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方法文章

开发一种抗原驱动的结肠炎模型以研究抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原的过程

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DOI：

10.3791/54421

⸱

2016年9月18日

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

本文内容

摘要

在此抗原驱动的结肠炎模型中，表达红色荧光蛋白的OT-II CD4+ T细胞被过继转移至单核吞噬细胞（MPs）表达绿色荧光蛋白的RAG-/-小鼠体内。随后，用表达卵清蛋白（OVA）与青色荧光蛋白（CFP）融合蛋白的大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）对宿主小鼠进行攻击。

摘要

炎症性肠病（IBD）是一种影响胃肠道（GIT）的慢性炎症性疾病。研究该疾病发生过程中涉及的免疫学机制的最佳方法之一是T细胞转移性结肠炎模型。在该模型中，将来自健康野生型供体的初始CD4+ T细胞移植到免疫缺陷型小鼠（RAG-/-受体）体内以重建其免疫系统。

该模型可用于研究导致疾病和慢性炎症的最早期免疫学事件，此时肠道炎症持续存在，但不依赖于特定抗原。为了研究抗原呈递细胞（APCs）在疾病过程中的潜在作用，建立一个由抗原驱动的疾病模型将非常有帮助，其中明确的共生菌来源抗原可引发结肠炎。因此，已开发出一种抗原驱动型结肠炎模型。在此模型中，将能够特异性识别卵清蛋白（OVA）中特定表位的OT-II CD4+ T细胞转移至RAG-/-宿主，并用表达CFP-OVA的E. coli进行攻击。该模型可用于研究固有层中抗原呈递细胞与T细胞之间的相互作用。

引言

肠道是人体暴露于外部环境的最大表面。大量定植微生物在人体肠道内寄居，形成肠道微生物群（或称肠道菌群）。据估计，其包含多达10万亿个微生物细胞，是生物学中已知最密集的细菌栖息环境之一1-3在胃肠道中，细菌定植于肠道生态位，并在此存活和增殖4相反，微生物群赋予宿主一些其基因组未编码的额外功能特性1例如，微生物群可刺激上皮细胞增殖，产生宿主自身无法合成的维生素，调节代谢，并抵御病原体4-6鉴于这种有益的关系，一些作者提出，人类是 "超级生物体" 或 "全生物体" 包含细菌和人类基因的混合体7,8鉴于微生物群对（人类）宿主具有有益影响，肠道免疫系统需要耐受共生微生物，以允许其在肠腔内存在，同时清除从肠腔侧入侵的病原体。9-11肠道免疫系统已进化出能够区分无害和潜在有害管腔微生物的机制；然而，这些机制尚未被充分阐明。12维持肠道完整性需要严格调控的免疫稳态，以保持耐受与免疫之间的平衡13免疫稳态失衡可导致炎症性肠病（IBD）等肠道疾病的发生。3,14.

炎症性肠病（IBD）主要有两种类型：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。患有这些疾病的患者通常会出现便血、严重腹泻和腹痛15,16。IBD 的确切病因尚不明确，但遗传因素、环境影响以及免疫反应失调的共同作用可能是疾病发生的关键因素15。

炎症性肠病（IBD）的动物模型已使用了50多年。在过去的几十年中，为了验证关于IBD发病机制的各种假说，研究人员开发了多种新的IBD模型系统17,18。其中特征最明确的慢性结肠炎模型是T细胞转移模型，该模型可诱导T细胞稳态失衡19,20。该模型的操作包括将来自免疫功能健全小鼠的初始T细胞转移至缺乏T细胞和B细胞的宿主（如RAG-/-和SCID小鼠）中16,21。在此模型中，通过评估腹泻、体力活动减少和体重下降等表现，可在3至10周内监测疾病的发展，这种现象被称为消耗综合征16。与健康小鼠相比，接受细胞移植的宿主其结肠组织更厚、更短且更重16。利用T细胞转移模型，可以研究不同T细胞群体在IBD发病机制中的作用22。然而，该模型并未以抗原特异性方式分析抗原呈递细胞（APC）与T细胞在疾病过程中的相互作用。已有研究表明，髓系细胞与淋巴系细胞之间的相互作用可能在肠道炎症的发生中起关键作用23。尽管IBD的许多方面已得到阐明，但导致疾病发生的初始事件仍需进一步明确。

