胞嘧啶修饰形式使用敏感免疫组化检测

Summary

在本文中，我们描述了一种灵敏的免疫化学方法，用于基于使用过氧化物酶偶联的二抗和酪胺信号放大来绘制 5mC 氧化衍生物的空间分布。

Abstract

脊椎动物基因组中发生的胞嘧啶碱基（5-甲基胞嘧啶，5mC）甲基化通常与转录沉默有关。5-羟甲基胞嘧啶 （5hmC）、5-甲酰胞嘧啶 （5fC） 和 5-羧基胞嘧啶 （5caC） 是最近发现的由 5mC 酶促氧化产生的修饰胞嘧啶碱基，其生物学功能仍然相对模糊。已经采用了从生化到基于抗体的技术的许多方法来研究这些修饰在各种生物系统中的基因组分布和全局内容。尽管其中一些方法可用于定量评估这些修饰形式的 5mC，但这些方法中的大多数并未提供有关这些 DNA 修饰在不同细胞类型中分布的任何空间信息，而这些信息是正确理解其功能作用所必需的。在这里，我们提出了一种用于免疫化学检测修饰形式的胞嘧啶的高灵敏度方法。该方法允许将这些表观遗传标记与蛋白质谱系标记物共同检测，并可用于研究它们的核定位，从而有助于破译它们在不同实验环境中的潜在生物学作用。

Introduction

在DNA（5MC）胞嘧啶碱基甲基化代表与转录沉默^1个相关基因脊椎动物中发现了一个重要的表观遗传标记。 5MC被引入并通过DNA甲基^2-5保持，并已被证明在许多生物过程中起重要作用，包括基因组印记，X染色体失活，细胞分化，发育^3,6。因此，破坏5MC基因组的图案与许多疾病^7，8-11相关联。尽管在理解发育和疾病5MC作用的进展，但仍仍是未知如何标记在发展中国家和成人组织中被删除。 DNA去甲基化的几个潜在的机制近来已经提出包括主动和被动去甲基化机构^{12，13，14，15。}发现5MC连续氧化由一零一一年易位enzym介导的产品ES（TET1 / 2/3），例如5- hydroxylmethylcytosine（5hmC），5- formylcytosine（5FC），和在真核生物DNA ^{16，17，18，19}提示猜测5- carboxylcytosine（5caC）是否可作为中间体在自己的权利¹³ DNA去甲基化的过程，或者作为稳定表观遗传标记。而碱基切除修复的组件，胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）可结合和从DNA的¹⁹删除这两个5FC和5caC示范^，20表明了改性5MC衍生物在活性DNA去甲基化的作用。最近的证据表明5FC / 5caC可以调节的RNA II延伸能力点率转录调控²⁹这些标记可能参与。由于5MC的氧化形式这个潜在的生物重要性，一系列的生物化学和基于抗体的技术已被用于研究其基因组分布和全球内容^{16，19-24。}

鉴于大多数的t他脊椎动物的器官由不同类型的细胞和的修饰的胞嘧啶碱基的分布是组织和细胞类型特异性^{16-18，20，23，25-27，}在确定在不同组织中的氧化5MC衍生物的空间分布成为一个重要的实验为揭开它们的生物学功能任务必需的。大部分的生物化学和基于抗体的方法并不提供关于5MC的不同组织和细胞类型的修饰形式的分布的任何空间信息。相反，基于免疫化学技术可以提供用于评估5MC ²⁸及其氧化衍生物²⁰的空间分布和核定位一个快速的工具。即表示，所报告的丰富度很低5FC（20中每10 ^6个胞嘧啶）和5caC（3中每10 ^6个胞嘧啶）在小鼠基因组¹⁸代表用于标准免疫化学一个显著挑战。

这里，我们描述提供了强大的一个高度敏感的免疫化学方法和在哺乳动物脑组织胞嘧啶氧化形式的快速检测。通过将加上信号放大步骤过氧化物酶缀合的第二抗体，这种方法绕过了检测非常低量的5FC和5caC的挑战。此外，这种技术可用于与谱系特异性标记胞嘧啶的共同检测修饰形式，有效地补充在阐明这些表观遗传标记的生物学功能的其他方法。

Protocol

所有动物参与的程序是按照英国诺丁汉大学的伦理审查委员会进行。

1.选择用于免疫染色合适的组织准备

1. 如先前²⁵描述的生成的野生型CD1小鼠胚胎和成人脑组织的石蜡包埋部分。使用固定为4％甲醛（FA）或4％多聚甲醛（PFA）的免疫染色方法²⁵的脑组织切片。
   注:使用的石蜡包埋组织切片之前必须获得抗体标记脱蜡。由于有2个治疗 - 4中的协议，用于DNA变性采用1M盐酸（HCl）的不与大多数抗原修复策略的兼容性，我们推荐使用的联合检测5MC氧化衍生物与蛋白质无论是永冻或切片机切片的标记。

2.脱蜡石蜡包埋组织切片< / P>

1. 在II类运行安全柜，洗石蜡包埋组织切片在科普林罐子装满二甲苯，2次，每次10分钟在室温。
   注:为未完成清蜡会导致不一致的染色模式，是用新鲜二甲苯重要。
2. 脱蜡后，迅速再水化通过洗涤的组织切片连续在95，75，并在RT每10分钟50％的乙醇。

3.固定和永冻和切片机切片的透

1. 将它们放置在任何冰冷的4％PFA或4％FA在室温为15分钟修复再水化组织切片。
2. 通过在RT洗涤在PBS 5分钟的节（磷酸盐缓冲盐水）除去过量的固定剂。
3. 通过在科普林缸（在PBS中0.5％的Triton X-100）填充有PBX在R​​T 30分钟将透化的组织切片。在PBT（0.01％吐温20的PBS）洗不久的部分去除多余的PBX。

jove_title"> 4。免疫染色OXI-5MC衍生品

1. 放置在2当量盐酸的透截面在RT 60分钟为的DNA脱嘌呤。
   注意:虽然高浓度的盐酸（ 例如，4 N），导致更有效的DNA变性，它们不是用于共检测OXI-MCS的用DAPI兼容。
2. 放置在10mM的Tris-HCl（pH为8.5）进行30分钟的部分在RT以中和盐酸。可替代地，洗部分三次，每次在PBS中5分钟。孵育在PBT中的章节在RT 5分钟。
3. 小心地从周围组织部分区域的液体而不会被轻轻摇晃幻灯片让组织切片完全干燥在任何步骤。使用疏水性障碍笔包围部分不接触部分。
   注:疏水屏障笔减少抗体染色的组织可以允许多个部分与differen染色所需的音量同一张幻灯片上牛逼的抗体。
4. 孵育在潮湿的腔室中加入100μl阻断溶液（在PBS中的10％牛血清白蛋白）在RT 1小时的部分。
   注:跳过此步骤将不会影响染色的修饰的胞嘧啶碱基的效率。
5. 孵育在100μl1的组织切片:5000稀释的小鼠单克隆抗5hmC和一个1:在在潮湿室阻挡在RT 1小时溶液兔多克隆抗5caC初级抗体1,000稀释。可替代地，如果需要，过夜，在4℃下进行温育。
   注:没有初级抗体处理的部分可以作为适合阴性对照的染色过程。 12.5天后富集5caC，5FC和5hmC ²⁰可以用作阳性对照交配小鼠胚胎的脑切片。
6. 通过三次洗涤部分在科普林罐子装满PBT，每次5分钟在警察去除多余的抗体林瓶在室温。
   注意:增加洗涤溶液的体积可以减少背景染色。
7. 除去过量的PBT和，如果需要的话，与疏水屏障笔再次包围的部分作为PBT的含有洗涤剂，可以削弱疏水屏障。
8. 使1:山羊抗兔HRP偶联抗体的1:400稀释并以1:在阻断溶液400稀释的驴抗小鼠555缀合的抗体。
9. 从步骤4.9孵育在100μl第二抗体混合物的组织切片在室温在潮湿室中1小时。
10. 洗在科普林罐子装满PBT三次，每次5分钟，在RT下的组织切片。
11. 放置在100μl1的组织切片:在酪酰胺信号放大缓冲器酪酰胺的1:200稀释，在室温2分钟。
12. 立即，由每个洗涤载玻片3次5分钟在PBT中除去过量的酪酰胺溶液。
13. 小心ý除去过量PBT和立即覆盖部分带有一个安装介质的压降（见材料清单）。
14. 轻轻地放在组织切片盖玻片，并立即密封指甲油盖玻片。
15. 存放在4℃的组织切片用显微镜检验前几个小时。 （ - 40X放大率10）在405，488和/或555纳米的荧光显微镜下检查。

Results

为了确定5hmC在脑组织切片的分布情况，我们进行了联合检测这表观遗传修饰的与有丝分裂后神经元的NeuN标记，使用专门带有该标志进行交互，而是商业的抗5hmC抗体不与其他形式的修改胞嘧啶^20,25。在成人脑5hmC和5caC分布的免疫组织化学分析显示，而突出5hmC染色的NeuN阳性细胞共定位，的NeuN阴性的神经胶质细胞具有基因组5hmC（ 图^1）20的下级。

我们最近发现，四环素依赖5MC氧化是神经干细胞^（NSCs）20的谱系规范中执行。尽管是在神经干细胞免疫化学检测不到，5FC和5caC表现出对在一个神经元的神经干细胞分化的早期阶段，突出免疫第二胶质谱系。这两个标志瞬时早期神经元和神经胶质分化²⁰标记的外观同时积累。为了确定分化我们在胶质分化诱导后3天对NSCs的固定培养物进行该标记的共染色用胶质标志物GFAP的NSCs 5caC的分布。不像在神经干细胞或成熟的星形胶质细胞（数据未显示），我们在比较大的比例在这些培养物中表达GFAP的细胞（ 图^2）20的观察强烈5caC信号。

5hmC在用DAPI（蓝色）复染色成人脑组织（绿色）用的NeuN（红色），个别信道和合并的视图的图1共同免疫染色所示。比例尺是25微米。空白">点击此处查看该图的放大版本。

图5caC的与胶质分化的第3天GFAP在NSC文化2.联合免疫，个别渠 ​​道和合并视图中显示。比例尺是20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

虽然报告的低丰度5MC氧化衍生物，5FC和5caC在一些组织的将提出显著限制为一个标准免疫化学协议，过氧化物酶缀合的二抗的掺入允许这些胞嘧啶修饰在固定组织和细胞的检测（ 图2） 。然而，最适孵育时间与酪酰胺溶液应当通过实验为每个单独的批次，其中信号强度与酪胺根据信号放大的持续时间之间的线性关系被观察到的，对于细节酪酰胺信号放大试剂盒的优化参阅Almeida 等人。2012 ²⁶ 。另外，信号/背景比，可以显著通过携带在一个科普林缸中洗涤，以允许有效地除去多余的抗体的提高。在与酪胺液孵化，它立即停止利用水洗PBT解决方案到D的反应是非常重要的ecrease背景染色。关键是不要让部分在操作过程中的任何点干燥。

DNA脱嘌呤的效率可以通过进行在37℃的脱嘌呤反应加以改进。在使用4当量盐酸代替2 N增强了使用4当量盐酸进行DNA脱嘌呤将不允许共染色用DAPI 5MC的修饰形式的染色，因为它与双链DNA完全相互作用。

尽管这种技术可以提供的胞嘧啶碱基，其中可检测的修饰形式健壮半定量评估，它不能被用于评估5MC或其氧化衍生物的绝对水平。因此，我们建议使用其他补充的，但定量方法^{16，19 -24。}因为在哺乳动物基因组5MC氧化衍生物的发现，几种方法已经被开发，以研究它们的生物作用^{16，19-24。}虽然这些approaCHES可以是在确定5MC氧化衍生物的绝对水平有价值的，它们不提供有关的信息的空间分布^20，26，我们已成功地使用这里所描述的方法来映射5MC氧化衍生物在不同的细胞类型的空间分布和定位发展中国家和成人大脑²⁰

通过揭示它们的空间分布^20中 ，该技术可以是对理解生物影响，并在不同的生物的上下文5MC的氧化衍生物，其中5MC的这些修饰的衍生物可包括细胞分化，发育和疾病进行检测的命运至关重要。此外，我们在这里描述的方法可以通过在含有tyrami不同的孵育时间评估过氧化物酶反应的动力学（其正比于染色强度）得到5MC的在不同组织中的氧化衍生物的半定量评估德^26。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coplin jar	Cole-Parmer	UY-48585-30	玻璃制成的
二甲苯			仅在 II 类安全柜中使用
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Fisher Scientific	12821680	pH 7.5，使用前过滤
4% 多聚甲醛 （PFA）	Sigma Aldrich	P6148	一旦制成，可在 -20 °C 下储存;C 在等分瓶中保存几个月
4% 甲醛 （英足总）	Sigma Aldrich	F8775	一旦制成，可以在 -20 °C 在等分试样中保存数月
乙醇，无水变性，组织学级	Sigma Aldrich	64-17-5	PBS 中 95， 75， 50%
0.01% 吐温 20 PBS	中 Sigma Aldrich	P9416	PBT
0.5% Triton X-100 PBS	中 Sigma Aldrich	X100	PBX
2 N HCl	Sigma Aldrich	71826	注意 剧毒
100 mM Tris-HCl	Promega	H5121	pH 值调节至 8.5
疏水屏障笔	Abcam	ab2601	用于免疫组织化学
载玻片湿室	科学设备实验室	197-BL
抗 5mC 小鼠抗体	Diagenode		C15200081 单克隆一抗
抗 5hmC 抗体	活性基序	39791	兔多克隆抗体一抗
抗 5caC 抗体	活性基序	61225	兔多克隆一抗
过氧化物酶偶联的抗兔二抗	Dako	K1497
555 偶联的山羊抗小鼠抗体	分子探针	A-11005	二抗
10% BSA	Sigma Aldrich	A9418	封闭液
22 x 32 mm 玻璃盖玻片	BDH	406/0188/24
酪胺信号放大系统	Perkin Elmer	NEL741001KT	其他氟丁管偶联的二抗可用于 oxi-5mC 的共检测
含 DAPI	Vector Labs	H-1200
无色指甲油
鸡多克隆抗 GFAP 多克隆抗体Thermo	Scientific	PA5-18598	1：400 稀释抗
NeuN 小鼠单克隆抗体	Merck milipore	MAB377B	1：400 稀释