵活性，可根据实验需求进行多种调整以优化检测效果。在利用P. pacificus作为捕食者、C. elegans作为猎物的咬食检测中，观察10分钟时间窗口内的捕食行为相互作用，足以量化显著数量的咬食事件及其他摄食行为。在同样以P. pacificus为捕食者、C. elegans为猎物的"尸体检测"中，5只捕食者作用2小时即可产生易于量化且结果一致的尸体数量，从而实现快速行为分析。然而需要注意的是，不同种类的捕食性线虫移动速度不同，摄食速率各异，且在其他行为方面也表现出广泛的多样性1。此外，由于类似原因，不同猎物物种也可能被以不同的速率摄食。因此，建议根据所测试的捕食者和猎物线虫物种，以及环境条件的任何差异，对检测方法进行优化。在进行"咬食"和"尸体"检测时，确保捕食者和猎物均处于健康状态至关重要，因为处于应激或受伤状态的捕食者捕食能力会显著下降。此外，使用新鲜的检测平板也十分关键，因为陈旧的平板可能变干，从而对线虫健康产生不利影响，导致检测结果出现偏差。未来有望通过技术进步，进一步改进这些捕食性检测方法，实现大部分分析过程的自动化，正如已在C. elegans多种行为研究中实现的那样21, 22。目前，在P. pacificus等线虫中开展此类自动化分析可能面临挑战，因其对接触刺激更为敏感，导致在微流控装置中进行分离和固定时很可能抑制其捕食行为。克服这一难题虽具挑战性，但一旦实现，将有助于对单个线虫进行更细微捕食行为的筛选分析。

最后，我们还提供了用于研究线虫摄食器官本身的方法，通过高速摄像机定量分析牙齿活动和咽部泵动动力学，从而促进捕食性与细菌摄食模式之间的比较（方案4）。多年来，人们一直通过定量C. elegans的咽部泵动频率来监测其摄食行为23，然而C. elegans不存在任何形式的口部齿状结构，也不具备捕食行为。通过将咽部泵动的定量分析与牙齿活动相结合，还可以观察到特异性支配捕食行为的牙齿神经支配情况。由于观察牙齿运动需要较高的放大倍数，动物常常移出焦平面，因此通常只能在较短的时间窗口内观察到牙齿活动。此外，与C. elegans不同，P. pacificus的咽部并非持续泵动，而是间歇性地进行泵动和摄食。因此，为了准确测定摄食过程中的咽部泵动速率，记录连续15秒的摄食过程至关重要。

因此，本文所介绍的方法为研究线虫系统中的捕食行为提供了首个研究框架. 此外，这些方法还可适用于研究线虫生态系统中其他相互作用，包括微生物、真菌和螨类等其他生态学相关生物对捕食行为的影响。因此，它们为解析此类捕食行为的调控机制、演化过程及其生态学意义提供了有效手段。

披露

作者声明不存在财务或竞争利益。

致谢

感谢 Daniel Bumbarger 博士提供捕食行为图片。本工作由马克斯-普朗克学会资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
尼龙网滤器（20 µm）Merck Millipore LtdNY2004700用于过滤刚离开幼虫阶段、用作猎物的线虫。
聚丙烯滤器漏斗（54 mm）Duran292215003用于过滤刚离开幼虫阶段、用作猎物的线虫。
小型培养皿（35/10 mm）Greiner Bio-One 627102用于高速摄像成像
Zeiss SteREO Discovery V12用于口器形态鉴定
Axio-Imager A1用于口器形态鉴定
载玻片RothH869
盖玻片Roth657
Motion Scope M3 高速相机IDT高速相机
视频变焦镜头 44 ENG 1/2" 0.5X 至 2.4XZeis452984-0000-000高速相机变焦镜头
线虫生长培养基（NGM）成分：
琼脂Roth5210.2CAS号 9002-18-0
氯化钠（NaCl）Roth3957CAS号 7647-14-5
胰蛋白胨（Bacto Tryptone）BD211699批号 4316614
二水合氯化钙（CaCl2)Sigma-AldrichC3306CAS号 10035-04-8
羊毛脂胆固醇（Cholesterol from lanolin）Sigma-AldrichF 26732 00050CAS号 57-88-5
七水合硫酸镁（MgSO4)Merck1,058,861,000CAS号 10034-99-8
磷酸二氢钾（KH2PO4)ACROS organics271080025CAS号 7778-77-0
6 cm 培养皿Greiner Bio-One628102
3.5 cm 培养皿Greiner Bio-One627102
M9 培养基成分：
磷酸二氢钾（KH2PO4)ACROS organics271080025CAS号 7778-77-0
七水合磷酸氢二钠（NaHPO4)Sigma-AldrichS9390-500G-DCAS号 7782-85-6
氯化钠（NaCl）Roth3957CAS号 7647-14-5

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