抗原驱动结肠炎模型的开发由抗原呈递细胞T细胞抗原研究的介绍

Summary

在这个抗原驱动的结肠炎模型中，表达红色荧光蛋白的 OT-II CD4⁺ T 细胞被过继转移到在单核吞噬细胞 （MPs） 中表达绿色荧光蛋白的 RAG^-/- 小鼠中。用表达卵清蛋白 （OVA） 与青色荧光蛋白 （CFP） 融合的大肠杆菌 （E.coli） 攻击宿主。

Abstract

炎症性肠病 （IBD） 是一种影响胃肠道 （GIT） 的慢性炎症。研究疾病期间涉及的免疫机制的最佳方法之一是结肠炎的 T 细胞转移模型。在该模型中，免疫缺陷小鼠 （RAG ^{- / -} 受体） 与来自健康野生型宿主的幼稚 CD4 ⁺ T 细胞重构。

该模型允许检查导致疾病和慢性炎症的最早免疫事件，当肠道炎症持续存在但不依赖于确定的抗原时。为了研究抗原呈递细胞 （APC） 在疾病过程中的潜在作用，采用抗原驱动的疾病模型是有帮助的，其中确定的共源抗原导致结肠炎。因此开发了一种抗原驱动的结肠炎模型。在该模型中，只能识别 OVA 蛋白中特定表位的 OT-II CD4 ⁺ T 细胞被转移到用表达 CFP-OVA 的大肠杆菌攻击的 RAG ^{- / -} 宿主中。该模型允许检查固有层中 APC 和 T 细胞之间的相互作用。

Introduction

肠道是暴露于外部环境的人体最大的表面上。居民微生物的广大阵列殖民人体的肠道内形成的肠道菌群（或微生物）。这估计是由最多百万亿微生物细胞和构成生物学^1-3知人口最稠密的细菌栖息地之一。在GIT细菌定植肠道的利基在那里生存繁衍^4。作为回报，菌群赋予了未编码它的基因组中^1个附加的功能特征的主机。例如微生物群刺激上皮细胞的增殖，通过自身产生承载不能生产维生素，调节代谢和防止病原体^4-6。鉴于这种有利的关系，一些作者认为人是"超生物体"或"holobionts"是细菌和人类基因^7,8的混合。鉴于（人）主机上的微生物的有利影响，肠道免疫系统需要耐受共生微生物，使他们能够管腔存在，而且杀了，从腔侧^9-11入侵的病原体。肠道免疫系统已开发机制无害的和潜在有害的管腔微生物来区分;然而这些机制尚未很好地理解^12。维护肠道完整性要求严格调节免疫稳态保持宽容和豁免权¹³之间的平衡。在免疫稳态不平衡有助于肠道疾病的诱导如炎性肠病^{（IBD）3,14。}

有两种主要类型的IBD:克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。患者与这些疾病通常患有直肠出血，严重腹泻和腹痛^15,16。 IBD的单一原因仍未知的，但遗传因素，环境因素和错调免疫反应的组合可能是疾病发展的¹⁵关键事件....

Protocol

小鼠繁殖并保存在乌尔姆大学（德国乌尔姆）的动物设施无特定病原体（SPF）的条件下。所有的动物实验是根据当地的动物使用和保护委员会和国家动物福利法的指导进行。

1. pCFP-OVA质粒的构建

1. 扩增使用引物Ova_SpeI_fw（3'- GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5'）和Ova_ClaI_rev（3'- ^{GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5'）37}使用质粒的pCI-OVA（氨苄青霉素抗性^）42作为模板的完整大小的OVA基因。克隆PCR产物（ 即 OVA编码序列）转换成使用引物和载体的SpeI位和ClaⅠ位限制位点，得到OVA特异性质粒市售噬菌体中间载体。
2. 用质粒垫₁强组成型启动子P _超一起放大CFP编码基因 -cCFP（氯霉素抗性^）43作为模板和引物CFP_SacII_fw（3'- GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5'）和CFP_SpeI_rev（3'- ^{GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5'）37。}

Results

要建立抗原驱动结肠炎模型中的E.大肠杆菌菌株 已构建了包含在其中在强组成型启动子P _超 （ 图1A）的控制被表示为在CFP的基因融合到为鸡卵清蛋白和所述融合构建体的编码序列的质粒。荧光显微镜显示重组大肠杆菌大肠杆菌 pCFP-OVA，但不是亲本大肠杆菌大肠杆菌 DH10B，表达CFP（ 图1B）。 CFP-OVA-生产E.大肠杆菌是能够激活体外的OT-II细胞和诱导的IFN-γ产生相反大肠杆菌大肠杆菌菌株表达CFP只（ 图2）。 图3A示出的CX ₃ CR1 ^{GFP / +}小鼠的结肠组织与E.供给体外三维共焦成像大肠杆菌 pCFP-OVA。E.大肠杆菌 pCFP.......