已证明，在缺乏微生物群转移的情况下，无法建立结肠炎模型24最近，一些理论认为，炎症性肠病（IBD）可能是机体对共生细菌产生免疫反应的结果。25作者还提出，共生细菌对于诱导远端肠道的炎症反应至关重要。26在无菌（GF）动物中，肠道免疫系统通常存在功能缺陷。27,28，但若用无特定病原体细菌混合物定植这些小鼠，则可促使其发育出功能完备的肠道免疫系统29因此，肠道微生物群似乎是炎症性肠病发病机制中的关键因素，可能作为易感机制促进肠道炎症的发生，也可能具有保护作用以抵御肠道炎症的发展30,31目前的理论认为，炎症性肠病（IBD）是遗传易感患者肠道微生物失衡（称为菌群失调）所致的结果。32但目前尚不清楚菌群失调是疾病的原因还是结果12考虑到微生物在炎症性肠病（IBD）发展中的作用， 体外 实验表明，CD4+ T细胞可被经肠道细菌刺激的抗原提呈细胞激活33,34.

此外，已有研究表明，来自不同共生菌物种的抗原，例如 大肠杆菌，拟杆菌属，真杆菌属 和 变形杆菌属，能够激活 CD4+ T细胞35这表明细菌抗原向T细胞的呈递在炎症性肠病（IBD）的发生中具有重要意义。为了降低肠道微生物群在疾病过程中产生的多种抗原所带来的复杂性，一种 大肠杆菌 已构建出可表达OVA抗原的小鼠品系。通过向RAG小鼠体内注射OVA特异性T细胞以诱导转移性结肠炎。-/- 表达OVA的动物定植 E. coli.

该模型基于最近的研究证据，表明在结肠固有层（cLP）中占主导地位的细胞亚群CX3CR1+ MPs36，在转移性结肠炎过程中会与CD4+ T细胞发生相互作用37。MPs通过其树突从肠腔中摄取颗粒性抗原（如细菌）36,38,39。先前的研究表明，MPs也能摄取进入肠腔的可溶性抗原，例如卵清蛋白（OVA）40,41。鉴于cLP中CX3CR1+ MPs数量丰富，这些细胞有可能摄取肠腔内的细菌并与其特异性的CD4 T细胞发生相互作用。在移植了OVA特异性CD4+ T细胞并定植了表达CFP-OVA的E. coli的小鼠中进行共聚焦成像显示，CX3CR1+ MPs在抗原驱动的结肠炎发展过程中与OT-II型CD4+ T细胞发生接触。该模型可用于研究肠道抗原呈递细胞（APC）与仅针对肠腔内特定抗原表达细菌的T细胞之间的抗原呈递过程。

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方案

小鼠在乌尔姆大学（德国乌尔姆）动物实验中心的无特定病原体（SPF）条件下进行繁育和饲养。所有动物实验均依照当地动物使用与护理委员会的指南及国家动物福利法的规定进行。

1. pCFP-OVA 质粒的构建

  1. 使用引物 Ova_SpeI_fw（3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5'）和 Ova_ClaI_rev（3'-GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5'）扩增全长 OVA 基因37 使用质粒 pCI-OVA（氨苄青霉素抗性）42 作为模板。克隆PCR产物（即 使用引物和载体的 SpeI 和 ClaI 限制性酶切位点，将编码 OVA 的序列克隆至一种市售的噬菌体中间载体中，从而获得特异性的 OVA 质粒。
  2. 扩增编码CFP的基因及其强组成型启动子 P高 使用质粒 pAD1-cCFP（氯霉素抗性） 43 以 CFP_SacII_fw（3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5'）和 CFP_SpeI_rev（3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5'）为引物，质粒为模板37.
  3. 使用引物和载体的 SpeI 和 SacI 限制性酶切位点，将编码 CFP 的基因克隆至特定的 OVA 质粒（氨苄青霉素抗性）中37这在OVA编码序列的CFP编码区之间引入了由6个甘氨酸残基组成的间隔序列。

2. 构建 E.coli pCFP-OVA

  1. 培养 E.coli 在37 °C下，于100 ml LB（Luria Bertani）培养基中，将DH10B菌株在旋转摇床上有氧培养过夜。
  2. 将800 µl细菌培养物与200 µl甘油混合制备甘油菌种，并于-80 °C保存。
  3. 从甘油菌种中取50 µl大肠杆菌DH10B菌株接种于5 ml LB培养基中，37 °C有氧条件下在摇床中过夜培养。
  4. 将培养物转移至含有250 ml LB培养基的1 L带挡板锥形瓶中，在37 °C下于摇床中振荡培养。
  5. 将细菌培养至600 nm处的光密度（OD600) OD值为0.5时，将菌液置于冰上冷却30分钟。在4 °C条件下，以5,000 × g离心10分钟。
  6. 用100 ml预冷的无菌H2在4°C下以5,000 × g离心细菌10分钟。用100 ml预冷的10%甘油重悬细菌，于4°C下以5,000 × g离心10分钟。重复此步骤两次。
  7. 最后一次洗涤步骤后，将细菌重悬于700 µl 10%甘油溶液中。取50 µl分装，液氮冷冻后于-80 °C保存。
  8. 在冰上解冻50 µl样品，转移至预冷的电穿孔比色皿（电极间距2 mm）中。
  9. 加入5 µl质粒DNA（100 ng）至50 µl中 E. coli 分装。以25 µF、200欧姆（Ω）和2.5 kV的参数进行单次脉冲电穿孔。
  10. 将细菌重悬于1 ml预热的SOC培养基（5 g/L酵母提取物，2 g/L胰蛋白胨，10 mM氯化钠，2.5 mM氯化钾，10 mM氯化镁，10 mM硫酸镁）中，于37 °C有氧条件下孵育1小时。
  11. 在含有氨苄青霉素（100 µg/ml）的LB琼脂平板上接种细菌（将100 µl浓度为100 mg/ml的氨苄青霉素储存液加入100 ml LB琼脂中），于37 °C有氧条件下过夜培养。
  12. 挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素100 µg/ml的LB琼脂平板上划线培养。37 °C有氧条件下过夜培养。
  13. 挑取单克隆菌落，接种于 10 ml 含氨苄青霉素（100 µg/ml）的 LB 培养基中，过夜培养，用于质粒提取。使用 commercially available 质粒小提试剂盒，用 30 µl dH₂O 洗脱质粒 DNA。2O（蒸馏水）按照制造商方案操作。通过限制性酶切分析和DNA测序验证质粒。37,42,43.
  14. 建立阳性克隆的培养 E. coli 在含100 µg/ml氨苄青霉素的100 ml LB培养基中接种pCFP-OVA，于37 °C恒温摇床中需氧培养过夜。
  15. 将800 µl细菌培养物与200 µl纯甘油混合，于-80 °C保存。
  16. 将剩余的过夜培养物在室温下以 5,000 x g 离心 10 分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀。取 10 µl 悬液滴加到玻片上，盖上盖玻片。
  17. 在标准荧光显微镜下观察样品，以确认CFP-OVA的荧光表达（CFP激发波长450 nm，发射波长480 nm）。从400倍放大开始分析细菌。
  18. 在5,000 × g下离心1 ml过夜培养的细菌，10分钟，室温。将沉淀重悬于40 µl PBS中，95 °C煮沸10分钟。
  19. 将样品在30,000 × g离心10分钟，取上清液用于Western blot分析37使用兔源抗OVA多克隆抗体，按1:400比例稀释。

