我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。
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摘要
摘要
理解癌细胞与周围非癌性间质之间的早期异型相互作用，对于阐明导致间质激活及肿瘤微环境（TME）形成的事件至关重要。多个 体外 和 体内 肿瘤微环境（TME）模型已被开发出来；然而，总体而言，这些模型通常难以在不干扰细胞状态的条件下，有效分离出单一的细胞群体以供进一步研究。为克服这一难题，我们采用了 体外 使用由可渗透微孔膜插入物组成的细胞生长基质构建肿瘤微环境（TME）模型，该模型可在插入物膜的两侧分别共培养细胞，实现紧密但分离的长期共培养，并可简便地获得高度富集的细胞群体。通过该模型，我们能够在与高转移性人乳腺癌细胞共培养（120小时）后，从正常的二倍体人成纤维细胞中获得显著富集的癌症相关成纤维细胞（CAF）群体，且无需使用荧光标记和/或细胞分选技术。此外，通过调节插入物的孔径大小，可控制细胞间通讯的方式。例如，缝隙连接通讯，分泌因子）之间的两种异质细胞群，从而允许研究肿瘤微环境（TME）发育背后的机制，包括缝隙连接通透性的作用。该模型是深入理解癌症-间质启动的初始事件、TME的早期演化过程以及间质对癌细胞治疗反应调节作用的有力工具。
引言
肿瘤微环境（TME）是一个高度复杂的系统，由癌细胞与宿主间质共同存在并协同演化而成。该间质成分通常包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、多种免疫组分以及细胞外基质1。其中一个重要组分，往往是间质的主体部分，是被激活的成纤维细胞，通常被称为癌症相关成纤维细胞或癌相关成纤维细胞（CAF）2,3。与正常的非激活状态成纤维细胞不同，CAF在多种癌症中促进肿瘤的起始、进展、血管生成、侵袭、转移和复发4-11，这些癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、结肠癌、食管癌和卵巢癌5,6,12-17。然而，CAF在整个癌症发病过程中所起作用的具体性质仍不明确。此外，临床证据表明CAF具有预后价值，其存在与高级别恶性肿瘤、治疗失败以及总体不良预后相关10,18,19。
显然，加深对癌相关成纤维细胞（CAF）发育起始事件及其在肿瘤微环境（TME）中介导作用的细胞间通讯机制的理解，可能为改善患者预后提供令人期待的新型治疗靶点和优化策略。为实现这一目标，已有若干 体内 和 体外 已开发出多种模型。尽管 体内 尽管这些方法更能反映患者体内的肿瘤微环境（TME），但仍存在局限性，包括肿瘤内部及肿瘤之间的巨大复杂性和异质性。此外，来自人类受试者的肿瘤样本通常代表的是高度发育成熟的TME，因而无法揭示TME初始事件的发生机制。实验动物研究....
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方案
1. 培养基和细胞的准备
- 配制500 ml添加有12.5%（体积比）热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以及每毫升100单位青霉素和100 µg链霉素的Eagle最小必需培养基。
注意：可根据其他细胞株或细胞系的生长需求，轻松更换培养基和补充物。 - 为每个插件（6孔板格式插件）准备70 µl细胞培养基：添加50%（体积比）热灭活FBS、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，以及每毫升含100单位青霉素和100 µg链霉素的Eagle最小必需培养基。
注意：培养基中添加50% FBS以促进细胞贴附至底部即， 插入物的下侧。可根据其他细胞株或细胞系的生长需求，方便地更换培养基和补充物。 - 制备将要接种到插入式培养小室底面的细胞的细胞悬液。
注意：此处结果使用在75 cm²培养瓶中培养的AG1522正常人成纤维细胞获得2 细胞培养瓶中的细胞，因此这些细胞将是细胞悬液制备描述的重点。 - 收集细胞时，移除培养基，用5 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞单层洗涤2次。
- 吸除 PBS，加入 1 ml 预热至室温（RT）的 0.25%（体积比）胰蛋白酶溶液（含 2.21 mM 乙二胺四乙酸，EDTA），均匀覆盖细胞，室温孵育 2 分钟。
- 用9 ml完全培养基（按步骤1.1配制）终止胰蛋白酶活性，并通过轻柔吹打细胞悬液10次，....
