斑马鱼胚胎内源性受体的亲和标记检测

摘要

本文介绍了一种检测斑马鱼胚胎中低丰度内源性受体的新技术。我们将其命名为AFLIP，因为它由配体介导的受体亲和标记与免疫沉淀相结合组成。

摘要

通过结合Affinity Labeling（亲和标记）与Immunoprecipitation（免疫沉淀）技术（简称AFLIP），已建立一种用于检测斑马鱼胚胎中低丰度受体的方法。该技术结合了配体对特定受体进行亲和标记所具有的选择性和灵敏度，以及免疫沉淀的特异性。我们已利用AFLIP技术在斑马鱼早期发育过程中检测III型TGF-β受体（TGFBR3），即betaglycan。AFLIP在验证TGFBR3形态发生素抑制斑马鱼表型的有效性方面发挥了关键作用。该方法的第一步是制备胚胎蛋白提取物，并用于生成¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3复合物，随后通过免疫沉淀进行纯化。随后，这些复合物通过共价交联，并利用SDS-PAGE分离结合放射自显影技术进行检测。该技术要求具备针对目标受体的标记配体以及特异性抗体，且可轻松适用于鉴定任何满足上述条件的生长因子或细胞因子受体。

引言

在胚胎发育过程中，需要对蛋白质的特异性检测来验证通过RT-PCR或其对应mRNA测量所获得的表达谱 原位 杂交（ISH）。这通常通过胚胎提取物的蛋白质印迹（western blot）结合特异性抗体检测来实现。然而，该方法难以应用于丰度极低的蛋白质，或在印迹过程中因自身性质导致定量转移困难的蛋白质。β糖蛋白聚糖（betaglycan），也称为III型转化生长因子β（TGF-β）受体（TGFBR3），便是此类难题的一个典型例子。TGFBR3是一种兼性膜结合蛋白聚糖，可通过其核心蛋白结合TGF-β¹，对TGF-β2亚型具有明显更高的亲和力，这一特性使其区别于其他任何TGF-β结合蛋白²斑马鱼中的 TGFBR3 从 8 hpf 开始表达，至 72 hpf 时达到峰值，通过 RT-PCR 检测其 mRNA 得到证实³.

然而，尽管存在一种特异性非常高的抗体³，但所有尝试通过蛋白质印迹法检测其翻译产物的努力均未成功。考虑到TGFBR3具有蛋白聚糖的性质，以及其可能丰度较低，这些因素可能正是导致检测失败的原因，因此设计了一种名为AFLIP的检测方法，该方法利用TGFBR3对TGF-β2具有高亲和力的特性。在此方法中，将来自混合胚胎的蛋白质提取物与¹²⁵I标记的TGF-β2进行特异性结合，然后通过免疫沉淀纯化受体-配体复合物，并在SDS-PAGE分离前进行交联。通过凝胶放射自显影观察到的迁移模式揭示了标记受体种类的存在及其性质。该方法结合了亲和标记的配体特异性与特异性抗体的免疫沉淀，提高了检测范围，并避免了TGFBR3在转印过程中的效率低下问题。由于其固有特性，AFLIP检测法并非定量检测方法，但可用于可靠地评估所分析受体在不同实验条件下的相对差异。

方案

所有在动物中进行的实验均经墨西哥国立自治大学（UNAM）实验动物护理与使用委员会批准，批准编号为CICUAL-协议号：FLC40-14。（CICUAL："墨西哥国立自治大学细胞生理研究所实验动物护理与使用机构委员会"）。

