方法文章

一种用于动物行为观察的溶解氧调控简易方法

9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54430

⸱

2016年6月28日

 , 
1Department of Biology, Juniata College

本文内容

摘要

本文介绍了一种在实验室条件下操控溶解氧环境的简单且可重复的实验方案，适用于动物行为学研究。该方案可用于教学和科研实验室，以评估大型无脊椎动物、鱼类或两栖类动物对溶解氧浓度变化的生物响应。

摘要

在实验室环境中调控溶解氧（DO）的能力，对于研究多种生态学和生物行为问题具有重要意义。本文所述的实验方案提供了一种简单、可重复且可控的方法，用于调节溶解氧水平，以研究水生生物在缺氧和无氧条件下的行为反应。尽管在实验室中常采用氮气脱气法处理水样，但目前文献中尚无明确针对生态学（水生）应用的脱气方法描述，本方案是首个系统描述通过水体脱气以观察生物反应的实验流程。该技术与方案最初为水生大型无脊椎动物的直接应用而开发，但也可轻松替换为小型鱼类、两栖类及其他水生脊椎动物。该方法可便捷地将溶解氧浓度调控在2 mg/L至11 mg/L范围内，并在长达5分钟的动物观察期内保持稳定。超过5分钟观察期后，水温开始上升；至10分钟时，溶解氧水平变得过于不稳定而难以维持。本方案可根据研究对象进行规模调整，具有良好的可重复性和可靠性，适用于基础教学实验以及高水平科研应用。该技术的预期结果应能将溶解氧的变化与生物的行为反应关联起来。

引言

溶解氧（DO）是水生生态系统中重要的物理化学参数，在调控多种生物和生态过程方面起着关键作用。急性或慢性亚致死性缺氧暴露会降低某些水生昆虫的生长速率，并影响暴露昆虫的存活率1。本实验方案旨在提供一种可控的方法，用于调节溪流水体中的溶解氧水平，以观察其对动物行为的影响。由于所有需氧水生生物的生存和繁殖均依赖于水体中的氧气浓度，因此溶解氧浓度的变化通常会反映在生物体的行为改变上。已有观察表明，活动能力较强的水生无脊椎动物和鱼类在遭遇低氧浓度（缺氧）环境时，会通过寻找溶解氧浓度更高的区域来应对2,3。而对于活动能力较弱的水生生物而言，通过行为适应来增加溶解氧的摄取可能是其唯一可行的策略。水生大型无脊椎动物中的襀翅目（石蝇）已被发现会进行"俯卧撑"式运动，以增强水流经过其体外鳃部，从而提高氧气摄取效率4-6。这类适应性行为已在自然环境和实验室实验中被观察到。

对水中溶解氧（DO）进行实验室调控为动物行为研究开辟了重要机遇，但目前在方法学应用方面仍存在显著空白。例如，一项研究使用大型水族箱评估了大口黑鲈（Micropterus salmoides）在氮气加注诱导的低氧环境下的生理反应时间，但该研究对实验方法的描述极为简略7。另一项针对斑马鱼（Danio rerio）的研究描述了使用氮气和多孔石向水中通气以降低水体溶解氧含量的方法8。在化学相关应用中，溶剂脱气方法依赖专用设备9-11来去除溶剂中的氧气，但这类装置并不适用于动物行为研究。尽管上述研究均采用了去除水中氧气的方法，但目前尚未发现任何可明确描述、可用于评估动物对溶解氧变化产生行为响应的实验方法。

下文所述方法旨在详尽描述一种利用氮气调控水中溶解氧（DO）含量的操作方案。该方法的开发旨在观察石蝇行为（俯卧撑动作）与溶解氧之间的关系，并已应用于大学一年级生物学实验课程中。此方法的主要优势之一是，仅需使用常见玻璃器皿及大多数中等和高等教育机构普遍具备的材料，即可在实验室中轻松实施。该方案还具有良好的可调整性，使用者可根据研究或教学目标对操作步骤进行适当调整。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：本实验未使用脊椎动物，因此无需获得朱尼亚塔学院动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。然而，对于将此方法改编用于脊椎动物的研究人员，应申请IACUC批准。

1. 野外样本采集

  1. 确定并评估潜在的野外采样点，确保能够快速采集、保存和运输石蝇，尽量缩短运输时间，建议最长运输时间不超过1小时。
  2. 在选定的野外采样点按照标准踢网法进行踢网采样，采样次数需足够以收集至少35只石蝇12。
  3. 从溪流中采集50升溪水以及最大直径为2厘米的石块。
  4. 将水族箱置于冰箱中，冰箱温度设定为溪流采样点的水温。将采自溪流的石块分装至各水族箱中，每箱加入4升溪水。每箱放入20–30只采集的石蝇，并将连接至水族箱气泵的气石放入每个水族箱中，开启气泵，持续向水中通入室内空气。
  5. 让石蝇在水族箱的新环境中适应48小时。

