用于定量分析的均一化MALDI样品制备

摘要

本文演示了一种通过在样品干燥过程中调控基底温度来降低MALDI质谱中离子信号空间异质性的实验方案。

摘要

本方案展示了一种简单的样品制备方法，可在基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱分析过程中减少离子信号的空间异质性。离子信号的异质性是MALDI技术中的一个严重问题，会导致数据重复性差，并使MALDI不适用于定量分析。通过在样品制备过程中调控样品靶板的温度，可利用样品溶液液滴内部由热效应诱导产生的流体动力学流动，从而缓解异质性问题。该方法采用一个配备有温度可控铜基底块的室温样品制备腔室，该基底块用于承载MALDI样品靶板，从而实现对样品干燥条件的精确控制。在样品液滴完全干燥后，将样品靶板温度恢复至室温，并从腔室中取出，用于后续质谱分析。利用MALDI成像质谱技术检测样品区域，以获得样品中所有组分的空间分布情况。与在无温度控制的环境条件下进行制备的传统干液滴法相比，本方案所制备的样品表现出显著更优的空间分布均匀性和信号强度。根据对碳水化合物和肽类样品的观察结果，在干燥过程中降低基底温度的同时保持周围环境处于室温，可有效减少离子信号的异质性。该方法可广泛适用于多种样品与基质的组合。

引言

质谱法（MS）是分析复杂样品分子组成最重要的分析技术之一。在质谱所使用的各种电离方法中，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）是生物分析应用中最灵敏且使用最广泛的方法¹。与其他电离技术相比，MALDI 具有最高的灵敏度以及对盐类污染物的高度耐受性。这些分析特性使其成为碳水化合物分析和许多蛋白质组学应用的首选方法。然而，样品制备是获得高质量 MALDI-MS 数据的关键步骤。

基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）中最常用的样品制备方法是干燥液滴法，该方法将样品液滴沉积在表面，并在常温条件下自然干燥。这种干燥方法操作简单且通常有效。^2-5 然而，干燥液滴法存在一个常见问题，即生成的分析物/基质晶体通常分布不均。在许多情况下，晶体聚集在样品区域的边缘，形成所谓的“环状沉积”现象。^6-8 晶体形貌的不均一性会影响分析物分子在空间上的分布，导致样品区域内离子信号出现显著波动。这种强烈的信号波动和较差的数据重复性，在MALDI-MS中被称为“热点”问题。⁹ 因此，迫切需要减少MALDI-MS干燥液滴法应用中的空间异质性。

在采用干燥液滴法制备样品时，样品液滴中的流体动力学流动对样品的空间分布具有重要影响。^10-12 研究发现，溶剂蒸发会引发液滴内部向外的毛细流动，从而导致环状沉积的形成。^7,10 ....

方案

注意：本方案旨在降低采用干燥液滴法制备的麦芽三糖和缓激肽片段（1-7）的空间异质性。该方案包括三个主要步骤：样品制备与预处理、样品点样与干燥、质谱数据分析。具体操作流程如下所述：

1. 准备与预处理

1. 清洗样品板
   1. 佩戴腈手套，用洗涤剂和去离子蒸馏水（DDW）轻轻清洗样品板。
   2. 用甲醇（MeOH）和去离子蒸馏水（DDW）冲洗样品板。
   3. 将样品板放入600 ml烧杯中，并加入去离子蒸馏水（DDW）至充满。
   4. 在超声波清洗仪（200 W，40 kHz）中用去离子蒸馏水（DDW）超声处理样品板15分钟。
   5. 倒掉烧杯中的去离子蒸馏水（DDW），并加入甲醇（MeOH）至充满。
   6. 在超声波清洗仪（200 W，40 kHz）中用甲醇（MeOH）超声处理样品板15分钟。
   7. 用氮气吹去样品板表面的溶剂液滴，并在点样前保持样品板干燥。
2. 调节干燥室温度
   注：干燥室为一个35 × 20 × 45 cm³（宽 × 深 × 高）的丙烯酸材质腔室。图1展示了该干燥系统的示意图。通过气体流量计以恒定流速通入室温氮气，对腔室进行吹扫，以维持低相对湿度环境，相对湿度由安装在干燥室内部的校准湿度计监测。干燥室内设有一个铜质底座块，连接程序控温的循环水浴，用于放置不锈钢样品板。该....