Discussion

与所有其他的模式，上述的抗原驱动结肠炎模型可呈现在执行该技术的研究者必须意识到几个问题。当注射OT-II /红⁺ CD4 ⁺ T CD62L ⁺细胞在主机上，研究者必须非常温柔细心针插入腹腔。不这样做可能会导致在小鼠可能导致死亡，或这将不会引起任何疾病的细胞的皮下给药的肠的撕裂。

通常情况下，老鼠会在细胞转移后的第一周体重增加。研究者应当在每个重量时间点，同时权衡小鼠和使用在整个过程中同样重的平衡。有时实验小鼠中，尤其是当在实验开始时其重量低于18克，不发展的消耗综合征的任何迹象。然而，这些动物mighŧ还是发展的宏观评价下显著肠道炎症。

当转基因细菌的工作，可发生污染。为了避免这些问题，我们强烈建议检查大肠杆菌通过荧光显微镜来分析，如果细菌荧光并杆状（典型的大肠杆菌形状）表达CFP-OVA。

所提出的抗原从动结肠炎依赖于观察到在稳定状态，并且在炎性病症^36,3.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB 肉汤，米勒 （Luria-Bertani）	Difco	244620
旋转摇床	Reiss Laborbedarf e. K.	3020 型 GFL
2 mm 间隙比色皿	Peqlab Biotechnologie GmbH	71-2020
油	Sigma-Aldrich	G5516-100ML
基因脉冲器 Xcell 系统	BioRad Laboratories GmbH	1652660
LB 琼脂，Miller （Luria-Bertani）	Difco	244510
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A9393-5G
SOC 培养基	Sigma-Aldrich	S1797-100ML
高纯质粒分离试剂盒	Roche	11754777001
琼脂糖	Carl Roth GmbH &Co	3810.1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
冰醋酸	Sigma-Aldrich	537020
凝胶室	PEQLAB Biotechnology GmbH	40-0708
加载染料	Thermo Fisher	R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher	SM0312
溴化乙锭溶液	Carl Roth GmbH & Co. KG	2218.3
照片记录系统	Decon Science Tech GmbH	DeVision G
DNA 测序	MWG-Biotech GmbH
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Biochrom	L182-50
荧光显微镜	Zeiss	HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra 系统	Bio-Rad Laboratories GmbH	1658005
PageRuler 预染蛋白质分子量标准	Fermentas， St. Leon-Rot， 德国
IstanBlue Solution	Expedeon， 剑桥郡， 英国
硝酸纤维素膜	Macherey-Nagel GmbH & Co. KG	741280
电转印仪	Biometra GmbH	846-015-600
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A6003-25G
抗卵清蛋白抗体	Abcam	ab181688
抗兔 IgG HRP	Sigma-Aldrich	A0545
Pierce ECL Plus 蛋白质印迹底物	Pierce Biotechnology， Thermo Fischer Scientific Inc	32132
Forene	Abbott	2594.00.00
FBS	Invitrogen	10500-064
Falcon 细胞过滤器	Fischer Scientific	08-771-2
氯化铵	Sigma-Aldrich	254134-5G
Tris 碱	Sigma-Aldrich	10708976001
CD4+ CD62 L+ T 分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-093-227
MACS LS 色谱柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MS 色谱柱	Miltenyi Biotec	130-042-201
MidiMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-302
MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
饲喂针 20G	SouthPointe Surgical Supply， Inc	FN-7903
福尔马林溶液，中性缓冲，10%	Sigma-Aldrich	HT501128
石蜡	Sigma-Aldrich	1496904
苏木精	Sigma-Aldrich	H9627
伊红 Y	Sigma-Aldrich	230251
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D9779
胶原酶 VIII 型	Sigma-Aldrich	C-2139
罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 培养基	AppliChem	A2044， 9050
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	438456
小鼠 BD Fc 块	BD Pharmingen	553141
FITC偶联的mAb结合Vß 5.1， 5.2	BD Pharmingen	553189
APC 偶联的 mAb 结合 CD4 GK1.5	eBioscience	17-0041-83
FACS 口径	BD Biosciences
FCS Express V3 软件	DeNovo
Meta 扫描共聚焦显微镜	蔡司	LSM 710
Zeiss 工作站	Zeiss	LSM 7
Zeiss ZEM 软件	蔡司	v4.2.0.121
Maxisorp 免疫板	NUNC， Roskilde	442404
链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶	Jackson Immuno Research	016-050-084
碱性磷酸酶底物 4-硝基苯基磷酸二钠盐 六水合	Sigma-Aldrich	71768-5G
mAb R4-6A2	BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2	BD Biosciences	554410
TECAN微孔板-ELISA读数仪	Tecan
EasyWin软件	Tecan
DNase I重组		4536282001