1. 胚胎蛋白提取物的制备

1. 在目标发育阶段（例如受精后72小时，hpf），为每种待比较的实验条件（如形态发生素干扰组 vs. 野生型）收集100–200枚胚胎。
2. 将胚胎置于含有鱼水的培养皿中（见表1），使用尖头镊子手动去除胚胎的绒毛膜。此步骤中避免使用蛋白酶K（或本方案中任何其他蛋白酶），以免降解目标受体。
3. 将胚胎转移至1.5 ml微量离心管中，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗胚胎两次（见表1）。
4. 加入500 µl去卵黄缓冲液（见表1）。
5. 通过在溶液中轻柔地上下吹打（约30–40次）释放大部分卵黄。对于72 hpf和48 hpf的胚胎，分别使用蓝色和黄色枪头。黄色枪头可能需要略微剪切尖端，以避免破坏胚胎。可通过显微镜观察判断卵黄是否成功释放。
6. 以600 × g离心15秒，收集胚胎。
7. 使用移液器小心弃去上清液。
8. 加入500 µl洗涤缓冲液（见表1），在最低转速下轻轻涡旋，清洗胚胎两次。
9. 以600 × g离心15秒，收集胚胎。
10. 从此步骤开始，后续操作均在4 °C下进行。
11. 使用移液器小心弃去上清液。
12. 将胚胎重悬于350 µl裂解缓冲液中（见表1），并用塑料研磨棒充分匀浆。
13. 将裂解后的胚胎在4 °C下置于试管摇床上振荡孵育30分钟。
14. 以11,000 × g离心15分钟，以去除不溶性碎片。
15. 用移液器将澄清的上清液转移至新的离心管中。
16. 采用Bradford蛋白定量法⁴或其他合适方法测定总蛋白浓度。若使用Bradford法，应在裂解缓冲液中所含去垢剂的等效浓度条件下绘制标准曲线，因为这些去垢剂会导致蛋白标准品浓度被低估⁴。

2. 内源性受体蛋白的检测

1. 亲和标记与免疫沉淀（所有步骤均在 4 ^oC 下进行）
   1. 取 400 - 500 µg 总胚胎蛋白置于 1.5 ml 微量离心管中，用缓冲液 1 稀释至 1 µg/µl（见表 1）。
      注意：为获得 500 µg 总胚胎蛋白，通常需初始处理约 100 - 200 个胚胎。72 hpf 胚胎通常可获得约 5 µg 总胚胎蛋白，足以用于检测 betaglycan。
   2. 加入适量标记的 TGF-β2 储液，使其终浓度达到 150 pM，在 4 °C 下于试管摇床中振荡孵育 2 小时。在开始 AFLIP 实验前，必须采用氯胺 T 法按照 Cheifetz et al.⁵ 所述方法将 TGF-β2 用 ¹²⁵I 标记。
      注意：操作 ¹²⁵I 标记配体时应使用屏蔽装置以尽量减少辐射暴露。
   3. 加入适量未稀释的针对目标受体的一抗，使其终稀释比例为 1:100，并在 4 °C 下继续孵育 2 小时（也可过夜）。本研究中使用的抗血清 #31 的最佳稀释比例为 1:100，该抗血清已在其他文献中描述³，但根据抗体质量不同，最佳稀释比例可能更高或更低。
   4. 加入 50 µl 适合的免疫球蛋白结合微珠（例如 G 蛋白 Sepharose，此前已在 TNTE 缓冲液中平衡，并以 TNTE 重悬至原体积的 1/5），在 4 °C 下于试管摇床中振荡孵育 50 分钟。
   5. 在 11,000 × g 条件下微量离心 20 秒，回收微珠。
   6. 将上清液弃入合适的放射性废物容器中。
   7. 用 1 ml IP 洗涤缓冲液（见表 1）洗涤免疫沉淀微珠三次，每次通过涡旋混匀并在 11,000 × g 条件下微量离心 20 秒。
   8. 将免疫沉淀微珠重悬于 250 µl IP 洗涤缓冲液中。
   9. 加入 1.5 µl 二琥珀酰亚胺基丙二酸酯（DSS，溶于 DMSO，浓度为 10 mg/ml）。DSS 溶液应在使用前新鲜配制。
   10. 在 4 °C 下振荡孵育 15 分钟。
   11. 为终止交联反应，加入 500 µl IP 洗涤缓冲液，并补充足够量的 Tris-Cl pH 7.4 储液，使终浓度达到 25 mM Tris-Cl。Tris 中的游离氨基可捕获未反应的 DSS。
   12. 在 11,000 × g 条件下离心 20 秒，收集免疫沉淀微珠，弃去上清液。
   13. 将免疫沉淀微珠重悬于 30 µl 还原型 Laemmli 缓冲液中。
   14. 在 94 °C 下煮沸样品 5 分钟。
   15. 可选：按照仪器制造商的操作说明，使用γ计数器分析样品。
2. 样品分析
   1. 将样品进行变性 SDS-PAGE 电泳。根据受体分子量选择合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，并按标准程序进行电泳。
   2. 将凝胶在固定液（见表 1）中室温浸泡 30 分钟。
   3. 用蒸馏水洗涤凝胶 15 分钟。
   4. 将凝胶夹在预先润湿的滤纸之间，并用保鲜膜包裹。
   5. 在 80 °C 下干燥 1 小时。
   6. 将凝胶在室温下置于白色磷光成像屏上过夜曝光。
   7. 按照仪器制造商的操作说明，使用磷光成像仪扫描曝光后的成像屏。

