小鼠屈肌腱损伤与修复手术

摘要

手部屈肌腱常发生损伤，导致手功能受损。然而，肌腱愈合过程中瘢痕组织形成的反应尚未被充分阐明。本文介绍了一种小鼠屈肌腱愈合模型。该模型有助于深入理解肌腱愈合过程，并可用于评估促进愈合的治疗策略。

摘要

肌腱连接骨骼肌与骨骼，几乎介导全身所有部位的运动。在手部，屈肌腱（FTs）负责手指的屈曲运动及手部的整体功能。屈肌腱损伤较为常见，且常因肌腱与周围组织之间形成过多的瘢痕组织和粘连而影响愈合效果。然而，目前对屈肌腱修复过程中的分子与细胞组分仍知之甚少。为此，研究人员已建立并描述了一种小鼠屈肌腱修复模型，该模型可重现人类肌腱愈合的多个特征，包括活动范围受限和力学性能下降。本文详细展示了该手术操作过程，涉及对小鼠后足趾长屈肌（FDL）肌腱的横断及后续修复。 该技术可用于不同细胞类型的谱系分析、基因功能获得或缺失对修复的影响评估，以及药理学干预措施在愈合过程中疗效的测试。然而，该模型存在两个主要局限性：i）小鼠后足中段的FDL肌腱在横断与修复部位并无滑膜鞘包绕，因此该模型无法反映滑膜鞘在瘢痕形成过程中的潜在作用；ii）为保护修复部位的完整性，需在肌腱-肌肉连接处松解屈肌腱，从而降低肌腱所受的力学负荷，这可能促进瘢痕组织的形成。在愈合过程中，从屈肌腱的肉芽组织中分离获取足够数量的细胞用于流式细胞术分析一直存在困难；采用细胞学离心法浓缩细胞是一种替代方案，可制备适用于免疫荧光标记的细胞样本。通过该方法，可在屈肌腱愈合过程中实现对目标细胞或蛋白的定量分析。

引言

手部的屈肌腱与前臂的屈肌以及指腱鞘协同作用，实现手指的屈曲和手部的抓握功能。屈肌腱沿手掌侧走行，由于位置相对表浅，在手部外伤时容易受损。肌腱通过瘢痕组织反应进行愈合，而非正常肌腱组织的再生¹。尽管这种瘢痕组织能够维持肌腱的连续性，但其功能远低于健康肌腱。肌腱-瘢痕组织复合体的力学性能显著下降¹，导致修复后的肌腱更容易发生断裂。此外，瘢痕组织缺乏天然肌腱胶原纤维的有序结构，导致肌腱体积增大、增粗。鉴于腱-腱鞘结构的解剖学限制，即使肌腱体积仅有轻微增加，也可能严重削弱肌腱的滑动功能，从而显著影响手指活动范围和手部功能。

在20世纪60年代之前，由于屈肌腱损伤（尤其是手部II区的损伤）修复后常出现严重的愈合并发症，这类损伤通常不进行常规修复²。手部这一区域曾被称为“无人区”³。然而，随着外科技术、缝合方式以及物理治疗康复方案的不断改进，屈肌腱修复的疗效已显著提高²。尽管如此，仍有高达40%的修复病例因形成足够的粘连而影响手部功能⁴。因此，需要采用生物学方法来改善愈合效果。遗憾的是，目前对肌腱愈合过程中细胞和分子层面的机制了解甚少。因此，本研究的目标是建立一种小鼠模型，用于深入理解屈肌腱愈合过程中涉及的细胞与分子成分以及瘢痕形成反应，从而识别出可促进愈合的新型治疗靶点。

较大的动物模型在深入理解屈肌....

方案

罗切斯特大学动物研究委员会批准了所有动物实验。实验使用10至12周龄的雌性C57BL/6J小鼠。

1. 屈肌腱手术的动物准备（约15分钟）

1. 将手术器械进行高压灭菌，全程佩戴无菌手套，并保持无菌手术区域。
2. 通过腹腔注射（i.p.）给予小鼠按体重计算剂量的氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度。
3. 通过皮下注射给予预先镇痛药物（布托啡诺，0.05–0.1 mg/kg）。涂抹眼膏以防止眼睛干燥。
4. 通过剪除整个后肢的毛发准备手术部位。依次使用聚维酮碘擦洗皮肤，随后用70%乙醇擦拭，再用聚维酮碘擦拭一次，以对皮肤进行消毒。

2. 小鼠屈肌腱损伤与修复手术（约10分钟）

1. 找到位于小腿内侧皮下的趾长屈肌（FDL）肌腱。使用手术刀，用显微剪刀在皮肤上做一个0.5–1 cm的小切口，以暴露肌腱。
2. 使用镊子将FDL肌腱与周围组织分离，并沿其向上追踪至肌腱连接处。用弹簧剪刀在此连接处切断肌腱以将其释放，注意避免损伤胫后动脉。
3. 用5-0尼龙缝线缝合皮肤。
   注意：FDL肌腱的切断与修复（步骤2.4）应使用体视显微镜进行。
4. 使用弹簧显微剪刀在后足掌后外侧做一3 mm切口。用镊子轻轻牵开周围的软组织和肌....

