在气动操纵液滴平台多核苷酸多态性的视觉比色法检测

Summary

这项工作提出了一个简单直观的方法来检测气动操纵液滴平台的多核苷酸多态性。与所提出的方法中，在整个实验，包括液滴操作和多核苷酸多态性检测，可以接近23°C不先进仪器的帮助下进行。

Abstract

是在一个开放的表面上液滴的气动操纵平台进行一个简单直观的方法来检测多核苷酸多态性（MNP）。这种方法比色检测DNA的基础上金纳米粒子探测器（探头金纳米粒子）的杂交介导的生长。该金纳米粒子的生长尺寸和结构通过与探针杂交的DNA样品的数量支配。根据纳米颗粒的具体大小 - 和形状依赖性的光学特性，错配的在样品DNA片段与探针的数目是能够被区分。试验是分别通过含有试剂和DNA样品的液滴中进行，被运送并与基于PDMS柔性超疏水性膜的受控气动吸入混合气的平台上。液滴可以同时并准确传递一个开放表面上所提出的气动平台，是没有副作用EFF高度的生物相容性液滴内的DNA样品的等。两个提出的方法相结合，该多核苷酸多态性可在视线气动液滴操纵平台上被检测;没有额外的仪器是必需的。从平台到最终结果上安装的液滴的步骤需要不到5分钟，比用现有方法少得多。此外，该组合MNP检测方法仅需要10微升，在每个操作中，这比一个宏系统的显着更小的样品体积。

Introduction

单核苷酸多态性（SNP），这是在DNA序列的单碱基对差异，是最常见的遗传变异之一。目前的研究报告，单核苷酸多态性与疾病风险，药效和通过影响基因功能的个人副作用有关^。1,2-最近的研究还表明，双或多点突变（多核苷酸多态性）引起特定疾病和个体在疾病的影响差异^。3,4核苷酸多态性的检测是因此病预检势在必行。为快速检测序列特异性寡核苷酸的简单而有效的方法，在过去的二十年是高度发达的^1,5电流的方法来识别DNA突变通常涉及程序，包括探针固定，荧光标记，凝胶电泳等 ^，6,7但这些方法一般需要很长的分析过程，expen西伯设备，训练有素的技术人员，以及样品和试剂的消耗显著。

与表面积与体积和独特的物理化学性质的大比率的纳米粒子是作为用于特定的生物标记物的高灵敏度和廉价的检测平台的理想材料。金纳米颗粒（金纳米粒子）被广泛用于DNA检测的，因为它们的大能力与寡核苷酸探针进行修改^。8-10 SNP检测技术是使用金纳米粒子还开发^11-13在这项工作中，我们采用了一种新颖的比色方法检测多核苷酸多态性（MNP）通过¹⁴金纳米粒子探针的DNA杂交介导的生长，这种简单的和快速的探测方法是基于这样的理论缀合到单链DNA（ssDNA）或双链DNA（dsDNA）的的不同长度金纳米粒子影响金纳米粒子的生长的大小和形状（参见图

Protocol

1.检测方法MNP

注意:本节介绍了一种基于金纳米粒子的杂交介导的生长检测MNP的过程。

1. 制备探针DNA（5'-硫醇GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3'）的浓度为100μM的溶液。
2. 准备探针DNA修饰的金纳米粒子（金纳米粒子探针）的颗粒^。21
   注意:此处所用的量取决于探针DNA修饰金纳米粒子（金纳米粒子探针的）颗粒的要求。它因此是依赖于要进行的实验次数。我们通常超额准备金纳米粒子探测器粒子作为备用。在这些步骤中使用的体积是可调的和灵活的。
   1. 在浓度为1 OD /毫升（100μM，在步骤1.1中制备）添加探针DNA金纳米颗粒的溶液（13纳米，17纳米）。
   2. 带来十二烷基硫酸钠的最终浓度（NAC ₁₂ H ₂₅ SO _4，SDS）和磷酸盐缓冲液（PBS）中，以0.01％和0.01男，respectivel年。
   3. 20分钟后，带来的氯化钠（NaCl）浓度为0.05M的用NaCl（2M）和PBS（0.01M），同时维持在0.01％SDS的溶液中，并孵育20分钟。
   4. 增加的0.1M的增量NaCl浓度至1M在20分钟的时间间隔的终浓度。
   5. 与在23℃下在涡旋混合器上振摇孵育过夜。摇动速度不只要DNA样品和金纳米粒子探针成为杂交影响实验。
   6. 离心金纳米颗粒在7000×g离心....

