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设计和使用低成本自动化病态恒定器在抗生素药物选择压力下进行细菌的适应性进化

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DOI：

10.3791/54426

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2016年9月27日

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1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

本文内容

摘要

我们描述了一种低成本、可配置的病态恒定器，该装置通过动态调节药物浓度，实现对抗生素耐药性的表征。该设备可与多重微流控平台集成，该方法可扩展用于实验室中的抗生素耐药性研究。

摘要

我们描述了一种低成本、可配置的病态恒化器，用于表征抗生素耐药性的进化途径。病态恒化器是一种细菌培养装置，能够持续监测细菌生长，并动态调整药物浓度，以在细菌进化获得耐药性过程中持续施加选择压力。该装置的工作体积约为10 ml，具备完全自动化功能，配备光密度检测系统以及用于培养基和药物输送的微泵。为验证该平台的有效性，我们测量了大肠杆菌（Escherichia coli）MG 1655逐步获得甲氧苄啶耐药性的过程，并将该装置与多重微流控平台整合，以研究细胞形态和抗生素敏感性。该方法可扩展应用于实验室中抗生素耐药性的研究，也可推广至代谢工程及其他细菌培养实验中的菌株适应性进化研究。

引言

自从第一种抗生素药物青霉素问世以来，微生物的抗生素耐药性已发展成为一项全球性健康问题1尽管抗生素耐药性的获得可以进行回溯性研究 体内，这些实验的条件通常在整个进化过程中未能得到充分控制2或者，适应性实验室进化可用于揭示微生物物种在环境胁迫或抗生素药物选择压力下的分子进化过程。3最近，许多设计严谨的抗生素耐药性进化实验阐明了抗生素耐药性的产生机制。例如，Austin 团队在经过合理设计的微流控分隔环境中，证明了耐药性的快速出现。4新近开发的病态恒化器可在药物选择压力下诱导系统性突变5,6. 莫里布多斯泰特（morbidostat）是一种微生物筛选装置，可连续调节抗生素浓度以维持近乎恒定的菌群数量，相较于微生物学中使用的波动试验，是一项重大进步7,8在波动试验中，将抗生素以高浓度加入，筛选并计数存活的突变体。而在恒病器中，微生物持续受到药物压力，从而获得多重突变。

死亡率恒化器的工作原理类似于恒化器，后者是由 Novick 和 Szilard 于 1950 年发明的一种培养装置，通过持续供应营养物质并稀释微生物种群来维持恒定的种群数量9。自问世以来，恒化器已得到发展和改进。目前的微流控恒化器已达到纳升级和单细胞水平的容量。然而，这些设备不适用于适应性进化实验，因为此类实验需要较大的细胞群体以产生大量突变事件10,11。最近，工作体积约为 10 ml 的微型恒化器也被开发出来，以填补升规模生物反应器与微流控恒化器之间的空白12,13。

本文介绍了用于抗生素耐药性研究的一种低成本、自动化死亡率恒定器（morbidostat）的设计与使用方法。该模块可在微生物学实验室的摇床培养箱中使用，硬件需求极低。开源固件也可轻松针对适应性进化等特定应用进行定制，例如代谢工程3。最后，该死亡率恒定器已集成到一种用于抗生素敏感性测试的多重微流控平台中14。