结果

图1展示了使用AFLIP获得的代表性结果。第1泳道中的信号来自与斑马鱼betaglycan核心蛋白（BG核心，位于150 kDa标记下方）共价连接的¹²⁵I标记配体，或来自通过连接糖胺聚糖（GAG）而加工成蛋白聚糖形式的BG核心（GAG，弥散条带从170 kDa延伸至凝胶顶部）。这种迁移模式——清晰的核心蛋白条带加上弥散的蛋白聚糖条带（由GAG链长度异质性所致）——是TGFBR3²的典型特征。由于DSS不能将每一个形成的配体-受体复合物都共价交联，因此在凝胶迁移前沿处可见游离的¹²⁵I标记配体（¹²⁵I-TGF-β2）。该游离配体原本与受体结合，并在免疫沉淀过程中保持结合状态，但由于未被共价固定，因此在SDS-PAGE过程中解离。尽管如此，其信号强度仍与标记受体所产生的信号强度相关。这一点可通过比较第2和第3泳道看出。在48 hpf时，斑马鱼胚胎中的BG含量低于72 hpf胚胎³，这体现在GAG和BG核心位置的信号较弱，相应地，凝...

讨论

利用针对目标蛋白的特异性抗体进行蛋白质印迹（Western blot）是研究其在胚胎发育过程中表达情况的一种重要工具⁷。然而，由于高度糖基化蛋白在转膜过程中效率低下，且与硝酸纤维素膜或PVDF膜的结合能力较弱，因此对其开展免疫印迹的实验效果一直不理想^8,9。

蛋白聚糖是这一缺陷的典型例子，因其共价连接的带负电荷的糖胺聚糖链（GAG）难以有效结合聚苯乙烯表面或疏水性印迹膜。此外，GAG链存在分子大小的异质性 "扩散" 蛋白质在凝胶的某一区域富集，从而有效降低其在印迹膜单位面积上的含量。此外，若目标蛋白表达水平较低，通过常规 Western 印迹检测将十分困难。III 型转化生长因子 β 受体（TGFBR3）或 β-聚糖（BG），是一种在哺乳动物中具有两个糖胺聚糖（GAG）结合位点的膜受体¹ 以及斑马鱼中的一个³，具备所有这些特性。尽管如此，已有研究设计出克服这些障碍的方案，例如采用亲和素-生物素复合物（ABC）系统进行检测^10,11 或对带正电荷膜上蛋白聚糖的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二琥珀酰亚胺基辛二酸酯（DSS）	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
曝光暗盒（Exposure Cassette）	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea 海水混合物	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix