在此抗原驱动的结肠炎模型中，表达红色荧光蛋白的OT-II CD4+ T细胞被过继转移至单核吞噬细胞（MPs）表达绿色荧光蛋白的RAG-/-小鼠体内。随后，用表达卵清蛋白（OVA）与青色荧光蛋白（CFP）融合蛋白的大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）对宿主小鼠进行攻击。
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本文内容
摘要
摘要
炎症性肠病（IBD）是一种影响胃肠道（GIT）的慢性炎症性疾病。研究该疾病发生过程中涉及的免疫学机制的最佳方法之一是T细胞转移性结肠炎模型。在该模型中，将来自健康野生型供体的初始CD4+ T细胞移植到免疫缺陷型小鼠（RAG-/-受体）体内以重建其免疫系统。
该模型可用于研究导致疾病和慢性炎症的最早期免疫学事件，此时肠道炎症持续存在，但不依赖于特定抗原。为了研究抗原呈递细胞（APCs）在疾病过程中的潜在作用，建立一个由抗原驱动的疾病模型将非常有帮助，其中明确的共生菌来源抗原可引发结肠炎。因此，已开发出一种抗原驱动型结肠炎模型。在此模型中，将能够特异性识别卵清蛋白（OVA）中特定表位的OT-II CD4+ T细胞转移至RAG-/-宿主，并用表达CFP-OVA的E. coli进行攻击。该模型可用于研究固有层中抗原呈递细胞与T细胞之间的相互作用。
引言
肠道是人体暴露于外部环境的最大表面。大量定植微生物在人体肠道内寄居，形成肠道微生物群（或称肠道菌群）。据估计，其包含多达10万亿个微生物细胞，是生物学中已知最密集的细菌栖息环境之一1-3在胃肠道中，细菌定植于肠道生态位，并在此存活和增殖4相反，微生物群赋予宿主一些其基因组未编码的额外功能特性1例如，微生物群可刺激上皮细胞增殖，产生宿主自身无法合成的维生素，调节代谢，并抵御病原体4-6鉴于这种有益的关系，一些作者提出，人类是 "超级生物体" 或 "全生物体" 包含细菌和人类基因的混合体7,8鉴于微生物群对（人类）宿主具有有益影响，肠道免疫系统需要耐受共生微生物，以允许其在肠腔内存在，同时清除从肠腔侧入侵的病原体。9-11肠道免疫系统已进化出能够区分无害和潜在有害管腔微生物的机制；然而，这些机制尚未被充分阐明。12维持肠道完整性需要严格调控的免疫稳态，以保持耐受与免疫之间的平衡13免疫稳态失衡可导致炎症性肠病（IBD）等肠道疾病的发生。3,14.
炎症性肠病（IBD）主要有两种类型：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。患有这些疾病的患者通常会出现便血、严重腹泻和腹痛15,16。IBD 的确切病因尚不明确，但遗传因素、环境影响以及....
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方案
小鼠在乌尔姆大学（德国乌尔姆）动物实验中心的无特定病原体（SPF）条件下进行繁育和饲养。所有动物实验均依照当地动物使用与护理委员会的指南及国家动物福利法的规定进行。
1. pCFP-OVA 质粒的构建
- 使用引物 Ova_SpeI_fw（3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5'）和 Ova_ClaI_rev（3'-GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5'）扩增全长 OVA 基因37 使用质粒 pCI-OVA（氨苄青霉素抗性）42 作为模板。克隆PCR产物（即 使用引物和载体的 SpeI 和 ClaI 限制性酶切位点，将编码 OVA 的序列克隆至一种市售的噬菌体中间载体中，从而获得特异性的 OVA 质粒。
- 扩增编码CFP的基因及其强组成型启动子 P高 使用质粒 pAD1-cCFP（氯霉素抗性） 43 以 CFP_SacII_fw（3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5'）和 CFP_SpeI_rev（3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5'）为引物，质粒为模板37. ....
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结果
为建立一种抗原驱动的结肠炎模型，需进行以下操作： E. coli 菌株 已构建一种质粒，其中编码CFP的基因与鸡卵清蛋白蛋白的编码序列融合，该融合结构在强组成型启动子的调控下表达 P高 (图1A。荧光显微镜显示，该重组蛋白 E. coli pCFP-OVA，而非亲本 E. coli DH10B，表达CFP（图1B）。产生CFP-OVA的 E. coli 能够激活 OT-II 细胞 体外 并诱导IFN-γ的产生，与之相反的是 E. coli 仅表达CFP的菌株（图2). 图 3A 显示 离体 CX结肠组织的三维共聚焦成像3CR1GFP/+ 喂食的小鼠 E. coli pCFP-OVA E. .......
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讨论
与其他所有模型一样，上述抗原诱导的结肠炎模型可能存在一些问题，操作该技术的研究人员必须对此保持警惕。在将OT-II/Red+ CD4+ T CD62L+细胞注射入宿主时，研究人员必须非常轻柔并小心地将针头插入腹腔。若操作不当，可能导致小鼠肠道撕裂，进而引起死亡，或导致细胞被注射至皮下，无法诱导疾病发生。
通常，小鼠在细胞转移后的第一周内会增重。研究者应在每次称重时间点的同一时间进行称重，并在整个实验过程中使用同一台称重天平。有时，实验小鼠（尤其是实验开始时体重低于18 g的小鼠）可能不会出现消耗综合征的任何症状。然而，这些动物在宏观评估下仍可能出现明显的肠道炎症。
在操作基因修饰细菌时，可能会发生污染。为避免此类问题，强烈建议使用荧光显微镜检测表达CFP-OVA的E.coli，以分析细菌是否具有荧光且呈杆状（典型的E.coli形态）。
所提出的抗原驱动型结肠炎依赖于以下观.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
JHN 获得瑞士国家科学基金会（SNSF 310030_146290）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB肉汤，Miller型（Luria-Bertani） | Difco | 244620 | |
| 旋转摇床 | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm 间隙比色皿 | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell 系统 | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB琼脂，Miller型（Luria-Bertani） | Difco | 244510 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC培养基 | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure 质粒提取试剂盒 | Roche | 11754777001 | |
| 琼脂糖 | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| 冰醋酸 | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| 凝胶电泳槽 | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| 上样缓冲液 | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Marker | Thermo Fisher | SM0312 | |
| 溴化乙锭溶液 | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| 凝胶成像系统 | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA测序 | MWG-Biotech GmbH | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Biochrom | L182-50 | |
| 荧光显微镜 | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra 电泳系统 | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler 预染蛋白Marker | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue 溶液 | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| 硝酸纤维素膜 | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| 电转印仪 | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| 抗卵清蛋白抗体 | Abcam | ab181688 | |
| 抗兔IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus 西部印迹底物 | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| 异氟烷 | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon 细胞筛 | Fischer Scientific | 08-771-2 | |
| 氯化铵 | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris碱 | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand 支架 | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 饲喂针头 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 石蜡 | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| 苏木精 | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| 伊红Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| 胶原酶VIII型 | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| 罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）培养基 | AppliChem | A2044, 9050 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| 小鼠BD Fc阻断剂 | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC标记的mAb，识别Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC标记的mAb，识别CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 软件 | DeNovo | ||
| Meta 扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss 工作站 | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM 软件 | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp 免疫板 | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| 链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶 | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| 碱性磷酸酶底物：4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物 | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN 微孔板ELISA读板仪 | Tecan | ||
| EasyWin 软件 | Tecan | ||
| DNase I 重组酶 | 4536282001 |
参考文献
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....
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重印与许可