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方案

1. 病态恒化器装置的组装与预测试

  1. Morbidostat 的组装
    1. 在培养管管盖上用18号注射器针头打三个孔。剪取三段长约7 cm的聚乙烯管。将这三段聚乙烯管插入管盖的孔中。
    2. 使用胶带包裹瓶盖边缘，作为聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物的模具。在150 ml塑料容器中，用牙签手动搅拌混合5 g A组分和0.5 g B组分PDMS。将混合物装入10 ml注射器中。
      1. 用注射器将PDMS混合物倒入盖子中。将整个盖子放入70 °C的烘箱中固化8小时，使PDMS完全固化。
    3. 将LED阳极与24号线径导线用烙铁焊接，将LED阴极与碳膜电阻焊接。将一个680 Ω碳膜电阻与一根24号线径导线焊接。使用电工胶带对导线连接处进行绝缘处理。
    4. 将光电探测器的集电极与24号线焊接，并将光电探测器的发射极与一个100 kΩ碳膜电阻焊接。使用绝缘胶带包裹导线连接处。
    5. 将发光二极管放置在培养瓶支架中。根据电路图进行连接。 补充材料 图2，将发光二极管连接至5 V电源供电。使用可检测红外光的数码相机确认LED是否正常工作例如， 手机摄像头
    6. 将光电探测器放入培养瓶架中。按照电路图中的指示进行操作。 补充材料 图2将光电探测器连接至5 V电源供电。将导线连接至光电探测器电阻的两端，以测量电子控制板上的电压。
    7. 在散热风扇的转轴上粘贴一块磁铁，作为磁力搅拌装置。需注意，风扇转轴与培养小瓶的对齐程度，以及培养小瓶与磁铁之间的间距，对于磁力搅拌装置的正常工作至关重要。
    8. 将培养瓶的每一段聚乙烯管分别连接到对应微泵、培养基瓶和废液瓶的硅胶管上。开启泵运行1小时，测量从培养基瓶泵入培养瓶的总体积，以确定泵速。注意，典型的泵速应约为4 ml/hr，对应的稀释率为 D = 0.33 hr⁻¹。−1 用于培养管的12 ml工作体积。
    9. 将整个装置置于中型摇床培养箱（34 cm × 34 cm × 43.5 cm）中。
  2. 预测试莫里博斯泰特装置
    1. 将散热风扇的电源电压设为 5 V，以启动其电机来测试磁力搅拌子。注意，搅拌动作可通过视觉观察进行检查。驱动散热风扇电机的电压通过脉宽调制（PWM）精确控制。
    2. 制备一系列野生型 E. coli 样品在600 nm处的光密度值通常在0.07至0.3之间，用于校准。放置一个测试 E. coli 记录培养管中样品的光电探测器电压。
      1. 在酶标仪中加入约100 µl相同样品，测定其光密度。利用光电探测器电压与光密度的数据绘制校准曲线。注意，通常在此所用偏置方案下，光密度每变化1个单位，光电探测器电压约变化7.6 V。

2. 运行莫比多恒化器

  1. 开始每日实验前的准备工作
    1. 准备一个培养管，配备三根内径为1/32英寸、外径为3/32英寸的超耐化学腐蚀Tygon软管作为进液口，用于构建如第1.1节及补充图1所示的装置。
    2. 准备M9最小培养基（含0.2%葡萄糖）以及含有甲氧苄啶（TMP）药物的培养基。将培养基、培养基瓶、含药培养基瓶、废液瓶和培养管在121 °C条件下进行高压灭菌。
      注意：TMP为储备液，用于后续配制达到表1中所示浓度的含药培养基，含TMP的培养基不进行高压灭菌。
  2. 运行致死恒化器（morbidostat）
    1. 实验第一天，在室温下解冻1 ml冷冻保存的野生型E. coli MG1655细胞5分钟，取120 µl细胞转移至含有约12 ml M9生长培养基的培养管中。从第二天起，每天在室温下解冻前一天保存的1 ml冷冻E. coli细胞5分钟，取120 µl细胞转移至含有约12 ml M9生长培养基的新培养管中。
    2. 开启摇床培养箱，并将温度设定为30 °C，不进行振荡。
    3. 启动致死恒化器，打开微泵、磁力搅拌装置和光密度测量系统。
      注意：运行过程中采用反馈阈值算法控制药物注入。当测得的光密度超过预设阈值时，药物注入泵启动，同时培养基泵关闭；否则药物注入泵保持关闭，培养基泵持续运行。
    4. 定时监测电压变化，以确认微生物的生长情况。
      注意：由于反复冻融循环，E. coli细胞每天生长时会出现约4小时的延迟。
    5. 约23小时后，关闭微泵的供电电压，取出培养管。向培养管中加入15%甘油，并将样品在-80 °C下冷冻保存。
    6. 重复步骤2.2.1至2.2.5。

3. 96 孔板格式中的抗生素敏感性测定

注意：使用96孔板读板仪进行生长速率测定，以确定抗生素抗性水平。

  1. 将每日冷冻样品在室温下解冻 5 分钟，取 15 µl 细胞转移至含有约 15 ml M9 培养基的培养管中。培养至 600 nm 处的光密度达到约 0.1。将 15 ml 培养物分装至 1 ml 瓶中，并在此步骤中加入 TMP 药物，以获得如表 1所示的目标药物浓度。
  2. 从步骤 3.1 中取 200 µl 样品，加入酶标仪的每个孔中，培养 12 小时5。在检测过程中，600 nm 波长处的光密度将自动记录。
    注意：每个数据点均进行三次重复测量并取平均值，以确保数据的一致性。光密度随时间变化的数据可用于计算生长速率。
  3. 绘制生长速率随药物浓度变化的曲线，以确定 IC50。注意，IC50 定义为生长速率降至最大生长速率的 50% 时所对应的药物浓度5。