3. OT-II/Red 小鼠的制备

  1. 将雄性/雌性 OT-II 小鼠与表达红色荧光蛋白的雌性/雄性小鼠（两种品系均可商业获得）杂交，以获得 OT-II/Red 小鼠37。

4. 脾脏细胞分离

  1. 使用市售的卤代醚类麻醉剂（诱导浓度最高可达5%）进行吸入麻醉后，通过颈椎脱臼法处死OT-II/Red小鼠。
  2. 使用剪刀剪开小鼠左上腹部。在此部位下方可见脾脏（呈深红色椭圆形结构）。使用剪刀和镊子将其取出。
    1. 取出OT-II/Red小鼠的脾脏，将其置于装有50 ml离心管的100 µm细胞筛网上，用1 ml注射器的推杆研磨，以获得单细胞悬液。用10 ml含1%热灭活胎牛血清（FBS）的PBS冲洗筛网两次。
  3. 将细胞悬液在室温下以390 × g离心5分钟。弃上清后，加入5 ml预热的裂解缓冲液（144 mM NH4Cl，17 mM Tris，pH = 7.2），以裂解红细胞。37 °C孵育10分钟。
  4. 用25 ml含1% FBS的PBS洗涤样本，在室温下以390 × g离心5分钟。将沉淀重悬于10 ml含1% FBS的PBS中。
  5. 使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。取10 µl细胞悬液与10 µl 0.4%台盼蓝溶液混合，孵育1–2分钟。
    1. 取10 µl染色后的细胞悬液加入血细胞计数板腔室。在显微镜下计数其中一个计数室的四个1 × 1 mm2方格内的细胞，计算每个方格的平均细胞数。活细胞呈白色，死细胞呈蓝色。计算每毫升细胞数量时，将计数所得细胞数乘以稀释倍数；若计数了2–4个象限，则需除以所计象限的数量。

5. CD4+ CD62L+ T 细胞富集

  1. 通过磁珠分离试剂盒，利用阴性或阳性选择原理富集脾细胞中的 CD4+ CD62L+ T 细胞。此处，先采用阴性选择法分离 CD4+ T 细胞，再通过阳性选择法进一步富集 CD4+ T 细胞群体中的 CD62L+ 亚群。
    注：在阴性选择过程中，非目标细胞（此处为所有 CD4 阴性细胞）会被连接磁性微珠的特异性抗体标记；在过柱洗涤步骤中，未标记的 CD4+ T 细胞将流经柱体，从而易于收集。在阳性选择过程中，目标细胞被连接磁性微珠的合适抗体标记；在过柱洗涤步骤中，标记细胞将滞留在柱体内，通过将柱体移出磁场并用缓冲液冲洗，即可收集目标细胞。
  2. 进行阴性选择时，将 107 个总脾细胞重悬于 40 µl 含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）的冷 PBS 中。加入磁珠分离试剂盒提供的 10 µl 生物素标记抗体混合物（特异性结合非 CD4+ T 细胞的抗体），冰上孵育 15 分钟。
    1. 加入 30 µl 含 0.5% BSA 的冷 PBS 和 20 µl 抗生物素微珠，冰上孵育 20 分钟。
    2. 向样品中加入 10 ml 含 0.5% BSA 的 PBS，以 390 × g 离心 5 分钟。重复此步骤两次。将细胞重悬于 1 ml 含 0.5% BSA 的冷 PBS 中。
    3. 将适用于阴性选择的柱子置于磁场中，用 3 ml 含 0.5% BSA 的冷 PBS 冲洗柱子。将细胞悬液加入柱中，并用 3 ml 含 0.5% BSA 的冷 PBS 洗涤 3 次。
    4. 将流出液以 390 × g 离心 5 分钟。流出液中包含未标记的 CD4+ T 细胞。将沉淀重悬于 1 ml 含 0.5% BSA 的 PBS 中，并计数细胞。
    5. 使用血球计数板（Neubauer 计数室）进行细胞计数。取 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝溶液混合，孵育 1–2 分钟。
      1. 取 10 µl 染色后的细胞悬液填充血球计数室，在显微镜下计数一个计数室中四个 1 × 1 mm2 方格内的细胞数，计算每个方格的平均细胞数。活细胞呈无色，死细胞呈蓝色。计算每毫升细胞数时，将细胞数乘以稀释倍数。若计数了 2–4 个象限，则需除以象限数。
  3. 进行阳性选择时，每 107 个预富集的 CD4+ T 细胞组分中加入 10 µl CD62L 微珠，冰上孵育 15 分钟。
    1. 向样品中加入 10 ml 含 0.5% BSA 的 PBS，以 390 × g 离心 5 分钟。重复此步骤两次。将细胞重悬于 500 µl 含 0.5% BSA 的冷 PBS 中。
    2. 将适用于阳性选择的柱子置于磁场中，用 500 µl 含 0.5% BSA 的冷 PBS 冲洗柱子。将细胞悬液加入柱中，并用 500 µl 含 0.5% BSA 的冷 PBS 洗涤 3 次。
    3. 将柱子移出磁场，置于合适的收集管上。向柱中加入 1 ml 含 0.5% BSA 的 PBS，用力推动柱塞，将滞留在柱内的 CD4+ CD62L+ T 细胞冲洗出来。
      注：分离得到的 CD4+ CD62L+ T 细胞现已可用于后续实验，例如 in vivo 实验。根据 CD4+ CD62L+ T 细胞分离试剂盒说明书，所用微珠无毒性。由于微珠尺寸极小（约 50 nm），不会激活细胞，也不会占据细胞表面表位，因此分离的细胞可直接转移至免疫缺陷小鼠以诱导结肠炎37,44,45。
    4. 使用血球计数板（Neubauer 计数室）进行细胞计数。取 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝溶液混合，孵育 1–2 分钟。
      1. 取 10 µl 染色后的细胞悬液填充血球计数室，在显微镜下计数一个计数室中四个 1 × 1 mm2 方格内的细胞数，计算每个方格的平均细胞数。活细胞呈无色，死细胞呈蓝色。计算每毫升细胞数时，将细胞数乘以稀释倍数。若计数了 2–4 个象限，则需除以象限数。

