在当前资源匮乏的背景下，新兴技术使研究人员能够以更低的成本、更快的速度和更高的精确度开展研究。本文介绍了基于微球的唾液抗体多重免疫分析方法的建立，用于同时检测人体对多种环境病原体的暴露情况。
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本文内容
摘要
摘要
人类暴露于环境病原体的病因及其影响已在全球范围内引起广泛关注，因此，采用经济高效、高通量的方法来评估暴露和感染状况显得至关重要。本文描述了一种基于微球的多重免疫分析方法的开发与分析过程，该方法能够同时检测人唾液中针对多种病原体的抗体。唾液在本应用中具有显著优势，因其具有非侵入性，且采集比血清更简便、成本更低。环境病原体的抗原被偶联至羧化微球（微球）上，并用于基于微球的液相分析法，以检测极小体积人唾液样本中的抗体。微球偶联的抗原来自空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、诺如病毒（G I.1 和 G II.4）以及甲型肝炎病毒。 空肠弯曲菌、幽门螺杆菌、刚地弓形虫 诺如病毒（G I.1 和 G II.4）以及甲型肝炎病毒。为确保抗原充分偶联至微球，采用物种特异性的动物来源的一抗捕获抗体进行偶联验证，随后孵育生物素标记的抗物种二抗检测抗体和链霉亲和素-R-藻红蛋白报告分子（SAPE）。为检测非特异性结合，设一组微球与其他微球处理方式相同，但未偶联任何抗原作为对照。将偶联抗原的微球与对照微球分别与前瞻性采集的人类唾液样本孵育，通过基于流式细胞术原理的高通量分析仪检测，以中位荧光强度（MFI）单位测定针对每种抗原的抗体存在情况。该多重免疫分析方法具有多项优势，包括用更少样本获得更多信息、降低成本和人力需求，以及可根据需要灵活定制多种检测靶标。结果表明，唾液多重免疫分析可能具备识别既往暴露和感染的能力，在涉及大规模人群的监测研究中尤为有用。
引言
全球88%的腹泻相关疾病与人类接触受污染的水、不安全的食物以及不良的卫生条件有关，每年导致约150万人死亡，其中大多数为儿童1。这已成为公共卫生官员和政策制定者高度关注的问题。为了研究与水源性及其他环境病原体相关的暴露和疾病情况，我们开发了一种多重免疫检测方法，用于检测人体样本中的抗体2-4。该方法可应用于流行病学研究，以确定人类对这些病原体的暴露情况，并更准确地界定免疫流行率和新发感染。
唾液在人类生物标志物研究中作为血清的替代样本具有广阔前景。使用唾液的优势包括采样无创、简便，成本低，且易于从儿童群体中采集样本5-7。已有大量研究针对血清和唾液样本中的多种病原体抗体展开，包括H. pylori2,3,8、Plasmodium falciparum9、Entamoeba histolytica10、Cryptosporidium parvum3,11、Streptococcus pneumoniae12、甲型和丙型肝炎病毒13-14、noroviruses2-4,15、T. gondii2-4、登革病毒16、人类免疫缺陷病毒（HIV）17以及Escherichia coli O157:H718。
多重免疫分析技术可在单一样本体积内，通过单次循环或运行同时检测多种分析物。来自多重化抗原的 C. jejuni, 刚地弓形虫，幽门螺杆菌 甲型肝炎病毒以及两种诺如病毒用于检测人唾液中的IgG2-4 和 IgA3,4 和血浆IgG2,3 使用基于微球的多重免疫分析法检测对这些病原体的抗体反应。当该方法与针对水、土壤和食物中微生物暴露的流行病学研究结合使用时，本研究所描述的检测方法可提供有价值的信息，有助于加深对环境病原体所致感染的理解。此外，此类研究获得的唾液抗体数据可用于改进风险评估模型。19-22.
