设计和使用低成本自动化病态恒定器在抗生素药物选择压力下进行细菌的适应性进化

摘要

我们描述了一种低成本、可配置的病态恒定器，该装置通过动态调节药物浓度，实现对抗生素耐药性的表征。该设备可与多重微流控平台集成，该方法可扩展用于实验室中的抗生素耐药性研究。

摘要

我们描述了一种低成本、可配置的病态恒化器，用于表征抗生素耐药性的进化途径。病态恒化器是一种细菌培养装置，能够持续监测细菌生长，并动态调整药物浓度，以在细菌进化获得耐药性过程中持续施加选择压力。该装置的工作体积约为10 ml，具备完全自动化功能，配备光密度检测系统以及用于培养基和药物输送的微泵。为验证该平台的有效性，我们测量了大肠杆菌（Escherichia coli）MG 1655逐步获得甲氧苄啶耐药性的过程，并将该装置与多重微流控平台整合，以研究细胞形态和抗生素敏感性。该方法可扩展应用于实验室中抗生素耐药性的研究，也可推广至代谢工程及其他细菌培养实验中的菌株适应性进化研究。

引言

自从第一种抗生素药物青霉素问世以来，微生物的抗生素耐药性已发展成为一项全球性健康问题¹尽管抗生素耐药性的获得可以进行回溯性研究 体内，这些实验的条件通常在整个进化过程中未能得到充分控制²或者，适应性实验室进化可用于揭示微生物物种在环境胁迫或抗生素药物选择压力下的分子进化过程。³最近，许多设计严谨的抗生素耐药性进化实验阐明了抗生素耐药性的产生机制。例如，Austin 团队在经过合理设计的微流控分隔环境中，证明了耐药性的快速出现。⁴新近开发的病态恒化器可在药物选择压力下诱导系统性突变^5,6. 莫里布多斯泰特（morbidostat）是一种微生物筛选装置，可连续调节抗生素浓度以维持近乎恒定的菌群数量，相较于微生物学中使用的波动试验，是一项重大进步^7,8在波动试验中，将抗生素以高浓度加入，筛选并计数存活的突变体。而在恒病器中，微生物持续受到药物压力，从而获得多重突变。

死亡率恒化器的工作原理类似于恒化器，后者是由 Novick 和 Szilard 于 1950 年发明的一种培养装置，通过持续供应营养物质并稀释微生物种群来维持恒定的种群数量⁹。自问世以来，恒化器已得到发展和改进。目前的微流控恒化器已达到纳升级和单细胞水平的容量。然而，这些设备不适用于适应性进化实验，因为此类实验需要较大的细胞群体以产生大量突变事件

方案

1. 病态恒化器装置的组装与预测试

1. Morbidostat 的组装
   1. 在培养管管盖上用18号注射器针头打三个孔。剪取三段长约7 cm的聚乙烯管。将这三段聚乙烯管插入管盖的孔中。
   2. 使用胶带包裹瓶盖边缘，作为聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物的模具。在150 ml塑料容器中，用牙签手动搅拌混合5 g A组分和0.5 g B组分PDMS。将混合物装入10 ml注射器中。
      1. 用注射器将PDMS混合物倒入盖子中。将整个盖子放入70 °C的烘箱中固化8小时，使PDMS完全固化。
   3. 将LED阳极与24号线径导线用烙铁焊接，将LED阴极与碳膜电阻焊接。将一个680 Ω碳膜电阻与一根24号线径导线焊接。使用电工胶带对导线连接处进行绝缘处理。
   4. 将光电探测器的集电极与24号线焊接，并将光电探测器的发射极与一个100 kΩ碳膜电阻焊接。使用绝缘胶带包裹导线连接处。
   5. 将发光二极管放置在培养瓶支架中。根据电路图进行连接。 补充材料 图2，将发光二极管连接至5 V电源供电。使用可检测红外光的数码相机确认LED是否正常工作例如， 手机摄像头
   6. 将光电探测器放入培养瓶架中。按照电路图中的指示进行操作。 补充材料 图2

结果

上述描述的耐药性动态监测仪在图1中进行了示意图展示。该耐药性动态监测仪的常规操作，包括实验性进化、抗生素敏感性测试和细胞形态检查，已在暴露于三甲氧苄啶（trimethoprim, TMP）的E. coli MG1655培养物中得到验证；TMP是一种常用的抗生素药物^5,6。TMP可诱导产生非常显著的逐步递增的耐药性，且相关突变集中在二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）基因周围。因此，TMP是验证耐药性动态监测仪运行效果的一种高效标准药物。每天，微生物的生长预计会超过预设的光密度阈值，从而触发药物注入，如图2a所示。药物注入后应抑制微生物生长，进而导致光密度下降。可能需要进行数次试验运行，以确定最佳药物浓度。经验上，当发现当前药物浓度无法有效抑制生长时，我们将药物培养基的浓度提高5倍。整个实验过程结束后，将每日冷冻保存的样品解冻，并用于测定IC₅₀值，即药物耐药水平的定量指标。 图2b

讨论

本文展示了一种由低成本组件构成的小型化病态恒化器装置。该装置记录的药物耐药性水平升高情况与先前报道的结果一致⁵。该装置专为药物耐药性的进化研究而设计，亦可潜在应用于许多其他实验。首先，可针对大量临床相关抗生素建立药物诱导突变的综合数据库。例如，通过简单增加实验中使用的药物数量，即可研究多重耐药性的进化路径。本文所报道模块的主要优势在于其灵活的可配置性，能够在不同实验条件下实现大规模、并行的实验操作。

尽管该概念已在微流控测量中得到验证，但通过将微流控技术与流体技术相结合，可显著提升其研究能力²³。由于试剂消耗减少和人力需求降低，每次测量的成本（规模经济）大幅下降。在此，可从微流控平台中提取单细胞形态学数据。最近，单细胞微流控形态学检测已在临床微生物学实验室中成功应用，其性能可与标准的肉汤连续稀释试验相媲美²⁴。随着微流控设备的日益普及，结合多种技术将能够实现大规模、高通量的实验室进化实验。

运行恒病培养仪（morbidostat）时有几个关键步骤。首先，由于磁力.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
环境振荡培养箱	BioSan	ES-20
Arduino Leonardo 开发板	Arduino	Leonardo
680 欧姆碳膜电阻	Digikey		LED 偏置电阻
100 k欧姆碳膜电阻	Digikey		光电晶体管偏置电阻
940 nm 发光二极管	Bright LED Electronic	BIR-BM13E4G-2	用于光密度测量
940 nm 光电晶体管	Kodenshi	ST-2L2B	用于光密度测量
达林顿对 IC 东芝	Mouser	ULN2803APG	该 IC 驱动微型泵和磁力搅拌装置
5 V 直流无刷风扇	ADDA	AD0405LX-G70	规格：5 V 供电电压，80 mA；可在 www.jameco.com 购买
压电微泵	CurieJet	PS15I-FT-5L	压力 > 3 kPa；流量 >5 ml/min
Tygon 3350 软管	Saint Gobain	ABW00001	内径：1/32"，外径：3/32"，长度：50'
磁力搅拌子	COWIE		锥形，尺寸：10 mm × 4 mm
20 ml 玻璃闪烁瓶	DGS		Pyrex 玻璃，直径 28 mm，高度 61 mm
培养瓶支架			聚甲醛定制加工
硅胶	Dow Corning	Sylgard 184	用于密封玻璃瓶
培养基瓶	VWR	66022-065
Difco M9 最小盐培养基 5×	BD		培养基
酪蛋白氨基酸	BD		培养基
葡萄糖	Sigma
细菌琼脂	Oxoid		用于制备琼脂平板
LB 培养基（Luria Bertani 培养基）
倒置显微镜	Leica Microsystems	Leica DMI-LED	用于微流控测量，使用 40× 物镜，数值孔径 NA = 0.55
显微镜培养箱	Live Cell Instrument	CU-109	用于微流控测量
电磁阀	Pneumadyne	S10MM-31-12-3	常开型，1.3 瓦，12 V 直流
USB 接口卡	Hobby Engineering	USBIO24-R 数字输入/输出模块	用于微流控测量
空气压缩机	Rocker Scientific	ROCKER 440	微流控系统的压力源；最大压力 80 psi
公鲁尔锁接头转 1/8" 插管	ValuePlastics.com	MTLL230-1	用于微流控控制
1/8" 插管转 10-32 螺纹接口	ValuePlastics.com	B-1	用于微流控控制
母鲁尔锁接头转 10-32 螺纹接口	ValuePlastics.com	KFTL-1	用于微流控控制
NPN 达林顿晶体管，500 mA，40 V（2N6427）	DigiKey.com	2N6427GOS-ND	用于微流控控制
10 k欧姆碳膜电阻，0.25 W	DigiKey.com	P10KBACT-ND	用于微流控控制
钽电容，10 μF，25 V，10%	DigiKey.com	478-1841-ND	用于微流控控制
Andor CCD 相机	Andor	Zyla 4.2 Plus SCMOS	用于芯片上微流控成像
ELISA 酶标仪
双组分硅胶	Momentive	RTV 615	用于微流控芯片制备
SU-8 光刻胶	Micrchem	SU8 2015	用于微流控芯片制备
AZ4620 光刻胶	Clariant	AZ 4620	用于微流控芯片制备
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC 32G	用于微流控芯片制备
20 号注射器针头	BD		用于微流控芯片制备
Labcycler	Sensoquest	Labcycler	PCR
DNA 聚合酶	Toyobo	KOD Plus	PCR 扩增
甲氧苄啶	Sigma
酶标仪	Biotek	Synergy H1 hybrid	抗生素抗性测量