肿瘤微环境的模仿:产生富集的细胞群及侦查间通讯的简单方法

肿瘤微环境（TME）是由该共存和进化旁边宿主基质癌细胞的高度复杂的系统。此基质组分通常由成纤维细胞，肌成纤维细胞，内皮细胞，各种免疫组件，以及细胞外基质^1。一个显著组分，往往大部分这种基质，被激活的成纤维细胞，经常被称为癌症相关的成纤维细胞或癌相关成纤维细胞^{（CAF）2,3-。}不同于正常的，未活化的成纤维细胞，的CAF有助于肿瘤发生，发展，血管生成，侵入，转移和复发^4-11在多种癌，包括乳腺癌，前列腺癌，肺癌，胰腺癌，皮肤癌，结肠癌，食道癌，和卵巢^5,6,12-17。然而，CAF的整个发病机制的贡献的确切性质仍然不好界定。此外，临床证据已证明的CAF的预后价值，他们的存在以高品位的恶性肿瘤，治疗失败，和总体预后较差^10,18,19相关。

显然，增强我们在CAF发展的始发事件，以及细胞间通讯介导的TME内的作用的理解，可以提供能改善患者的治疗效果令人兴奋的新治疗靶点和增强策略。为实现这一目标，一些在体内和体外模型已经制定出来。而在体内的方法是多个反射病人TME的，它们具有局限性，包括内和肿瘤之间的巨大复杂性和非均质性。此外，从人类受试者的肿瘤样本通常代表着高度发达的TME和不允许TME始发事件的理解。实验动物研究提供了一定的优势，但动物数据对人类的概括应该谨慎进行，由于在physi差异人类和动物如啮齿动物（ 例如，硫醇化学^20，代谢速率^21，胁迫耐受性²² 等 ）之间易学。此外，与人类群体，它在本质上是遗传异质性，实验室动物通常饲养至均一。另外，通常难以检查瞬时生理变化和细胞表型的变化，以及以控制如啮齿类使用动物特定的实验参数。因此， 在体外 2-和3-维（2D和3D）的组织培养模型经常用于推进TME发展的基本理解。尽管他们缺乏体内系统的复杂性的准确写照，这些模型提供了极大的方便机理研究的优势， 在体外模型允许TME更简化，重点突出，具有成本效益的分析，即统计显著数据可以被生成在细胞免费的动物出现的系统性的变化。

有几个品种在体外系统。两种最常用的TME 体外模型由混合单层或球体的细胞培养物。两种培养方法对于细胞间的相互作用（ 例如，正常细胞与肿瘤细胞）和用于各种TME特定细胞表型的变化进行分析的基础研究有利（ 例如 ，从正常成纤维细胞癌相关成纤维细胞的出现）。此外，该球状体是能够创建TME的多个反射组织样结构，并且可以是代表性的肿瘤的异质性^23。然而球体往往会产生跨层广泛变化的氧张力梯度，这可能复杂化实验的结论^24。不幸的是，这两款车型在他们的隔离作进一步鉴定和研究以下共同的纯细胞群的能力是极其有限文化。这样做将需要至少一种细胞类型是荧光标记的或具有一个识别制造者标记，然后使该混合共培养来大量处理和细胞分选来分离细胞群。而细胞分选仪能够分离出，而纯的细胞群，其中一个必须认识到细胞应激和可能的微生物污染的风险^25。

为了促进细胞间通讯的理解，伟大的努力，一直致力于对发展和体外系统紧密模拟体内环境，同时允许一个简化的方法进行优化。一个这样的工具是渗透微孔插入，这是第一次在1953年²⁶研制并随后适用于不同的应用和研究（ 如细胞极性^27，内吞^28，运输毒品^29，组织建模^30，叔膜基材ilization ^31，旁观者效应^32,33 等 ）。这个系统允许在体内样解剖和功能分化的细胞在体内的生长，以及许多的表达标记物未观察到当在不可渗透的塑料制品培养^34,35。此外，极薄的多孔膜（10微米厚）允许分子和平衡时间的快速扩散，它模拟体内环境，并允许在两个顶端和基底外侧细胞结构域独立蜂窝运作。插入件的效用作为TME系统的一个附加的优点是上生长在相同的环境条件下在膜的两侧的两个异型细胞群的其物理分离，同时保持通过膜孔间通讯的各种模式。虽然物理上分开，这两个细胞群体的代谢经由分泌的元件联接，正如日这里刻划，也可以通过间隙交界的通道。此外，通过保持在体内局部氧气张力（PO _2）的插入，该模型可以减少在其他系统中观察到的氧气和化学梯度的并发症。相反，它增加了自然机制控制TME的理解。值得注意的是，这两个细胞群体可容易地以高纯度分离，没有荧光标记和/或细胞分选共培养后的长时间。