6. 抗原诱导性结肠炎的诱导

  1. 向 CX3CR1GFP/+ x RAG-/- 小鼠腹腔注射 3 × 105 个 OT-II/Red CD4+ CD62L+ T 细胞。为诱导抗原特异性结肠炎，每隔一天通过灌胃或门齿后口服接种方式，每只小鼠给予 100 µl 含 1 × 108 菌落形成单位（CFU）的 E. coli pCFP-OVA。
  2. 每周两次监测移植小鼠的体重及其临床状况（粪便中是否带血、粪便性状以及小鼠活动能力）。

7. 用于组织病理学检查的组织样本

  1. 取小鼠大肠组织样本，用中性缓冲福尔马林（10%）固定，并按先前所述方法进行石蜡包埋36,46。
  2. 使用切片机对石蜡包埋的样本进行切片，载片后进行苏木精和伊红（H&E）染色47,48。
  3. 根据既往文献报道的方法对大肠组织学进行分类47,48：正常（评分0）；轻度结肠炎（评分1）；中度结肠炎（评分2）；重度结肠炎（评分3）。

8. 结肠固有层细胞的分离

  1. 使用市售的卤代醚类麻醉剂（诱导时浓度最高可达5%）进行吸入麻醉后，通过颈椎脱位法处死移植小鼠。
  2. 将动物仰卧放置。用镊子夹住尿道口前方的皮肤，用剪刀沿腹侧中线从腹股沟剪至胸部，然后将两侧皮肤向后拉开。
  3. 剪开透明的腹膜肌层以打开体腔。识别从肛门延伸至盲肠49的结肠组织。切断结肠两端，并去除附着的脂肪组织。
  4. 使用解剖剪纵向切开结肠。用镊子在含有25 ml PBS（补充1% FBS）的培养皿中轻轻振荡结肠组织，以去除碎片和黏液。将结肠切成5–8 mm的小段。
  5. 将结肠节段放入含有20 ml洗涤缓冲液的50 ml离心管中。洗涤缓冲液的成分为500 ml DPBS、10 mM Hepes和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。
  6. 以最大速度涡旋震荡管子30秒。
  7. 将装有结肠节段的管子置于37 °C水浴中，以200 rpm振荡孵育10分钟。
  8. 孵育结束后，以最大速度涡旋震荡管子30秒。
  9. 弃去上清液，将组织样本转移至另一个含有20 ml洗涤缓冲液的50 ml离心管中。重复步骤6–9共三次。
  10. 弃去上清液，将组织样本放入含有25 ml PBS的培养皿中。用镊子在培养皿中轻轻振荡组织样本数秒钟，以去除残留的上皮细胞。此步骤重复三次。
  11. 将结肠组织切成2 × 2 mm2的小块，并在10 ml Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中消化，培养基中含0.5 mg/ml来自Clostridium histolyticum的胶原酶VIII型和10 U/ml DNaseI。
  12. 以最大速度涡旋震荡管子30秒。
  13. 将结肠碎片置于37 °C水浴中，以200 rpm振荡孵育35分钟，每隔5分钟涡旋震荡30秒。
  14. 孵育结束后，以最大速度涡旋震荡管子30秒。
  15. 将消化后的组织碎片通过置于新50 ml离心管上的70 µm细胞滤筛进行过滤收集。
  16. 加入20 ml DPBS洗涤样本，400 g离心5分钟。然后将细胞重悬于1 ml DPBS中。
  17. 使用Neubauer计数板对细胞进行计数。取10 µl细胞悬液与10 µl 0.4%台盼蓝溶液混合，孵育1–2分钟。
    1. 取10 µl染色后的细胞悬液填充至血细胞计数室。在显微镜下计数计数室中四个1 × 1 mm2方格内的细胞数，计算每个方格的平均细胞数。活细胞呈白色，死细胞呈蓝色。根据稀释倍数乘以细胞数计算每毫升细胞数量。若计数了2–4个象限，则需除以象限数。