Results

在这项工作中，三种DNA样品使用检测的简单且新颖的方法通过金纳米粒子探针的DNA杂交介导的生长测试。探针DNA和三种DNA样本的序列，具体而言，CDNA（完全互补的探针DNA），TMDNA（三碱基对的错配的DNA），和SixMDNA（6个碱基对的错配的DNA）的协议步骤1中列出。此处所测试的DNA样品的探针的错配是无论在DNA样品的中间段。 图6示出了用于在不同的浓度的DNA样品的生长金纳米粒子溶液的颜色。对于完全匹配DNA（CDNA），解决方案的色调从粉红到靛蓝变化，然后以透明随着DNA浓度。为TMDNA，溶液的颜色从粉红到暗紫色变为再到靛蓝，和用于SixMDNA，颜色从粉红变为暗粉色随DNA浓度。单独的Ð NA样本具有不同的杂交亲和力导致金纳米粒子的不同的增长规模和解决方案的多样色彩的探针DNA。的TMDNA样品，与从探针三碱基对的突变，具有比所述cDNA样品，这引起了金纳米粒子的较小的生长尺寸杂交亲和力更小。如在图6的结果显示，有cDNA和TMDNA样品之间的颜色的差别，特别是在一个大的DNA浓度。.......

Discussion

在这个协议中，一个简单的比色方法检测MNP可以在浓度范围为0.11-0.50微米的微离心管中实现。此外，所提出MNP检测方法上的充气液滴操作平台，该平台具有用于DNA筛查和其它生物医学应用的高电位下进行。在实践中，样品DNA浓度的可检测范围取决于的操作平台的混合效率。以确保该聚结的液滴充分混合，在该协议中的关键步骤是依赖于聚结液滴的大小吸气（压力和频率）的控制。完全互补的样本DNA和不匹配的样本DNA之间的杂交的亲和力的差异，很难用肉眼辨别为一个长的DNA序列片段。这种检测技术的局限性是，因此样品DNA的片段长度。对于长期DN样本一个序列，尺寸或生长金纳米粒子的构象类似于含有各种错配多种多样的DNA样品。 DNA样品与探针的错配出现在这个协议中的中间段。具有相同的长度和样本DNA的同聚不匹配，错配的位置也可能影响金纳米粒子的杂交亲和力和生长的大小。许多疾病，目前正在追查到特定的基因缺陷。对特定疾病的基因组数据库仍在扩大和提高。一旦特定的DNA片段的DNA序列变异被证实是负责特定疾病，专门设计的探针（具有适当的长度和该DNA的错配位置）可以被用于获取样本DNA的错配的数量的基础上可检测的浓度范围内探测在这项工作中已经测试。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	道康宁	SYLGARD 184
台式雕刻机	Roland DG	EGX-400
激光切割机	Universal Laser Systems， Inc.	VLS 3.50
氧气等离子体处理系统	Femto Science Inc. 韩国	CUTE-MPR
电磁阀			国产
真空泵	ULVAC KIKO， Inc.	DA-30D
13 nm AuNP 溶液	TAN Bead Inc.，台湾	NG-13
DNA（含 5'-末端标记的巯基）	MDBio， Inc.，台湾
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	单一地区 生物技术，.台湾	PBS001-1L
十二烷基硫酸钠 （SDS）	J. T. baker	4095-04
羟胺溶液 （NH2OH）	Sigma-Aldrich	467804
氯酸 （HAuCl4）	Sigma-Aldrich	G4022
氯化钠 （NaCl）
涡旋混合器	Digisystem Laboratory Instruments 公司	VM-2000
离心机	Hermle Labortechnik GmbH.	Z 216 MK