4. 微流控装置中单细胞形态与抗生素敏感性的测量

  1. 按照文献所述方法15，通过多层软光刻技术使用PDMS制备微流控装置。
    1. 采用光刻技术制备控制层和流动层的光刻胶模具。注意，对于控制层，使用负性光刻胶（约15 µm高度）和正性光刻胶（约8 µm高度），在洁净硅片上制作模具。
    2. 分别以5:1和20:1的交联比例配制用于控制层和流动层的PDMS混合物。将混合物置于真空干燥器中脱泡1小时。
    3. 将硅片上的控制层光刻胶模具暴露于三甲基氯硅烷（TMCS）蒸气中。通过将PDMS混合物（交联比例5:1）浇铸在控制层光刻胶模具的硅片上，制备厚度约为6 mm的控制层。在烘箱中80 °C条件下烘烤40分钟，持续1小时。
    4. 通过旋涂PDMS混合物（交联比例20:1，转速3,000 rpm，持续60秒）在流动层光刻胶模具上制备流动层。在烘箱中80 °C条件下烘烤30分钟，持续1小时。
    5. 使用剃刀将控制层切割成所需芯片尺寸（通常为3 cm × 2 cm），并手动剥离控制层。将控制层置于流动层上方，并在体视显微镜下进行对齐。将对齐后的组件在80 °C烘箱中固化过夜。随后，将组件浸泡在塑料容器中的250 ml去离子水中5小时，以溶解残留的TMCS。
    6. 接着，使用20 G针头打出入孔，并通过空气等离子体处理（气压1.2 Torr，处理40秒）将整个弹性体键合至涂有空白PDMS层的玻璃载片上（PDMS交联比例5:1，转速2,000 rpm，持续30秒）。
    7. 在80 °C条件下长时间烘烤36小时，以降低PDMS的细胞毒性。注意，此烘烤步骤对于最小化对细菌细胞的毒性至关重要。
  2. 芯片上生长实验
    1. 在将样品加载至微流控装置前，先用去离子水冲洗1小时，再用M9培养基冲洗1小时。
    2. 在室温下解冻当日冷冻样品5分钟，并接种至含有新鲜M9培养基的新试管中。将样品置于37 °C摇床培养箱中过夜培养。
    3. 用M9培养基将微生物样品稀释10倍，并通过将微生物样品容器加压至5 psi将其加载至微流控装置中。然后通过将药物培养基容器加压至5 psi，将TMP药物培养基加载至芯片中。通过驱动微流控芯片上两个腔室之间的微机械阀15分钟，实现微生物与药物的混合。
    4. 将微流控芯片置于倒置显微镜上的显微镜培养箱中。使用安装在倒置显微镜上的CCD相机，每小时采集一次生长腔内的细胞图像，持续8小时。
    5. 使用自定义程序脚本，基于细胞图像数据的阈值算法计算细胞数量18。注意，细胞数量数据通常在三个微流控腔室上取平均值。

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结果

上述描述的耐药性动态监测仪在图1中进行了示意图展示。该耐药性动态监测仪的常规操作，包括实验性进化、抗生素敏感性测试和细胞形态检查，已在暴露于三甲氧苄啶（trimethoprim, TMP）的E. coli MG1655培养物中得到验证；TMP是一种常用的抗生素药物5,6。TMP可诱导产生非常显著的逐步递增的耐药性，且相关突变集中在二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）基因周围。因此，TMP是验证耐药性动态监测仪运行效果的一种高效标准药物。每天，微生物的生长预计会超过预设的光密度阈值，从而触发药物注入，如图2a所示。药物注入后应抑制微生物生长，进而导致光密度下降。可能需要进行数次试验运行，以确定最佳药物浓度。经验上，当发现当前药物浓度无法有效抑制生长时，我们将药物培养基的浓度提高5倍。整个实验过程结束后，将每日冷冻保存的样品解冻，并用于测定IC50值，即药物耐药水平的定量指标。 图2b

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讨论

本文展示了一种由低成本组件构成的小型化病态恒化器装置。该装置记录的药物耐药性水平升高情况与先前报道的结果一致5。该装置专为药物耐药性的进化研究而设计，亦可潜在应用于许多其他实验。首先，可针对大量临床相关抗生素建立药物诱导突变的综合数据库。例如，通过简单增加实验中使用的药物数量，即可研究多重耐药性的进化路径。本文所报道模块的主要优势在于其灵活的可配置性，能够在不同实验条件下实现大规模、并行的实验操作。