9. 用于流式细胞术分析的细胞外染色

  1. 将cLP细胞在390 × g条件下离心5分钟。用1 ml FACS A缓冲液（PBS中添加1% BSA和0.1%叠氮化钠）重悬细胞。
    注意：叠氮化钠具有高毒性，可引起低血压、低体温、头痛、惊厥甚至死亡。稀释的叠氮化钠溶液（0.1至1.0%）通常对使用者不构成特殊危险，但对眼睛和皮肤具有刺激性。因此，使用叠氮化钠时必须在通风橱内操作，并穿戴实验服及双层一次性丁腈手套。
  2. 在室温下，用FACS A缓冲液稀释抗FcγRIII/II CD16/CD32的单克隆抗体2.4G2（每106个细胞使用0.5–1 µg抗体），与细胞孵育15分钟。
  3. 向细胞中加入200 µl FACS A缓冲液，在390 × g条件下离心5分钟。重复此步骤两次。随后在4 °C条件下，用适量单克隆抗体（每106个细胞0.5 ng）孵育细胞20分钟。抗体需用FACS A缓冲液稀释。
  4. 向细胞中加入200 µl FACS A缓冲液，在390 × g条件下离心5分钟。重复此步骤两次。最后将样品用100 µl FACS A缓冲液重悬。
  5. 通过流式细胞仪分析经OT-II/Red CD4 T细胞重建的CX3CR1GFP/+ × RAG-/-小鼠的T细胞37。
  6. 使用商业软件进行数据分析。

10. 共聚焦显微镜分析

  1. 分析经或未经OT-II/Red CD4+CD62L+ T细胞重建、且每隔一天经口饲喂1 × 108 CFU E. coli DH10B pCFP-OVA菌株的CX3CR1GFP/+小鼠的结肠组织。
  2. 使用剪刀和镊子从小鼠体内取出结肠，并用解剖剪沿纵轴切开。
  3. 用剪刀截取一段5–8 mm的结肠样本，置于载玻片上，并加盖盖玻片。
  4. 使用共聚焦显微镜以40/1.30倍率分析结肠样本。
  5. 使用激发波长488 nm、发射波长509 nm的滤光片组，检测被绿色荧光蛋白（GFP）标记的CX3CR1+巨噬细胞（MPs）。
  6. 使用激发波长554 nm、发射波长586 nm的滤光片组，检测表达红色蛋白的CD4+ T细胞。
  7. 使用激发波长450 nm、发射波长480 nm的滤光片组，检测E. coli pCFP-OVA。
  8. 定义感兴趣区域，并如前所述50生成散点图以进行共定位分析。采用两种不同公式：Manders重叠系数和Pearson相关系数。

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结果

为建立一种抗原驱动的结肠炎模型，需进行以下操作： E. coli 菌株 已构建一种质粒，其中编码CFP的基因与鸡卵清蛋白蛋白的编码序列融合，该融合结构在强组成型启动子的调控下表达 P高 (图1A。荧光显微镜显示，该重组蛋白 E. coli pCFP-OVA，而非亲本 E. coli DH10B，表达CFP（图1B）。产生CFP-OVA的 E. coli 能够激活 OT-II 细胞 体外 并诱导IFN-γ的产生，与之相反的是 E. coli 仅表达CFP的菌株（图2). 图 3A 显示 离体 CX结肠组织的三维共聚焦成像3CR1GFP/+ 喂食的小鼠 E. coli pCFP-OVA E. ...