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方案
本研究获得了北卡罗来纳大学教堂山分校机构审查委员会（IRB # 08-1844，美国北卡罗来纳州教堂山）的批准，用于在波多黎各博凯龙海滩采集游泳者的刺激性龈沟唾液样本，作为美国环境保护署（USEPA）国家娱乐用水流行病学与环境评估（NEEAR）水研究23的一部分，以评估与游泳相关的暴露和疾病情况。研究对象均签署了知情同意书，并由经过培训的USEPA合同人员指导其使用唾液采集装置。唾液样本在冰上运输，收到后按照文献4所述方法进行离心处理，并储存在 -80 °C 环境中。
1. 微球活化
- 通过涡旋振荡和超声处理20秒重悬 bead 储存液，并将约5.0 × 106个储存 beads（400 µl）转移至微量离心管中。
注意：beads 的供应浓度为12.5 × 106 beads/ml。 - 在10,000 × g 条件下离心2分钟，使储存 beads 沉淀。
- 弃去上清液，加入100 µl 去离子水（dH2O），通过涡旋振荡和超声处理20秒重悬沉淀的 beads。重复步骤1.2。
- 弃去上清液，加入80 µl 100 mM 磷酸二氢钠溶液（pH 6.2），通过涡旋振荡和超声处理20秒重悬洗涤后的 beads。
- 使用前立即配制50 mg/ml 的 N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（Sulfo-NHS）溶液：将200 µl 去离子水（dH2O）加入10 mg Sulfo-NHS 分装物中，涡旋混匀。
- 向 beads 中加入10 µl 50 mg/ml Sulfo-NHS 溶液，涡旋混匀。
- 使用前立即配制50 mg/ml 的1-乙基-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液：将200 µl 去离子水（dH2O）加入10 mg EDC 分装物中，涡旋混匀。
- 向 beads 中加入10 µl 50 mg/ml EDC 溶液，涡旋混匀。室温避光孵育20分钟，每隔10分钟涡旋混匀一次。在10,000 × g 条件下微量离心2分钟，使活化的 beads 沉淀。
- 弃去上清液，加入250 µl 50 mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸（MES）缓冲液（pH 5.0），通过涡旋振荡和超声处理20秒重悬 beads。
- 在10,000 × g 条件下微量离心2分钟，使活化的 beads 沉淀。
- 重复步骤1.9和1.10。
注意：此步骤共进行两次50 mM MES 缓冲液（pH 5.0）洗涤。 - 加入100 µl 50 mM MES 缓冲液（pH 5.0），通过涡旋振荡和超声处理20秒重悬 beads。
2. 微球偶联
- 使用表1中所示的浓度将抗原偶联至微球组。
- 将每种抗原加入活化的微球中，并用50 mM MES缓冲液（pH 5.0）定容至总体积500 µl。通过涡旋混合抗原与微球。
- 室温避光条件下，以旋转方式（约15 rpm）孵育抗原与微球2小时，并持续混匀。在10,000 × g条件下微量离心2分钟，使偶联后的微球沉淀。
- 弃去上清液，将微球重悬于500 µl磷酸盐缓冲盐水（PBS）-牛血清白蛋白（BSA）-聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯（Tween-20）-叠氮化钠（PBS-TBN）（pH 7.4）中，通过涡旋和超声处理进行分散。在10,000 × g条件下微量离心2分钟使微球沉淀，弃去上清液。
注意：叠氮化钠为急性毒性化学品，吞咽或皮肤接触可致死。避免吸入粉尘/烟雾/气体/雾滴/蒸气或喷雾。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE），并依照相关法规进行处置。 - 通过涡旋和超声处理20秒，将微球重悬于1 ml PBS-TBN中。
- 在10,000 × g条件下微量离心2分钟，使微球沉淀。
- 重复步骤2.5和2.6。
注：此过程共完成两次PBS-TBN洗涤。 - 将偶联并洗涤后的微球重悬于1 ml PBS、1% BSA、0.05% 叠氮化钠（pH 7.4）中。避光保存于2–8 °C冰箱中。
3. 微球计数
- 用水或PBS缓冲液将偶联微球稀释至1:10。
- 取10 µl稀释后的微球悬液，加入血细胞计数板的样品加载处。
- 计数其中一个4 x 4角区网格内的微球数量。使用以下公式计算偶联微球的总数：计数值（一个4 x 4角区网格）× (1 × 104) × 稀释倍数 × 重悬体积（ml）。
4. 抗原偶联的确认
- 通过涡旋振荡和超声处理20秒，重悬含有目标抗原偶联微球的储备混合液。
- 通过将偶联的微球储备液稀释至最终浓度为100个微球/μL，制备工作用微球混合液。µ每种独特微球集在 PBS-1% BSA 缓冲液（PBS-1% BSA，pH 7.4）中的体积。
- 根据制造商的建议，在96孔圆底板中使用PBS-1% BSA缓冲液配制至少7个两倍系列稀释的抗物种IgG一抗。