在这里，我们通过膜孔描述由人乳腺癌细胞和生长，分别在一个可渗透微孔膜插入件的任一侧人成纤维细胞的体外 TME协议，但还没有在连续的双向通信。我们表明，通过使用膜不同孔径，特定类型的细胞间通讯的贡献（ 例如 ，分泌的因子与间隙连接）到显影在TME可以进行调查。

1.文化传媒和细胞的制备

1. 制成500毫升之Eagle氏最低必需补充有12.5％（体积/体积）热灭活的胎牛血清（FBS），100单位青霉素培养基，2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和的和每毫升100微克的链霉素。
   注:生长培养基和补充物（多个）可以为其它的细胞株或细胞系的生长要求很容易地交换。
2. 制备70微升细胞培养基的每个插入物（6孔格式插入）:Eagle氏最低必需培养基补充有50％（体积/体积）的热灭活FBS，2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，和100单位的青霉素和100μg每ml的链霉素。
   注:该培养基补充有50％FBS的，以促进细胞附着于刀片的底侧（即下侧）。生长培养基和补充物（多个）可以为其它的细胞株或细胞系的生长要求很容易地交换。
3. 制备往在刀片的底侧被镀该细胞的细胞悬浮液。
   注意:在这里，用AG1522在75cm ²的细胞培养瓶中生长的正常人成纤维细胞所获得的结果，因此，这些细胞将细胞悬浮液的制备的描述的重点。
4. 以收集细胞，去掉生长培养基并用5毫升1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞单层2倍。
5. 移除PBS并传播将1ml的0.25％（体积/体积）用2.21毫乙二胺四乙酸（EDTA），预升温至室温（RT）下在细胞上2分钟在RT（室温）胰蛋白酶。
6. 猝灭胰蛋白酶活性用9ml完全生长培养基（在步骤1.1中制备），并通过将烧瓶10倍的表面上轻轻吹打细胞悬浮液收集细胞。
7. 通过使用血球或电子计数器测定细胞浓度和吸取细胞悬液体积将providÈ250,000细胞每插入到无菌15ml离心管中。
8. 沉淀通过离心细胞悬浮液（800 XG，2分钟）。暂停与生长培养基（在步骤1.2中制备）将细胞沉淀以创建每70微升250,000个细胞的浓度。
   注:由于在可渗透微孔膜插入细胞培养物是基于二维基材，同样地进行细胞接种，除了细胞最初应悬浮于含有50％（体积/体积）胎牛血清，以方便附着介质。