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结果
在此，我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来开发一种 体外 模拟异型细胞共培养系统 体内 肿瘤微环境（图1）。该系统允许在小室的多孔膜两侧长期共培养两种不同的细胞群体（在我们的应用中可长达120小时）。重要的是，该系统能够维持细胞群体的纯度，这一点通过将表达GFP标记的MDA-MB-231细胞接种于0.4、1或3 μm孔径小室的上侧，并使其与接种于小室下侧的AG1522细胞共培养120小时来验证。培养结束后，收集小室下侧的细胞，通过流式细胞术分析是否存在GFP阳性的MDA-MB-231细胞，以判断细胞群体纯度是否丧失。分析结果显示，使用0.4和 1 µm-孔插件，分别；然而，带有插件的 3 µm 孔径无法维持细胞群体的分离，因为孔径过大，足以使大量表达GFP的MDA-MB-231细胞迁移穿过膜图2).
重要的是，通过 原位 通过免疫.......
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讨论
本方案描述了一种简单且可灵活调整的方法 体外 实验步骤图1利用可渗透的微孔膜插入物，从异型细胞共培养体系中分离出高度富集的单一群体细胞。该模型的重要优势在于适用于研究多种细胞间通讯模式。关键技术步骤包括：根据特定实验需求选择合适孔径的插入物，将第一群细胞接种于插入物底部，培养基中添加50% FBS，随后将第二群细胞接种于插入物顶部，并将两个不同细胞群体共培养适当时间。我们证明该系统能够模拟多种 体内 特征，从而为理解早期肿瘤微环境（TME）演化过程中发生的分子、表型及潜在变化提供了更充分的机会，弥补了现有许多TME模型的主要缺陷 体外 模型（图2).
该模型可轻松修改，以允许研究癌症-基质发育及肿瘤微环境演化过程中细胞间相互作用的各个方面（图4）。尽管0.4 µm孔径的插入式培养小室允许两种细胞群体之间进行紧密的相互作用45，它显著限制了生长在插入膜两侧的细胞之间功能性间隙连接的形成（图4<.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性或冲突性利益。
致谢
本研究获得了新泽西癌症研究委员会（博士前奖学金 DFHS13PPCO17）、美国国立卫生研究院（CA049062）和美国国家航空航天局（NNX15AD62G）资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>细胞培养用 | |||
| AG01522 (即，AG1522）人二倍体成纤维细胞 | 科里尔 | 107661 | 第8-13段 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 乳腺腺癌细胞系 | PerkinElmer | 119261 | 亲本细胞系：ATCC（#HTB-26） |
| MDA-MB-231/GFP 乳腺腺癌细胞系 | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle最小必需培养基（MEM） | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| 胎牛血清（FBS），经认证合格 | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning GlutaGro 补充剂（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺） | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液 | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell 小室（插入式）即，可渗透的微孔膜插入物）（0.4 μ微孔 | Costar | 3450 | |
| Transwell 小室即，可渗透的微孔膜插件）（1 μ微孔 | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell 小室即，可渗透的微孔膜插入物）（3 μ微孔 | Costar | 3452 | |
| 6孔培养板 | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 细胞培养瓶 | CellStar | 658 170 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | 不含钙 &和镁 |
| 0.25%（体积/体积）胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1× | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml 离心管 | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm × 10 mm 细胞培养皿 | Greiner bio-one | 627 160 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>用于免疫荧光显微镜检查 | |||
| 小鼠抗Caveolin 1 | BD 转导实验室 | 610406 | 原位 免疫荧光 - 1:5,000 |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记 | 赛默飞世尔科技 | A-11029 | 原位 免疫荧光 - 1:2,000 |
| 牛血清白蛋白 - 第五组分 | Rockland | BSA-50 | 免疫球蛋白和蛋白酶无污染 |
| 16% (wt/vol) 甲醛溶液 | 赛默飞世尔科技 | 28908 | 用1×PBS稀释至4% |
| 优质盖玻片（22 mm × 22 mm，No.1） | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| 含DAPI的SlowFade Gold抗荧光淬灭试剂 | Invitrogen | S36938 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>用于流式细胞术分析 | |||
| Calcein, AM | 分子探针 | C3100MP | |
| Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>用于蛋白质印迹分析 | |||
| 小鼠抗Caveolin 1 | BD 转导实验室 | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| 硝酸纤维素膜（0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC 蛋白检测试剂盒 | 伯乐（BioRad） | 500-0116 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | BioRad | 161-0302 | |
| 脱氧胆酸钠一水合物（DOC） | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630（NP40） | Sigma | I8896 | |
| 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1 | 伯乐（BioRad） | 161-0158 |
参考文献
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009)....
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