- 用100 μL缓冲液预润湿96孔滤板底部的独立8列（8行），每个抗原偶联确认实验各一列 µ洗去上清液后加入50微升洗涤缓冲液，并用真空法去除上清液 µ将1微升工作珠混合液（偶联抗原的珠子）加入预润湿的孔中。
- 加入50 µ将50 μl抗体稀释液加入96孔滤板每列的第1至第7行 µl PBS-1% BSA 缓冲液至第 8 行 取而代之 加入稀释的抗体以作为空白对照孔。使用多通道移液器上下吹打5次进行混匀。对所有需验证的抗原偶联微球组均执行相同操作。
- 盖上盖子，置于微孔板振荡器上，室温避光孵育1小时，转速为500 rpm。用真空泵吸去上清液。
- 用 100 μL 洗涤液冲洗孔板 µl 洗涤缓冲液，真空抽吸去除上清液，重复 1 次。将微球重悬于 50 µ使用多通道移液器将1% BSA的PBS溶液加入。
- 将生物素标记的抗物种特异性IgG二抗稀释至16倍 µg/ml，溶于 PBS-1% BSA
- 加入50 µ将稀释后的二抗溶液各 l 加入每个孔中，用移液器吹打混匀5次。
- 盖上滤膜板，置于平板振荡器上，室温避光孵育30分钟。用真空泵吸去上清液。每孔用100 μL洗涤液洗涤 µ加入1升洗涤缓冲液，真空抽吸去除上清液，再重复洗涤一次。
- 将珠子重悬于 50 µPBS-1% BSA 溶液，使用多通道移液器加入。
- 稀释链霉亲和素-R-藻红蛋白报告分子（SAPE）至24 µg/ml，溶于 PBS-1% BSA
- 加入50 µ向每孔加入报告分子1微升，用移液器吹吸混匀5次。
- 盖上滤膜板，置于平板振荡器上，室温避光孵育30分钟。通过真空抽吸去除上清液。用100 μL洗涤液洗涤孔板 µ加入1升洗涤缓冲液，真空抽吸去除上清液，再重复洗涤一次。
- 将珠子重悬于 100 µl PBS-1% BSA，并分析50 µ使用分析仪进行检测29.
注意：基于微球的多重免疫测定结果以中位荧光强度（MFI）表示。为避免错误，应始终参考最新版本的软件操作手册（如有）。
5. 唾液多重免疫测定
- 从 -80 °C 冰箱中取出唾液样本，在室温下解冻。
- 通过涡旋振荡和超声处理 20 秒，重悬抗原偶联的微球储备液。
- 将偶联微球储备液用 PBS-1% BSA 缓冲液稀释，配制工作用微球混合液，使每种独特微球的终浓度为 100 个/µl。
- 在 96 孔深孔板中，用 PBS-1% BSA 缓冲液将唾液样本稀释至 1:4。
- 用 100 µl 洗涤缓冲液预润湿滤板，通过真空抽吸去除上清液。
- 向 96 孔滤板的 95 个孔中各加入 50 µl 工作用微球混合液和等体积的稀释唾液样本，使终稀释度为 1:8。使用多通道移液器混匀反应体系。在对照孔中加入 50 µl 抗原偶联微球和 50 µl PBS-1% BSA 缓冲液（代替唾液）。
- 盖上盖子，在避光条件下，于 500 rpm 微孔板摇床上室温孵育 1 小时。通过真空抽吸去除上清液。每孔加入 100 µl 洗涤缓冲液，再次抽吸去除上清液。重复洗涤一次。
- 用多通道移液器将微球重悬于 50 µl PBS-1% BSA 缓冲液中。
- 将生物素标记的山羊抗人 IgG 二抗检测抗体用 PBS-1% BSA 缓冲液稀释至 16 µg/ml。
- 向每孔加入 50 µl 稀释后的二抗，并用多通道移液器混匀。
- 盖上滤板，在避光条件下，于微孔板摇床上室温孵育 30 分钟。通过真空抽吸去除上清液。每孔加入 100 µl 洗涤缓冲液，抽吸去除上清液。重复洗涤一次。
- 用多通道移液器将微球重悬于 50 µl PBS-1% BSA 缓冲液中。
- 将链霉亲和素-R-藻红蛋白报告分子（SAPE）用 PBS-1% BSA 缓冲液稀释至 24 µg/ml。
- 向每孔加入 50 µl 报告分子，并用多通道移液器混匀。
- 盖上滤板，在避光条件下，于微孔板摇床上室温孵育 30 分钟。通过真空抽吸去除上清液。每孔加入 100 µl 洗涤缓冲液，抽吸去除上清液。重复洗涤一次。
- 将微球重悬于 100 µl PBS-1% BSA 缓冲液中，取 50 µl 使用分析仪29进行检测。
注：多重免疫分析的结果以中位荧光强度（MFI）单位表示。如有最新版本的软件手册，请始终参考该手册以避免错误。
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结果
一组独特的微球用作对照，以检测非特异性结合及样本间的变异情况。这些微球在除偶联步骤中未与任何抗原孵育外，其余处理均与抗原偶联微球相同。MFI值 >由于怀疑血清污染，来自与所有唾液样本孵育的对照微球的500个数据点被排除在进一步分析之外，其余反应呈对数分布。如果使用采集装置上附着的海绵过度摩擦牙龈，或研究参与者患有牙周病，则唾液可能被血清污染。采用对数转换后的MFI数据，根据对数MFI值的均值加3个标准差计算出免疫阳性 cutoff 值为505 MFI。此外，将抗原偶联微球加入特定孔中，这些孔在所有处理方式上均作为检测孔，唯一区别是用PBS-1% BSA替代稀释唾液，以评估背景荧光和交叉反应性。将这些背景孔中获得的MFI值从每个唾液样本各抗原偶联微球组的MFI值中扣除。
通过使用针对每种抗原的动物来源的物种特异性一抗进行检测，确认微球偶联成功。为确保偶联抗原的微球能够达到检测方法的动态范围，我们将适当的偶联标准定义为：MFI ≥18,000、呈现剂...