结果

使用5 °C和25 °C样品台温度制备的麦芽三糖和缓激肽片段（1-7）的明场图像及其质谱图像如图1所示。对于钠加合的麦芽三糖，当样品在25 °C样品台温度下制备时，离子信号主要集中于样品区域的边缘；而将样品台温度降至5 °C时，信号在整个样品区域内均匀分布。在5 °C条件下制备样品的唯一明显缺点是，相比25 °C条件下制备的样品，出现的裂纹更多。质子化缓激肽片段（1-7）的离子图像表现出与钠加合麦芽三糖相似的趋势。成像质谱结果表明，在较低样品台温度下制备样品可显著重新分布分子并降低异质性。

根据实验结果，统计分析表明，在样品靶温度为 5 °C 时获得的离子信号异质性相较于 25 °C 时降低了 60–80%。图 3展示了在样品靶温度分别为 5 °C 和 25 °C 条件下，麦芽三糖和缓激肽片段（1-7）的统计分析结果。对于每个样品，平均强度均已归一化。以钠加合形式的麦芽三糖为例，在样品.......

讨论

根据先前的理论预测，液滴内部由温度引起的流体动力学流动可以克服由溶剂蒸发引起的向外毛细流动。当液滴内部的温度梯度增大时，分子内部再循环的效率会得到增强。根据预测结果，当保持样品板温度低于 5 °C 而周围环境维持在室温时，液滴内部再循环流动的平均速度约为向外毛细流动的 4 倍。如果样品板温度与周围环境相同，则再循环流动的平均速度比向外毛细流动慢 1,800 倍。该计算结果表明，在样品制备过程中降低样品板温度是有利的。实验观察结果与这一预测一致。

在整个样品制备过程中，应精确控制样品板的温度。表1展示了在不同样品板温度下，0.1 µl 样品的典型液滴干燥时间。在将样品溶液滴加到样品板之前，必须确保样品板表面干燥。当在低温条件下制备样品时，若出现水汽凝结，则不建议进行样品溶液的点样，因为冷凝水会扩大样品区域并稀释溶液。因此，必须将干燥室内的相对湿度保持在25%以下。此外，在低温条件下制备样品时，应先将样品板在取出干燥室前升温至室温。尽管样品结晶完成后出现少量水汽凝结不会改变样品颗粒的状态，但仍应避免明显的冷凝现象。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
洗涤剂粉末	Alconox	242985
甲醇	Merck	106009
乙腈	Merck	100003
2,4,6-三羟基苯乙酮（THAP）	Sigma-Aldrich	T64602
缓激肽片段（1-7）	Sigma-Aldrich	B1651
麦芽三糖	Sigma-Aldrich	47884
移液器吸头	Mettler Toledo	17005091
微量离心管	Axygen	MCT-150-C
设备
Milli-Q 超纯水净化系统	Millipore	ZMQS6VFT1
无粉腈类手套	Microflex	SU-690
600 ml 烧杯	Duran	2110648
超声波清洗器	Delta	DC300H
湿度计	Wisewind	5330
氮气流量计	Dwyer	RMA-6-SSV
K型热电偶	Digitron	311-1670
离心机	Select BioProducts	Force Mini
移液器	Rainin	pipet-lite XLS
体视显微镜	Olympus	SZX16
温控干燥室	this lab
同步双极性飞行时间成像质谱仪（DP-TOF IMS）	this lab
MALDI-TOF 不锈钢样品靶板	this lab