2.插入的制备

注:为了确保无菌条件下，工作专注于细胞培养层流生物安全柜。

1. 为0.4微米的膜孔径，1微米，或3微米选择插入物（由实验利息（多个）确定，如孔径大小可以用来探索间通讯的不同模式的作用）。
   注:0.4微米孔径是SMaL公司升，足以限制形成的小区之间的功能性间隙连接在插入膜的任一侧，并且可以用于研究由分泌的因子间通讯。然而，在1微米和3微米的孔大到足以允许形成功能性间隙连接和可用于研究由两个间隙连接和分泌的因子间通讯。
2. 从包装中取出单独插入并放入一个同样大小的多井菜。
   注意:插入可与各种膜的表面区域，以满足特定的应用需求（ 如 ，6孔，12孔，24孔插入）。这里，使用6孔插入物所获得的结果，并因此将是模型描述的重点。
3. 盖菜，含刀片的菜盖子。持有多井的菜用双手轻轻颠倒的菜，这样插入底部（ 即底部）现在朝上。
4. 删除次多井培养皿电子底部，露出刀片的底侧。有一次一个插入工作，用无菌钳子，轻轻举行的地方插入。随着放开手脚，用吸管用宽口尖划出70微升细胞悬液（步骤1.3-1.8编写的），含有250,000个细胞。
5. 到板上的细胞，轻轻放在插入件的膜的中央枪头，并慢慢地吸取70微升细胞悬浮液，同时缓慢移动所述膜的表面附近的枪头。小心不要枪头和细胞悬液延伸到刀片的边缘。
   注:触摸刀片的边缘，可能会导致该细胞悬浮液，导致附着在干燥细胞的毛细管张力的损失。
6. 重复剩余的插入，小心被行使不可直接在裸露的插入工作，以避免潜在的微生物污染。
7. 轻轻返回多井盘底部，以覆盖插入。保持与插入的盘反转，孵育在5％（体积/体积）CO ₂加湿的空气气氛中，在37℃下30-45分钟。
   注:如果在插入接触孔底部的细胞悬浮液，小心地将培养皿底部和安放在盘顶的边缘，以便它形成一个很小的角度的盘的表面之间产生更大的分离和刀片的底侧（其中细胞接种）。这将防止细胞附着到孔的，而不是插入的表面上。
8. 继30-45分钟的培养时间，轻轻地取下菜含刀片，并将其放置在层流生物安全柜。
9. 用两只手和保持盘盖严密，轻轻重新颠倒菜使得含有贴壁细胞插入件的底侧现在朝下。
10. 慢慢地，小心地加2ml（1毫升3微米孔径插入避免migrati通过预热完全培养基的插入孔）的细胞（见步骤1.1），以每孔，从而使插入件的底部被浸入。
11. 在包含插入的井加入生长培养基后，将盘子放回培养箱。
12. 允许插入到在孵化器保持不受干扰48小时。 48小时后，通过从井的底部抽吸2毫升培养基并加入2ml新鲜生长培养基的进料的细胞。
13. 加入新鲜培养基到井，种子将1ml第二细胞群悬浮液（〜250,000个细胞/毫升）上的插入件，其已经具有第一细胞群上的底侧生长的顶侧的底部（为这些后实验中，AG1522（对照）细胞或癌（实验）细胞接种在插入，即已经有AG1522细胞，注定要成为的CAF，上插入件的底侧生长）的顶部。放置培养皿放回培养箱。
    注意:如果工作与不很好地粘附于刀片的底部细胞ING，这些细胞可被替换地生长在刀片的顶侧。
14. 通过吸从井的插入件和底部的顶部介质播种上刀片的顶侧的细胞的第二群后改变为24，72的介质，和96小时。轻轻1毫升新鲜培养基到插入件的顶侧和2ml添加到井的底部。允许两个细胞群体保持在共培养上可渗透微孔插入物膜的任一侧为120小时。

3.从胰蛋白酶消化收集插入细胞

注意:除了易于获得富集的细胞群，该插入TME模型还允许类似实验处理（ 例如 ，孵育化学品，暴露于氧的条件是高于或低于环境气氛，电离辐射处理等 ）作为其他体外 例如，原位免疫检测，免疫印迹）或繁殖用于随后的实验^36。

1. 为了收集细胞，去除生长培养基中插入，并将其放入含1毫升的PBS 35毫米的细胞培养皿。用1ml PBS洗刀片1倍的底侧和顶侧。
2. 移除PBS并加入200微升的0.25％（体积/体积）与2.21毫摩尔EDTA胰蛋白酶，预温热至室温。
   1. 如果收集生长在插入件的底侧的细胞，将胰蛋白酶溶液放入35mm培养皿和所述插入件的底部轻轻放入在室温2分钟的胰蛋白酶溶液。
   2. 如果收集细胞S于刀片的顶侧生长，将插入到35mm培养皿和胰蛋白酶溶液加入到刀片的顶和在室温下孵育2分钟。
3. 通过加入800微升完全生长培养基中的猝灭胰蛋白酶活性。
   1. 如果收集生长在插入件的底部的细胞，生长培养基添加到35mm培养皿并轻轻吹打1ml的细胞悬浮液的刀片10倍的表面上，与插入被以较小的保持收集细胞角，使得该细胞悬浮液收集到盘中。
   2. 如果从刀片的顶侧收集的细胞，生长培养基添加到顶部侧和插入件10倍的表面上轻轻地吸取1ml的细胞悬浮液。

4.流式细胞仪鉴定细胞纯度的

注意:为了表征可渗透微孔膜插入物保持的t纯度的能力他两个细胞群体（ 即，顶部和底部）长达120小时，节1-3进行，用绿色荧光蛋白（GFP）-tagged被电镀的MDA-MB-231细胞上的刀片的顶侧，并且被镀上0.4μm-底侧非GFP标记AG1522细胞，1μm-，或3微米孔径的插入。

1. 一旦从所述插入件的底侧收集细胞（过程在第3节中描述），沉淀通过离心细胞悬浮液（500克，30秒）。
2. 除去上清液，并暂停在补充有1％（体积/体积）FBS的400微升的Hanks'平衡盐溶液（HBSS）中的细胞沉淀。
3. 关于流式细胞仪配备有488nm的激光的流程进行流式细胞仪分析，以激发GFP和530/30的带通滤波器以检测GFP的光子发射^37。
4. 对于细胞识别的目的，使用AG1522控制的细胞群，调整前向和侧向散射电压的流式细胞仪。调整将GFP通道电压来设置蜂窝自发荧光值作为GFP信号较低检测阈值。
5. 使用确定对照细胞门控阈值。评估基于GFP阳性细胞相对于对照的存在下各细胞群的纯度。
   注:纯粹的人口将是反射没有检测到GPF阳性细胞。

5.通过原位表征免疫细胞

1. 从插入下列细胞的胰蛋白酶处理（见第3），收集细胞，板5×10 ^4个细胞在250μl的生长培养基（参见步骤1.1），进入无菌玻璃盖玻片，并允许进行1小时中的潮湿空气的气氛附加5％（体积/体积） _的 CO ₂在37℃培养箱中。
2. 在温育结束时，轻轻取出含有盖玻片培养皿并将其放置在层流生物安全柜。
3. 小心加2ml预热的完全培养基（见步骤1.1）向每个皿，使盖玻片浸渍。
4. 加入生长培养基含有盖玻片的所有的菜后，在恒温箱在37℃下返回菜的5％（体积/体积） _的 CO ₂的潮湿空气的气氛48小时。
5. 以下的48小时温育后，用PBS洗样品3次，用4％（重量/体积）甲醛的PBS固定在室温10分钟。
6. 冲洗5次用Tris缓冲盐水（TBS:50毫摩尔Tris-氯，pH值7.5，150mM的NaCl）中，然后用0.25％（体积/体积）的Triton X-100，0.1％（重量/体积）皂苷透化在5分钟RT。
7. 阻断非特异性结合位点用2％（体积/体积）正常山羊血清（NGS），1％（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA），0.1％（体积/体积）的Triton X-100的TBS（阻塞溶液）在室温1小时。
8. 隔夜阻挡在4℃解决方案:一抗（1000抗小窝蛋白1（CAV1），1）孵育。
9. 用0.2％NGS（体积/体积），1％（重量/体积）牛血清白蛋白，0.1％洗掉未结合的初级抗体（3×，5分钟/洗涤）（沃升/体积）的Triton X-100的TBS（洗涤溶液）。
10. 在室温下伴随在封闭液1小时的二级抗体孵育（见第5.4节）。
11. 洗掉未结合的二级抗体（3倍，5分钟/洗）用洗涤液（见步骤5.6）。
12. 安装盖玻片上用含有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）抗褪色封固剂的滑动，并用指甲油密封。
13. 观察上配备有外部光源荧光激发倒置显微镜使用63X油倍率物镜的细胞，并使用连接的数码相机进行后续分析拍摄图像。

6.表征Western印迹细胞

注:Western blot检测过程在别处描述^38。一个简短的概要说明如下:

1. 通过胰蛋白酶消化从插入以下的细胞脱离（见第3部分），通过离心（500克，30秒）沉淀细胞悬浮液。
2. 除去上清液，并中止与100微升PBS细胞沉淀2倍。
3. 在50μl改性放射免疫测定法除去上清液，裂解细胞（RIPA）缓冲液（的Tris pH为7.5的50mM，NaCl的150mM的，NP40 1％（体积/体积），脱氧胆酸钠一水合物（DOC）的0.5％（体积/体积），十二烷基硫酸钠（SDS），0.1％（体积/体积）），含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。
4. 孵育在冰上并离心20分钟以19,000rpm克于4℃15分钟。
5. 确定使用蛋白的光密度测定法中，与在RIPA缓冲液的洗涤剂兼容上清液中的蛋白质浓度。
6. 分离蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和electroblot到0.2μm的硝化纤维素膜。
7. 孵育膜在含有0.1％（体积/体积）吐温20（TBST）和4％（重量/体积）的TBS脱脂60分钟乳（封闭溶液），并用一级抗体在4℃反应过夜（抗CAV1，1:1000）。
8. 在室温（5分钟/洗）用TBST洗膜3倍。
9. 孵育膜30分钟在含有与辣根过氧化物酶（HRP）（1:5000）缀合的抗小鼠第二抗体阻断溶液。
10. 在室温（5分钟/洗）用TBST洗膜3倍。
11. 使用免疫印迹检测系统，化学发光可视化反应产物。