结果

位于小腿的趾长屈肌（flexor digitorum longus, FDL）通过屈肌腱作用于小鼠后足脚趾的屈曲（在图1A中以蓝色轮廓标示，并在图2A中显示其组织学结构），该肌腱从肌腱连接处近端延伸，止于远端指骨。在此屈肌腱愈合模型中，FDL肌腱在后足趾部分叉近端的足中部被横断并修复（红色箭头，图1A）。为防止修复部位断裂（断裂将导致无法进行实验分析），需在肌腱连接处切断或松解肌腱（及其邻近肌肉）（图1B中的黄色箭头，松解操作见图1C）。尽管该步骤并不模拟临床实际情况，但对保护修复部位至关重要，因其可降低损伤部位所受的张力。图2D展示了屈肌腱修复失败（断裂）的组织学实例，而图2C则显示了成功修复的案例。在成功修复的情况下，肉芽组织的细胞密度显著高于未受伤的肌腱（图2B），该细胞群体可进一步通过细胞离心涂片.......

讨论

本研究介绍了小鼠指深屈肌腱完全横断与修复的手术操作方法。此外，还展示了一种利用细胞学离心机浓缩少量细胞的新应用，从而实现对屈肌腱愈合过程中细胞微环境进行定量免疫细胞化学分析。该屈肌腱修复模型具有可重复的愈合反应，可用于评估基因敲除模型或药物干预对愈合过程的影响。术后24小时内即开始出现炎症反应，细胞被募集至损伤部位，纤维组织痂开始形成。约第4天进入增殖期，修复部位细胞数量显著增加，并大量沉积无序的细胞外基质，导致在14至21天之间形成粘连。组织重塑过程持续至第35天，此时屈肌腱的连续性和结构得以恢复，细胞密度也相应降低¹⁸。

目前，除了本文所述模型外，还有多种小鼠屈肌腱修复模型。Tsubone 等人， 已描述一种 体外 屈肌腱愈合模型 ¹⁹虽然该模型能够评估基因表达随时间的变化，但无法反映外源性细胞的募集或炎症/细胞因子环境的变化 体内. 体内已开发出两种部分横断模型，分别采用切开性或切除性缺损方式 ^20,21。最近，Wong 等

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术准备
C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratories	000664
氯胺酮	Hospira	NDC# 0409-2051-05
赛拉嗪	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
丁丙诺啡	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% 氯化钠冲洗液	Hospira	NDC# 0409-6138-03	用于配制氯胺酮/赛拉嗪和丁丙诺啡溶液
1 ml 注射器	BD	309659
30 G 针头	BD	305106
聚维酮碘溶液	Aplicare	82-226
70% 乙醇
Puralube 兽用眼膏	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
名称	公司	目录编号	备注
手术器械
200 g 便携式天平	Ohaus	SP202
弹簧剪刀	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-30
持针器	Fine Science Tools	91201-13
微型弹簧剪刀	Fine Science Tools	15003-08
微型持针器	Fine Science Tools	12061-02
5-0 尼龙缝线	Ethicon	668G
8-0 显微外科尼龙缝线	Ethicon	2808G
Lab-Line 组织切片烘片台	Barnstead International	26025
名称	公司	目录编号	备注
细胞离心涂片法
I 型胶原酶，冻干粉	Life Technologies	1700-017
牛血清白蛋白	Cell Signaling Technologies	9998S
1x PBS	Thermo Fisher	10010-023
细胞学漏斗	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ 显微镜载玻片	VWR	16005-110
Cytospin 2 离心机	Shandon	SH-CYTO2
名称	公司	目录编号	备注
免疫细胞化学
带黑色盖子的玻片染色槽	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU 成像试剂盒	Life Technologies	C10639	包含 EdU 和  Hoeschst 33342
Immedge 疏水屏障笔	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond 封片剂	Thermo Fisher	P36970
玻璃盖玻片 24 x 50 mm #1.5
透明指甲油