尽管该概念已在微流控测量中得到验证，但通过将微流控技术与流体技术相结合，可显著提升其研究能力23。由于试剂消耗减少和人力需求降低，每次测量的成本（规模经济）大幅下降。在此，可从微流控平台中提取单细胞形态学数据。最近，单细胞微流控形态学检测已在临床微生物学实验室中成功应用，其性能可与标准的肉汤连续稀释试验相媲美24。随着微流控设备的日益普及，结合多种技术将能够实现大规模、高通量的实验室进化实验。

运行恒病培养仪（morbidostat）时有几个关键步骤。首先，由于磁力...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢许士璧教授和郑珍珍女士在理论分析和数值模拟方面提供的有益讨论和帮助。Y. T. Y. 感谢台湾科技部门资助项目编号为 MOST 103-2220-E-007-026 和 MOST 104-2220-E-007-011 的经费支持，以及中国台湾清华大学资助项目编号为 103N2042E1、104N2042E1 和 105N518CE1 的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
环境振荡培养箱BioSanES-20
Arduino Leonardo 开发板ArduinoLeonardo
680 欧姆碳膜电阻DigikeyLED 偏置电阻
100 k欧姆碳膜电阻Digikey光电晶体管偏置电阻
940 nm 发光二极管Bright LED ElectronicBIR-BM13E4G-2用于光密度测量
940 nm 光电晶体管Kodenshi ST-2L2B用于光密度测量
达林顿对 IC 东芝MouserULN2803APG该 IC 驱动微型泵和磁力搅拌装置
5 V 直流无刷风扇ADDAAD0405LX-G70规格：5 V 供电电压，80 mA；可在 www.jameco.com 购买
压电微泵CurieJetPS15I-FT-5L压力 > 3 kPa；流量 >5 ml/min
Tygon 3350 软管Saint GobainABW00001内径：1/32"，外径：3/32"，长度：50' 
磁力搅拌子COWIE锥形，尺寸：10 mm × 4 mm
20 ml 玻璃闪烁瓶DGSPyrex 玻璃，直径 28 mm，高度 61 mm
培养瓶支架聚甲醛定制加工 
硅胶Dow CorningSylgard 184用于密封玻璃瓶
培养基瓶VWR66022-065
Difco M9 最小盐培养基 5×BD培养基
酪蛋白氨基酸BD培养基
葡萄糖Sigma
细菌琼脂Oxoid用于制备琼脂平板
LB 培养基（Luria Bertani 培养基）
倒置显微镜Leica MicrosystemsLeica DMI-LED用于微流控测量，使用 40× 物镜，数值孔径 NA = 0.55
显微镜培养箱Live Cell InstrumentCU-109用于微流控测量
电磁阀PneumadyneS10MM-31-12-3常开型，1.3 瓦，12 V 直流
USB 接口卡Hobby EngineeringUSBIO24-R 数字输入/输出模块 用于微流控测量
空气压缩机Rocker ScientificROCKER 440微流控系统的压力源；最大压力 80 psi
公鲁尔锁接头转 1/8" 插管ValuePlastics.comMTLL230-1用于微流控控制
1/8" 插管转 10-32 螺纹接口ValuePlastics.comB-1用于微流控控制
母鲁尔锁接头转 10-32 螺纹接口ValuePlastics.comKFTL-1用于微流控控制
NPN 达林顿晶体管，500 mA，40 V（2N6427）DigiKey.com2N6427GOS-ND用于微流控控制
10 k欧姆碳膜电阻，0.25 WDigiKey.comP10KBACT-ND用于微流控控制
钽电容，10 μF，25 V，10%DigiKey.com478-1841-ND用于微流控控制
Andor CCD 相机AndorZyla 4.2 Plus SCMOS用于芯片上微流控成像
ELISA 酶标仪
双组分硅胶 MomentiveRTV 615用于微流控芯片制备
SU-8 光刻胶MicrchemSU8 2015用于微流控芯片制备
AZ4620 光刻胶ClariantAZ 4620用于微流控芯片制备
等离子清洗机Harrick PlasmaPDC 32G用于微流控芯片制备
20 号注射器针头BD用于微流控芯片制备
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
DNA 聚合酶ToyoboKOD PlusPCR 扩增
甲氧苄啶Sigma
酶标仪BiotekSynergy H1 hybrid 抗生素抗性测量

参考文献

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