基于气动液滴操控平台的多位点核苷酸多态性可视化比色检测

摘要

本研究展示了一种在气动液滴操控平台上检测多位点核苷酸多态性的简单且可视化的方 法。利用该方法，整个实验过程（包括液滴操控和多位点核苷酸多态性检测）均可在接近23 °C的条件下完成，无需借助复杂的仪器设备。

摘要

一种简单且可视化的多核苷酸多态性（MNP）检测方法在开放表面上的气动液滴操控平台上实现。该比色法DNA检测基于杂交介导的金纳米粒子探针（AuNP探针）生长原理。AuNP的生长尺寸和构型由与探针杂交的DNA样本数量决定。根据纳米粒子特有的尺寸和形貌依赖性光学性质，可区分样本DNA片段与探针之间的错配数量。实验分别通过含有试剂和DNA样本的液滴进行，在气动平台上利用柔性PDMS基超疏水膜的可控气动吸力实现液滴的传输与混合。在所提出的气动平台上，可在开放表面同时且精确地递送液滴，该平台具有高度生物相容性，对液滴内的DNA样本无任何副作用。结合上述两种方法，可在气动液滴操控平台上直接通过肉眼检测多核苷酸多态性，无需额外仪器。从将液滴装载到平台至获得最终结果的整个过程耗时不到5分钟，远短于现有方法。此外，该联合MNP检测方法每次操作仅需10 µl样本体积，显著少于宏观系统所需体积。

引言

单核苷酸多态性（SNP）是指DNA序列中单个碱基对的差异，是最常见的遗传变异之一。目前研究表明，SNP可通过影响基因功能，与个体的疾病易感性、药物疗效及不良反应相关。^1,2 近期研究还发现，双点或多点突变（多核苷酸多态性）可导致特定疾病以及个体在疾病效应上的差异。^3,4 因此，在疾病初筛中检测核苷酸多态性至关重要。在过去二十年中，针对序列特异性寡核苷酸的快速检测，已开发出多种简单且高效的方法。^1,5 目前鉴定DNA突变的常用方法通常包括探针固定、荧光标记、凝胶电泳等步骤。 等等。,^6,7 但这些方法通常需要较长的分析过程、昂贵的仪器设备、经过良好培训的技术人员，以及大量消耗样品和试剂。

具有较大表面积与体积比以及独特理化性质的纳米颗粒，是用于特异性生物标志物高灵敏度、低成本检测的理想材料。金纳米颗粒（AuNP）因其易于与寡核苷酸探针进行修饰，在DNA检测中得到了广泛应用^8-10。基于AuNP的单核苷酸多态性（SNP）检测技术也已被开发出来^11-13。在本研究中，我们采用了一种新颖的比色法，通过DNA杂交介导的AuNP探针生长来检测多位点核苷酸多态性（MNP）¹⁴。该方法基于与AuNP结合的单链DNA（ssDNA）或双链DNA（dsDNA）长度不同，会影响AuNP的生长尺寸和形态这一原理（见图1）¹⁵。这种DNA检测方法具有试剂消耗量少、检测时间短（数分钟内）、操作简便且无需温度控制等优点，有望应用于临床诊断和家庭医学筛查。

已开发出多种用于检测DNA序列的微流控系统¹⁶；这些微流控系统由传统实验方案演变而来，所需大型设备更少，且简化了实验流程，从而提高了DNA生物传感器的灵敏度、检测限和特异性。然而，微流控系统中的DNA检测方法仍需要后续处理仪器，例如使用聚合酶链式反应（PCR）仪进行信号扩增，以及使用荧光读取仪进行单次读出，以识别异源单核苷酸多态性（SNP）^17,18。因此，开发一种无需后续处理即可直接读取多位点核苷酸多态性结果的简易平台具有重要意义。与广泛使用的传统封闭式微流控系统相比，开放式表面微流控装置展现出若干优势，例如清晰的光学路径、便于接触样品、直接与环境相通，以及通道内不易产生空化或界面阻塞¹⁹。我们前期工作介绍了一种用于开放式表面液滴操控的简易气动平台（见图2）²⁰。在该平台上，液滴可在无驱动能量干扰的情况下，通过负压作用实现同步传输与操控，在生物和化学应用中具有广阔前景。因此，该气动平台被结合比色法，利用DNA杂交介导的金纳米粒子（AuNP）探针生长原理，用于实现DNA样本的多位点核苷酸多态性（MNP）检测操控。

本文所述方案介绍了一种在开放表面的气动液滴操控平台上对多位点核苷酸多态性进行简单可视化检测的方法。本研究证实，多位点核苷酸多态性可通过肉眼直接检测；所提出的气动平台适用于生物学和化学领域的应用。

方案

1. 检测磁性纳米粒子的方法

注意：本节描述了基于杂交介导的金纳米颗粒生长来检测磁性纳米粒子（MNP）的实验步骤。

1. 制备探针DNA（5'-硫醇-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3'）溶液，浓度为100 µM。
2. 制备探针DNA修饰的金纳米颗粒（AuNP探针）颗粒。²¹
   注意：此处使用的体积取决于探针DNA修饰的金纳米颗粒（AuNP探针）颗粒的需求量，因此与拟进行的实验次数相关。我们通常会额外制备一些AuNP探针颗粒作为备用。这些步骤中使用的体积可根据需要灵活调整。
   1. 将探针DNA（100 µM，步骤1.1中制备）加入到金纳米颗粒溶液（13 nm，17 nM）中，终浓度为1 OD/ml。
   2. 调节十二烷基硫酸钠（NaC₁₂H₂₅SO₄，SDS）和磷酸盐缓冲液（PBS）的终浓度分别为0.01%和0.01 M。
   3. 20分钟后，用NaCl溶液（2 M）和PBS（0.01 M）将氯化钠（NaCl）浓度调至0.05 M，同时保持SDS浓度为0.01%，继续孵育20分钟。
   4. 每隔20分钟逐步增加NaCl浓度，每次增加0.1 M，直至终浓度达到1 M。
   5. 在23 °C下于涡旋混合器上振荡孵育过夜。只要DNA样品与AuNP探针能够发生杂交，振荡速度对实验结果无显著影响。
   6. 以7,000 × g离心金纳米颗粒30秒，弃去上清液。
3. 将AuNP探针颗粒加入去离子水（DI水）中，使其终浓度为25 nM（AuNP探针溶液）。
4. 制备目标DNA样品（完全互补序列：5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3'；三对碱基错配序列：5'-CTTGCCTACTTTACCAGCTC-3'；六对碱基错配序列：5'-CTTGCCTTTTTTTCCAGCTC-3'），浓度分别为0.06、0.11、0.17、0.20、0.30、0.50 µM。
5. 将AuNP探针溶液（6 µl，25 nM）加入DNA样品（350 µl）中，并加入NaCl至终浓度为14 µM。
6. 在23 °C下使用涡旋混合器振荡DNA样品与AuNP探针的混合物5分钟，以促进DNA杂交。
7. 进行AuNP生长时，向溶液（DNA样品与AuNP探针的混合物）中加入NH₂OH（6 µl，400 mM）和HAuCl₄ （6 µl，25.4 mM）。AuNP的生长过程约需30秒完成，颜色的稳定变化可持续1小时以上。
   警告：HAuCl₄与皮肤接触可能产生严重毒性作用。使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。操作HAuCl₄时请佩戴手套并在通风橱中进行。

2. 气动液滴操控平台的制备

注意：基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的液滴操控平台包含两个部分：具有超疏水表面的PDMS膜（100 µm）和气流通道层（5 mm）。该装置无需微机电系统（MEMS）工艺，而是采用常规加工方法制备，包括使用计算机数控（CNC）微加工技术制作模具、采用PDMS浇铸与复制技术快速原型化微流控组件，以及利用激光微加工技术制备超疏水表面（见图3）。

1. 使用配备有钻头（0.5 mm）的数控机床（CNC）制备具有微结构的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）母模（见图3）。钻头进给速度为7 mm/sec，转速为26,000 rpm。使用气流吹扫和去离子水（DI水）清除PMMA碎屑，并清洗母模表面。
2. 按10:1的比例配制聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底与固化剂的混合物。将混合物置于真空干燥器中脱气30分钟，直至所有气泡完全去除。
3. 将PDMS倒入母模中，并在60 °C烘箱中加热固化3小时，以获得气室（PDMS膜）和气流通道（PDMS层）的反向微结构。
4. 手动从母模上剥离PDMS层。在PDMS层上打孔，作为负压进气口。
5. 将PDMS膜、PDMS层和玻璃基底放入氧气等离子体处理系统的腔室内。经氧气等离子体处理后，在热板上（90 °C）加热10分钟，使PDMS膜、PDMS层与玻璃基底键合为一体。
6. 将复合芯片放入激光切割机中（PDMS膜面朝上）。导入.dwg文件以定义超疏水区域（15 mm × 12 mm），见图3。使用CO₂激光机直接在PDMS膜上进行雕刻，形成超疏水区域（激光功率12 W，扫描速度106.68 mm/sec）。
7. 用去离子水清洗超疏水表面，以去除表面碳化残留物。
8. 通过电磁阀连接负压进气口与真空泵（见图4）。将电磁阀连接至计算机，并使用数字I/O USB模块进行控制。