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讨论
这些结果表明，该多重免疫分析方法可用于区分免疫阳性与免疫阴性的唾液样本。为确定免疫阳性，通过计算所有唾液样本中未经抗原偶联的对照微球经对数转换后的MFI反应值的均值加三个标准差，设定单一的临界值。该临界值可用于评估对单一或多种病原体的暴露情况及免疫流行率。这种区分能力在人群研究中可能具有重要价值，有助于探讨暴露于环境及其他病原体相关的健康风险。
根据MFI的分布、未偶联对照以及研究设计所要回答的问题，还可采用多种其他方法来确定临界值。确定临界值的一些示例方法包括有限混合模型分析24-26、对照反应均值加3个标准差、对照反应均值加2个标准差，以及对照反应均值的3倍27,28。对于初步筛查，可采用较宽松的标准；而对于流行病学研究，则可能更适合采用更严格的标准，以降低假阳性结果报告的概率。我们最初的应用是考察游泳者与非游泳者之间的免疫转化及免疫流行情况。在本研究中，未偶联对照的MFI值呈非正态分布，因此对结果进行了对数转换。
基于微球的多重免疫分析具有多项优势，包括仅需极低的样本量、节省时...
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披露
本研究由美国环境保护局通过其研究与发展办公室资助并管理。本研究已通过该机构的行政审查，并获准发表。提及商品名称或商业产品并不构成对其使用 endorsement 或推荐。
致谢
Clarissa Curioso 的研究工作得到了美国环境保护署（U.S. Environmental Protection Agency）研究参与项目的支持，该项目由橡树岭科学与教育研究所（Oak Ridge Institute for Science and Education）通过美国能源部与美国环保署之间的机构间协议进行管理。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 设备与软件 | |||
| 微型离心机 | Thermo Electron Corporation | 75002446 | 用于离心样品 |
| 涡旋混合器 | VWR | G560 | 用于混匀样品 |
| 超声波破碎仪（迷你型） | Fisher Scientific | 15-337-22 | 用于分离微球 |
| 移液器 P10、P20、P100、P1000、8通道 | 卡普 | 多种 | |
| 血细胞计数板（Bright Line） | 侯瑟科学 | 3200 | 用于计数偶联的微球 |
| Multiscreen 真空 manifold | Millipore | MSVMHTS00 | 用于洗涤步骤以去除上清液 |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | 孵育期间用于振荡微球 |
| 试管架（1.5 ml 和 0.5 ml）（混合型） | VWR | 30128-346 | |
| 电子天平 | Mettler 或其他 | 用于测量配制缓冲液的洗涤试剂 | |
| Dynabead 样本混合器 | Invitrogen | 947-01 | 偶联孵育步骤中使用 |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | 用于分析抗体反应数据 | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | 用于分析抗体反应数据 | |
| Luminex 分析仪配备 xPonent 3.1 软件 | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | 运行检测所用的仪器与软件 |
| 抗原 | |||
| GI.1 诺如病毒：p-颗粒 | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | 辛辛那提儿童医院。最终浓度 5 µg. |
| GII.4 诺如病毒 VA387：p-颗粒 | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | 辛辛那提儿童医院。最终浓度 5 µg. |
| 甲型肝炎病毒：细胞培养的II级浓缩物 | Meridian Life Sciences | 8505 | 抗原偶联浓度为100 µg |
| 幽门螺杆菌裂解液 | Meridian Life Sciences | R14101 | 抗原在25下偶联 µg |
| 刚地弓形虫：重组 p30（SAG1） | Meridian Life Sciences | R18426 | 抗原在25下偶联 µg |
| 空肠弯曲菌：热灭活的全细胞 | KPL | 50-92-93 | 抗原偶联浓度为50 µg |
| 一抗 | |||
| 豚鼠抗诺如病毒 | （CCHMC）* | NA | 用于偶联确认 |
| 小鼠抗甲型肝炎 IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | 用于偶联确认 |