化学反应装置；气体扩散装置；压力表；用于温度控制的冰浴。
图 1. 溶解氧调控装置示意图。（A）1）铜管与公型软管接头的连接件 2）检查密封塞的位置，以确保烧瓶密封良好。（B）1）2 L 带支管烧瓶，内装 1.9 L 水 2）气体导管和气泡器（蓝色），分别用于通氮气和通入室内空气 3）氮气钢瓶及压力表读数 4）2 L 烧瓶内装 0.4 L 水，真空管浸没其中 5）溶解氧测定仪。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 实验设置

  1. 在实验台上，将标准壁厚的真空管连接到 2 L 侧管烧瓶的侧臂上，如图（图 1B 中的 1）所示。
  2. 从置于 12 °C 冰箱中的 3 L 塑料容器中取出溪水，将 1.9 L 溪水注入烧瓶中。
  3. 将烧瓶和管路放置在一个足够大的托盘上，以便在侧管烧瓶周围放置冰浴，同时不遮挡观察烧瓶内部的视线，并在托盘中加入冰块。
  4. 在橡胶塞上钻两个直径为 3 mm 的孔，用于插入：1）将气体输送至容器的铜管，以及 2）溶氧仪（DO 仪）探头，插入 2 L 侧管烧瓶（图 1B 中的 1）。
  5. 从橡胶塞边缘向其中一个孔做一横向切口，以便将 DO 探头的导线嵌入橡胶塞中。
  6. 将带有 3 mm 雄性软管接头的连接器连接至一段直径为 2 mm 的铜管（图 1A 中的 1）。确保该铜管长度足够，在穿过橡胶塞后可伸入烧瓶底部以上 10 cm 处。
  7. 将带连接器的铜管插入橡胶塞的第二个孔中，调整长度，使从橡胶塞底部起算的铜管长度足以伸至烧瓶底部以上 10 cm 处。
  8. 将一段长度为 0.75 m、壁薄、直径为 3 mm 的聚乙烯气体管连接至铜管上的连接器。
  9. 将 DO 探头和铜管一同插入烧瓶，并用橡胶塞密封烧瓶。
  10. 检查橡胶塞与烧瓶之间是否密封良好，以及铜管和探头导线在橡胶塞内部是否紧密贴合。
  11. 取一个 1 L 烧瓶，加入 0.4 L 自来水，并将其放置在盛有冰浴的托盘旁，靠近真空烧瓶。
  12. 将来自大真空烧瓶的聚乙烯管浸入 1 L 烧瓶的水中，并用胶带固定管子，确保其在整个实验过程中保持浸没状态。
  13. 将直径为 3 mm 的气体管路从真空烧瓶连接至水族箱用的室内空气起泡器。接通水族箱起泡器电源，开始向 2 L 烧瓶中的水通入室内空气和氧气，使其起泡。
  14. 使用 DO 仪监测水中溶氧浓度和温度，持续 5 分钟或直至溶氧达到平衡状态，即溶氧值变化极小为止。

3. 测试实验装置的稳定性

  1. 在加入石蝇之前，测试每种装置的溶解氧（DO）稳定性。
  2. 向2 L的烧瓶中加入三到四块石头，为石蝇提供适合进行俯卧撑行为的基质。
  3. 通过将气体管路从气泡发生器上断开并连接至氮气管线，开始对溶解氧进行试验性调控。
  4. 以每小时20立方英尺（CFH）的流速通入氮气，持续约40秒至1分钟。
  5. 当溶解氧降至目标浓度±0.5 mg/L范围内时，将气体流速降低至15 CFH，并继续通气直至溶解氧达到目标浓度。
  6. 一旦达到目标浓度，立即停止氮气通入。
  7. 若溶解氧低于目标浓度，可使用 aquarium 室内空气气泡装置将溶解氧浓度回调至目标值。
  8. 若在测试过程中溶解氧不稳定，应检查水量是否仍为1.9 L、有无水因起泡溢出、水温是否稳定无变化，以及所有接头的密封是否紧密无泄漏。
  9. 完成三次试验且实验者确信能够稳定控制溶解氧后，将气体管路重新连接至气泡发生器，并再次通气至溶解氧达到平衡状态。
  10. 将直径为3 mm的气体管路连接至 aquarium 气泡器，开始向水中通入室内空气，直至水中氧气浓度在连续3分钟内不再上升或发生变化，即视为达到平衡。
  11. 达到平衡后，停止通气并打开烧瓶密封。