7.表征间通讯的流式细胞仪

注意:为了表征可渗透微孔膜的适应性插入以检查细胞间通讯（ 例如，分泌的因子，间隙连接）的不同模式。切片1-2.12用于0.4μm-底侧，1μm-，或3微米的微孔插入物被电镀非荧光AG1522细胞进行。

1. 文化非标记AG1522细胞35毫米的菜使用第1.1节中描述的90％汇合。
2. - [R樱雪细胞1倍用1毫升的HBSS。
3. 称重传感器与钙黄绿素AM在HBSS含有钙黄绿素AM30μm的培养细胞。
4. 孵育在37℃，5％（体积/体积） _的 CO ₂的潮湿空气的气氛15分钟。
5. 洗涤细胞2倍用1毫升的HBSS。
6. Trypsinize细胞通过添加2.21毫摩尔EDTA胰蛋白酶在RT 2分钟的0.25％200微升溶液（体积/体积）。
7. 通过加入800微升含12.5％FBS的完全培养基（体积/体积）的猝灭胰蛋白酶活性。
8. 把细胞注入悬挂反复吹打。
9. 通过使用血球或电子计数器测定细胞浓度和板装载钙黄绿素AM到已经AG1522细胞在底侧生长刀片的顶侧250,000个细胞。
10. 孵育在5％CO ₂的加湿空气气氛中的插入，在37℃ 6小时。
11. 6小时后，收集细胞，从插入件的底侧，如上所述第3节。
12. 沉淀通过离心将细胞悬浮液（500克，30秒）。
13. 除去上清液，并暂停于400μl的HBSS补充有1％（体积/体积）FBS的细胞沉淀。
14. 分析细胞上配有激光一仪和筛选能够激励和检测钙黄绿素（分别为496纳米和516纳米，）的排放，根据制造商的协议。
15. 对于细胞识别目的，使用未染色AG1522控制细胞群进行调整正向和侧向散射电压的流式细胞仪。调整钙黄绿素通道电压来设置蜂窝自发荧光值作为钙黄绿素信号较低检测阈值。
16. 确定使用钙黄绿素加载的对照细胞的上阈值限制。评估基于钙黄绿素阳性细胞相对于对照的存在下各细胞刀片通信。

在这里，我们适于可渗透微孔膜插入物来开发模仿体内肿瘤微环境（ 图1） 在体外异型细胞共培养体系。该系统允许在插入的多孔性膜的任一侧待生长的时间过长（高达120小时，在我们的使用）两个不同的细胞群体。重要的是，系统能够保持细胞群的纯度，如通过对0.4〜，1-或3间孔隙刀片的顶侧镀GFP标记的MDA-MB-231细胞，并允许它们生长中测定共培养AG1522细胞生长在刀片的底侧，为120小时。此时间之后，将细胞从所述插入件的底侧收集并通过流式细胞术分析，以确定任何GFP阳性的MDA-MB-231细胞，这表明细胞群体纯度的损失的存在。分析显示99.9％和99.8％普再分别从0.4至1微米的孔插入，人口;然而，用3微米的孔中的插入件是无法维持细胞群的分离，因为孔足够大以允许GFP阳性的MDA-MB-231细胞的一个显著编号以穿过膜迁移（ 图2） 。

重要的是，通过在原位免疫荧光和Western印迹分析中，我们能够证明该系统有效地产生来自正常人二倍体AG1522成纤维细胞共培养后用MDA-MB-231乳腺癌细胞癌相关成纤维细胞的能力，如通过测定减压小窝蛋白-1的表达，一个完善的CAF生物标记39-42（ 图3）。 CAV1是形成在质膜，这是参与多种细胞过程43的脂筏结构域的小窝一个支架蛋白。在西方印迹，观察到两个不同的频带，对应于CAV1 44的α和β同种型。不幸的是，知之甚少的同种型之间的差值（S），特别是它们作为CAF生物标志物的作用。