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讨论

与其他所有模型一样，上述抗原诱导的结肠炎模型可能存在一些问题，操作该技术的研究人员必须对此保持警惕。在将OT-II/Red+ CD4+ T CD62L+细胞注射入宿主时，研究人员必须非常轻柔并小心地将针头插入腹腔。若操作不当，可能导致小鼠肠道撕裂，进而引起死亡，或导致细胞被注射至皮下，无法诱导疾病发生。

通常，小鼠在细胞转移后的第一周内会增重。研究者应在每次称重时间点的同一时间进行称重，并在整个实验过程中使用同一台称重天平。有时，实验小鼠（尤其是实验开始时体重低于18 g的小鼠）可能不会出现消耗综合征的任何症状。然而，这些动物在宏观评估下仍可能出现明显的肠道炎症。

在操作基因修饰细菌时，可能会发生污染。为避免此类问题，强烈建议使用荧光显微镜检测表达CFP-OVA的E.coli，以分析细菌是否具有荧光且呈杆状（典型的E.coli形态）。

所提出的抗原驱动型结肠炎依赖于以下观...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

JHN 获得瑞士国家科学基金会（SNSF 310030_146290）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LB肉汤，Miller型（Luria-Bertani）Difco244620
旋转摇床Reiss Laborbedarf e. K.Model 3020 GFL
2 mm 间隙比色皿 Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
甘油Sigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell 系统 BioRad Laboratories GmbH1652660
LB琼脂，Miller型（Luria-Bertani）Difco244510
氨苄青霉素Sigma-AldrichA9393-5G
SOC培养基Sigma-AldrichS1797-100ML
High Pure 质粒提取试剂盒Roche11754777001
琼脂糖Carl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
冰醋酸Sigma-Aldrich537020 
凝胶电泳槽 PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
上样缓冲液Thermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Marker Thermo FisherSM0312
溴化乙锭溶液Carl Roth GmbH & Co. KG2218.3
凝胶成像系统 Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNA测序 MWG-Biotech GmbH
磷酸盐缓冲液（PBS）BiochromL182-50
荧光显微镜 ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra 电泳系统Bio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler 预染蛋白Marker Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue 溶液Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
硝酸纤维素膜 Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
电转印仪 Biometra GmbH846-015-600
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA6003-25G
抗卵清蛋白抗体 Abcamab181688
抗兔IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus 西部印迹底物Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
异氟烷Abbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon 细胞筛Fischer Scientific 08-771-2
氯化铵Sigma-Aldrich254134-5G
Tris碱Sigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T细胞分离试剂盒 Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS 柱 Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS 柱 Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStand 支架Miltenyi Biotec130-042-303
饲喂针头 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
中性缓冲福尔马林溶液，10%Sigma-AldrichHT501128
石蜡Sigma-Aldrich1496904
苏木精Sigma-AldrichH9627
伊红YSigma-Aldrich230251 
二硫苏糖醇Sigma-AldrichD9779 
胶原酶VIII型Sigma-AldrichC-2139
罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）培养基AppliChemA2044, 9050
叠氮化钠Sigma-Aldrich438456
小鼠BD Fc阻断剂BD Pharmingen553141
FITC标记的mAb，识别Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC标记的mAb，识别CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur BD Biosciences
FCS Express V3 软件DeNovo
Meta 扫描共聚焦显微镜 ZeissLSM 710 
Zeiss 工作站ZeissLSM 7
Zeiss ZEM 软件 Zeissv4.2.0.121
Maxisorp 免疫板 NUNC, Roskilde442404
链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶Jackson Immuno Research016-050-084
碱性磷酸酶底物：4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物Sigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN 微孔板ELISA读板仪Tecan
EasyWin 软件Tecan
DNase I 重组酶4536282001

参考文献

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