4. 石蝇俯卧撑实验

  1. 将石蝇的总数除以观察者人数，以确定需要进行的试验次数。
  2. 设定2至10 mg/L之间的不同溶解氧（DO）水平，以评估石蝇的行为反应（即“俯卧撑”次数）。
  3. 每次试验准备一个锥形瓶，并向瓶中加入与观察者人数相等的石蝇数量（本实验设计中为4只石蝇），将探头和导管重新放入瓶中，然后用橡胶塞重新密封瓶口。
    注意：初始溶解氧浓度选择10 mg/L作为首次观察点，因为该浓度与采集石蝇的溪流中的溶解氧浓度一致。
  4. 当通过通气使水中的溶解氧达到10 mg/L后（参照步骤2.10–2.11），记录起始水温，并让石蝇附着在瓶内的岩石基质上。
  5. 每位观察者仅负责观察一只石蝇，以确保准确计数其“俯卧撑”行为，即石蝇表现出的上下身体运动。
  6. 在3分钟的观察时间内，计数并记录所观察到的俯卧撑次数。
  7. 将溶解氧调节至下一个实验设定水平，并对其他实验水平重复进行3分钟的观察。
    注意：在本实验设计中，共评估了三个不同的溶解氧水平。

5. 统计学分析

  1. 进行统计分析时，使用在特定溶解氧（DO）试验中，一组内四种石蝇完成俯卧撑动作的平均次数。
  2. 使用免费的 R 统计计算软件12，以实验试验顺序（DO 水平）和温度作为协变量，对俯卧撑次数和溶解氧（DO）浓度进行单因素方差分析（ANOVA）。将 DO 视为单个因子的不同离散水平进行分析。
  3. 对残差进行 Anderson-Darling 正态性检验，以检验数据的正态性13。
  4. 通过绘制俯卧撑平均次数与溶解氧（DO）浓度的关系图，对数据进行线性回归分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在教学实验环境中，24名大学一年级本科生对所述实验装置进行了六次试验，以量化石蝇在不同水中溶解氧浓度下完成“俯卧撑”动作的次数。将每次试验中相同溶解氧水平下石蝇完成的“俯卧撑”平均次数进行汇总，并在图2中绘制“俯卧撑”次数与溶解氧水平的关系图。首先采用方差分析（ANOVA），将溶解氧浓度、试验的先后顺序、温度以及所有变量间的交互作用纳入模型。结果表明，仅有溶解氧浓度对石蝇完成的“俯卧撑”次数具有显著影响（R2 调整值 = 0.322，p = 0.004），其他变量或交互作用均未表现出显著预测作用。本分析所用的所有数据均通过Anderson-Darling检验确认符合正态分布。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

关键步骤
本实验提供了一种在实验室环境中调控溶解氧（DO）的简单高效方法，可用于开展针对水生生物的行为学研究。我们发现，在进行本实验时，有若干关键步骤或注意事项会直接影响实验结果。在单次实验过程中，维持反应 chamber 内的压力至关重要，以避免水体上方气体分压发生变化，进而引起 DO 波动。必须严格遵循实验方案中“测试实验装置稳定性”部分所列出的操作步骤。检查橡胶塞与烧瓶之间的密封性、确保真空管完全浸没于 1 L 烧杯的水中（以防止空气倒吸），以及确保气体管路和 DO 探头导线与橡胶塞之间的密封良好，均有助于维持 chamber 内环境的稳定。此外，我们发现，尽可能增大 chamber 内的水体体积对于提高单次实验中 DO 的稳定性十分必要，因为体积过小会导致 DO 调控不稳定且波动剧烈。

保持实验腔室内的水温对于有效控制内部溶解氧（DO）水平至关重要。尽管我们在单个分组实验中能够维持较低的水温，但在不同试验间仍观察到一定程度的微小温度差异（图2）。由于我们的整体温度范围较低（11.8–13.5˚C）虽然在石蝇的典型范围内...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者首先要感谢朱尼亚塔学院生物121-生态学模块实验课的所有新生，感谢他们在本研究数据收集过程中提供的帮助。我们还要感谢Randy Bennett博士、Chris Walls、Sherry Isenberg和Taylor Cox，感谢他们协助获取开发本方法所需材料。此外，我们还要感谢Norris Muth博士和John Unger博士在方法学开发过程中提供的建议，以及Jill Keeney博士和生物学系对本项目的大力支持。我们还要感谢匿名审稿人，他们为完善和聚焦本文的撰写提供了宝贵意见。  最后但同样重要的是，我要感谢Hudson Grant在最初石蝇样本采集方面提供的帮助，这些样本用于本技术的开发

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 L 滤瓶Pyrex5340
6 号橡胶塞Sigma-AldrichZ164534
Nalgene 180 透明塑料管Thermo Scientific8001-1216
Whisper 60 气泵Tetra
标准柔性通气管Penn PlaxST25
0.25 英寸铜管Lowes 家居改进23050
公型软管接头Grainger5LWH1
母型连接器Grainger20YZ22
重型溶解氧测定仪Extech407510
氮气Matheson TRIGAS
Radnor AF150-580 调压阀AirgasRAD64003036

参考文献

  1. Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
  2. Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
  3. Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
  4. Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
  5. McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
  6. Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
  7. Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
  8. Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
  9. Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. , 3,853,500 (1974).
  10. Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. , 6,258,154 (2001).
  11. Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
  12. Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
  13. Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
  14. Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
  15. Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
  16. Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
  17. Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
  18. Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

DO

相关文章