我们还示出的插入件共培养体系的熟练程度来调节两个异型细胞群体（ 图4）之间间通讯。非标记的，间隙连接主管人二倍体AG1522成纤维细胞培养至汇合在插入的底侧。第二组AG1522细胞装载有钙黄绿素AM，绿色荧光间隙连接可渗透染料，并接种在所述插入件的顶侧。两个细胞群体被允许6小时进行通信，然后在该插入件的底侧，将细胞分离并通过流式细胞术分析。从插入件的底侧的钙黄绿素阳性细胞将是反射ES细胞的通过插入孔tablished间隙交界耦合。的0.4微米孔径的大小插入在刀片的两侧生长的细胞之间的有限的功能性间隙连接的形成，从而限制通信分泌的因子（ 例如，生长因子，微泡等 ）。可替代地，1微米和3微米的孔的尺寸是显然足够大，以使细胞的功能耦合通过间隙连接。因此，通过调节孔径，可以开始了解细胞间通讯的不同模式可能对TME发展和演变的不同角色（S）。

图1:渗透微孔膜插入模型方案 （ 一 ）显然正常人二倍体AG1522成纤维细胞注定要成为的CAF（低传代细胞）被接种到反转可渗透微孔插入物包括一个10微米厚的聚酯膜与0.4微米，1微米，或3微米的孔。以下附着，插入件被反转并置于板的孔中，并培养至汇合。 （ 二 ）肿瘤细胞和对照成纤维细胞分别在烧瓶上刀片的顶侧被接种与成纤维细胞在底侧紧密生长之前增加。 （ 三 ）共培养细胞被馈送隔日并保持所需的时间。以下共同培养和/或实验性治疗（d）在各次，的CAF（刀片的底侧）和/或癌细胞（刀片的顶侧）通过胰蛋白酶消化仔细分离，得到高纯度的细胞群，它可用于端点分析或传播为后续研究。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:高度富集细胞群的生成代表性流式细胞术结果证明插入的能力，以保持高度富集以下120小时共培养，但独立异型细胞群。 （ 一 ）从0.4微米孔径刀片的底侧收集AG1522细胞显示人口的99.9％是自由的GFP标记的MDA-MB-231细胞上的插入件（左下象限）的顶侧生长。 （b）从所述1微米孔径刀片的底侧收集AG1522细胞还显示99.8％富集群体（左下象限）。从3微米孔径刀片的底侧收获（ 三 ）AG1522细胞表明，只有68.5％的人口是免费的GFP标记的细胞（左下象限），这表明大量GFP阳性MDA-MB-231细胞能够通过3微米的微孔进行迁移。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3: 癌相关成纤维细胞的生成 CAV1的表达下降是一致的，可靠的CAF的生物标志物。 （ 一 ） 在原位免疫荧光显微图像（比例尺= 20微米），以及在AG1522细胞CAV1（b）的蛋白质印迹分析了已经在共培养AG1522细胞（对照）（左），或具有MDA- MB-231乳腺癌细胞（右）为120小时。用丽春红硫红染色用于装载控制，并确定在Western印迹的倍数变化。结果代表的三个独立的实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4:通过插入孔径间通讯的调制流式细胞术分析表明可渗透微孔膜插入TME模型的适应性来选择细胞间通讯的不同模式之间的钙黄绿素AM负载AG1522细胞生长在插入和AG1522控制的顶细胞在其底侧增长。 （a）由0.4微米孔径的插入底侧收获细胞显示钙黄绿素阳性细胞（0.57％），这表明通过插入孔有限间隙连接通讯的非常低的水平。 （b）由1微米孔径的插入底侧收获细胞显示ħigher水平钙黄绿素阳性细胞（9.98％​​），说明形成功能性缝隙连接。 （ 三 ）从3微米孔径插入底部收获的细胞表现出高水平的钙荧光素阳性细胞（87.8％），这表明大量的间隙连接通讯的。 请点击此处查看该图的放大版本。

作者宣称，他们没有竞争或利益冲突。