3. 气动平台上MNP检测的操作步骤

注意：本节描述了在气动液滴操控平台上通过比色法快速鉴定磁性纳米粒子（MNP）的操作步骤（见图5）。所有步骤均在23 °C（室温）和85%相对湿度下进行。

1. 将目标 DNA 样品液滴（10 µl，0.5 µM）置于气动液滴操控平台的超疏水区域。
2. 将 AuNP 探针液滴（10 µl，25 nM）置于气动液滴操控平台的超疏水区域。
3. 通过电磁阀和简单程序（例如，Labview）控制空气抽吸，使 PDMS 膜发生偏转。对 PDMS 膜上液滴迁移路径上的各个气室提供空气抽吸（分别包含目标 DNA 和 AuNP 探针的液滴），使液滴相互碰撞并融合。使用真空泵的工作压力为 -80 kPa（表压）。
   1. 或者，只要液滴充分混合，也可手动控制空气抽吸。在测试初期，手动连接或断开真空泵与气室入口之间的管路。
4. 通过电磁阀控制系统调节空气抽吸，使融合后的液滴前后滚动 3 分钟，以提高混合效率。目标 DNA 与 AuNP 探针在 3 分钟内充分混合并发生杂交。驱动频率和工作压力分别为 5 Hz 和 -80 kPa（表压）。
5. 将含有 NH₂OH（2 µl，400 mM）和 HAuCl₄（2 µl，25.4 mM）的液滴置于气动液滴操控平台的超疏水区域。
6. 控制空气抽吸（-80 kPa 表压），使液滴相互碰撞并融合。然后控制空气抽吸（5 Hz 和 -80 kPa 表压），使融合后的液滴前后滚动 1 分钟，以增强混合效率。
7. 用肉眼观察并记录融合液滴的颜色。

结果

本研究采用一种简单且新颖的方法，通过DNA杂交介导的AuNP探针生长来检测三种DNA样本。探针DNA及三种DNA样本（分别为与探针DNA完全互补的CDNA、含有三个碱基对错配的TMDNA和含有六个碱基对错配的SixMDNA）的序列见方案步骤1。本实验中测试的DNA样本相对于探针的错配位点均位于DNA序列的中间区域。图6展示了不同浓度下各DNA样本对应的AuNP生长溶液的颜色变化。对于完全匹配的DNA（CDNA），溶液颜色随DNA浓度增加，由粉红色变为靛蓝色，最终变为透明；对于TMDNA，溶液颜色由粉红色变为深紫色，再变为靛蓝色；而对于SixMDNA，溶液颜色则随DNA浓度增加由粉红色变为深粉红色。不同DNA样本与探针DNA的杂交亲和力各不相同，导致AuNP生长程度不同，从而产生不同的溶液颜色。TMDNA样本相对于探针存在三个碱基对突变，其杂交亲和力低于CDNA样本，因此AuNP的生长尺寸较小。如图6所示，CDNA与TMDNA样本之间的颜色差异明显，尤其在较高DNA浓度下更为显著。由于与探针存在大量错配，S...

讨论

在本实验方案中，可在微量离心管中采用一种简单的比色法检测MNP，检测浓度范围为0.11–0.50 µM。此外，所提出的MNP检测方法在气动液滴操控平台上进行，该平台在DNA筛查及其他生物医学应用中具有广阔前景。实际应用中，样品DNA的可检测范围取决于操作平台的混合效率。为确保融合后的液滴充分混合，本方案中的关键步骤是控制空气抽吸（压力和频率），其参数需根据融合液滴的大小进行调节。对于较长的DNA序列片段，完全互补的样品DNA与错配的样品DNA之间的杂交亲和力差异难以通过肉眼区分。因此，该检测技术的局限性在于样品DNA的片段长度。对于含有长DNA序列的样品，AuNP的生长尺寸或构象与含有不同错配的多种DNA样品相似。在本方案中，DNA样品与探针的错配位于序列的中间区段。当样品DNA长度相同且为同源错配时，错配的位置仍可能影响其与探针的杂交亲和力以及AuNP的生长尺寸。目前许多疾病已被追溯至特定的缺陷基因，针对特定疾病的基因组数据库仍在不断扩展和完善。一旦确认特定DNA片段的序列变异与某种疾病相关，即可设计特异性探针（选择适当的DNA长度和错配位置），结合本研究已验证的检测条件，在可检测浓度范围内测定样品DNA与探针之间的错配数量。

...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Dow Corning	SYLGARD 184
台式雕刻机	Roland DG	EGX-400
激光切割机	Universal Laser Systems, Inc.	VLS 3.50
氧气等离子体处理系统	Femto Science Inc. Korea	CUTE-MPR
电磁阀			自制
真空泵	ULVAC KIKO, Inc.	DA-30D
13 nm 金纳米颗粒溶液（AuNP）	TAN Bead Inc., 中国台湾	NG-13
DNA（5'端硫醇标记）	MDBio, Inc., 中国台湾
磷酸盐缓冲液（PBS）	UniRegion Bio-Tech,. 中国台湾	PBS001-1L
十二烷基硫酸钠（SDS）	J. T. Baker	4095-04
羟胺溶液（NH2OH）	Sigma-Aldrich	467804
氯金酸（HAuCl4）	Sigma-Aldrich	G4022
氯化钠（NaCl）
涡旋混合器	Digisystem Laboratory Instruments Inc.	VM-2000
离心机	Hermle Labortechnik GmbH.	Z 216 MK