| 小鼠抗甲型肝炎 IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | 用于偶联确认 |
| BacTrace亲和纯化抗体 幽门螺杆菌 | KPL | 01-93-94 | 用于偶联确认 |
| 山羊多克隆抗体至 刚地弓形虫 | Abcam | Ab23507 | 用于偶联确认 |
| BacTrace 山羊抗-空肠弯曲菌 物种 | KPL | 01-92-93 | 用于偶联确认 |
| 二级 抗体 | |||
| Biotin-SP-偶联 AffiniPure 驴抗山羊 IgG（H+L） | Jackson | 705-065-149 | 用于偶联确认 |
| 生物素标记的兔抗山羊IgG（H+L） | KPL | 16-13-06 | 用于偶联确认 |
| 生物素标记的山羊抗小鼠IgG（H+L） | KPL | 16-18-06 | 用于偶联确认 |
| 亲和纯化抗体 生物素标记的山羊抗兔IgG（H+L） | KPL | 176-1506 | 用于偶联确认 |
| 耗材 | |||
| 1.5 ml 共聚物微量离心管 | USA Scientific | 1415-2500 | 使用低吸附微量离心管 |
| 10 µl 移液器吸头补充装 | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µl 移液器吸头补充装 | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 µl 移液器吸头补充装 | BioVentures | 5130140C | |
| 铝箔 | 不同供应商 | 孵育期间需将微球避光保存 | |
| 深孔板 | VWR | 40002-009 | 用于稀释唾液样本 |
| 多孔滤膜板 | Millipore | MABVN1250 | 用于运行检测 |
| Oracol 唾液采集系统 | Malvern Medical Developments Limited | 用于唾液采集 | |
| 试剂 | |||
| 羧基化微球（beads） | Luminex Corporation | 取决于微球组 | 抗原与微球偶联 |
| EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐） | Pierce | 77149 或 22980 | 用于微球活化 |
| 磺基-NHS（Sulfo-NHS）N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠 | Pierce | 24510 | 用于微球活化 |
| 链霉亲和素-R-藻红蛋白（1 mg/ml） | 分子探针 | S-866 | 用作报告分子 |
| MES（2-[N-吗啉代]乙磺酸) | Sigma | M-2933 | 用于偶联 |
| Tween-20（聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯） | Sigma | P-9416 | 用于洗涤缓冲液中以去除非特异性结合 |
| 蛋白质缓冲液 | |||
| PBS-TBN 封闭/保存缓冲液（PBS，0.1% BSA，0.02% Tween-20，0.05% 叠氮化钠，pH 7.4）** | 过滤除菌，4 ℃ 保存 °C | ||
| PBS，pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl，2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2%（v/v） |
| 叠氮化钠（0.05% 叠氮化物）** | Sigma | S-8032 | **注意叠氮化钠具有急性毒性。避免接触皮肤和眼睛。穿戴适当的个人防护装备。根据相关法律法规进行处置。 |
| MES/偶联缓冲液（0.05 M MES，pH 5.0） | |||
| MES（2-[N-吗啉代]乙磺酸) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| 检测缓冲液（PBS，1% BSA，pH 7.4） | 过滤除菌，4℃保存 °C | ||
| PBS，1% BSA，pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| 活化缓冲液（0.1 M NaH2PO4，pH 6.2 | 过滤除菌，4 ℃ 保存 °C | ||
| NaH2PO4 （磷酸二氢钠，无水） | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| 洗涤缓冲液（PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4） | 过滤除菌，4 ℃ 保存 °C | ||
| PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl，2.7 mM KCl，0.05% TWEEN |
参考文献
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