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方法文章

小鼠屈肌腱损伤与修复手术

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DOI：

10.3791/54433

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2016年9月19日

 , 
1Center for Musculoskeletal Research, Department of Orthopaedics & Rehabilitation, University of Rochester Medical Center

本文内容

摘要

手部屈肌腱常发生损伤，导致手功能受损。然而，肌腱愈合过程中瘢痕组织形成的反应尚未被充分阐明。本文介绍了一种小鼠屈肌腱愈合模型。该模型有助于深入理解肌腱愈合过程，并可用于评估促进愈合的治疗策略。

摘要

肌腱连接骨骼肌与骨骼，几乎介导全身所有部位的运动。在手部，屈肌腱（FTs）负责手指的屈曲运动及手部的整体功能。屈肌腱损伤较为常见，且常因肌腱与周围组织之间形成过多的瘢痕组织和粘连而影响愈合效果。然而，目前对屈肌腱修复过程中的分子与细胞组分仍知之甚少。为此，研究人员已建立并描述了一种小鼠屈肌腱修复模型，该模型可重现人类肌腱愈合的多个特征，包括活动范围受限和力学性能下降。本文详细展示了该手术操作过程，涉及对小鼠后足趾长屈肌（FDL）肌腱的横断及后续修复。 该技术可用于不同细胞类型的谱系分析、基因功能获得或缺失对修复的影响评估，以及药理学干预措施在愈合过程中疗效的测试。然而，该模型存在两个主要局限性：i）小鼠后足中段的FDL肌腱在横断与修复部位并无滑膜鞘包绕，因此该模型无法反映滑膜鞘在瘢痕形成过程中的潜在作用；ii）为保护修复部位的完整性，需在肌腱-肌肉连接处松解屈肌腱，从而降低肌腱所受的力学负荷，这可能促进瘢痕组织的形成。在愈合过程中，从屈肌腱的肉芽组织中分离获取足够数量的细胞用于流式细胞术分析一直存在困难；采用细胞学离心法浓缩细胞是一种替代方案，可制备适用于免疫荧光标记的细胞样本。通过该方法，可在屈肌腱愈合过程中实现对目标细胞或蛋白的定量分析。

引言

手部的屈肌腱与前臂的屈肌以及指腱鞘协同作用，实现手指的屈曲和手部的抓握功能。屈肌腱沿手掌侧走行，由于位置相对表浅，在手部外伤时容易受损。肌腱通过瘢痕组织反应进行愈合，而非正常肌腱组织的再生1。尽管这种瘢痕组织能够维持肌腱的连续性，但其功能远低于健康肌腱。肌腱-瘢痕组织复合体的力学性能显著下降1，导致修复后的肌腱更容易发生断裂。此外，瘢痕组织缺乏天然肌腱胶原纤维的有序结构，导致肌腱体积增大、增粗。鉴于腱-腱鞘结构的解剖学限制，即使肌腱体积仅有轻微增加，也可能严重削弱肌腱的滑动功能，从而显著影响手指活动范围和手部功能。

在20世纪60年代之前，由于屈肌腱损伤（尤其是手部II区的损伤）修复后常出现严重的愈合并发症，这类损伤通常不进行常规修复2。手部这一区域曾被称为“无人区”3。然而，随着外科技术、缝合方式以及物理治疗康复方案的不断改进，屈肌腱修复的疗效已显著提高2。尽管如此，仍有高达40%的修复病例因形成足够的粘连而影响手部功能4。因此，需要采用生物学方法来改善愈合效果。遗憾的是，目前对肌腱愈合过程中细胞和分子层面的机制了解甚少。因此，本研究的目标是建立一种小鼠模型，用于深入理解屈肌腱愈合过程中涉及的细胞与分子成分以及瘢痕形成反应，从而识别出可促进愈合的新型治疗靶点。

较大的动物模型在深入理解屈肌腱愈合过程方面发挥了重要作用。犬和兔的研究已证实屈肌腱具有内在和外在的愈合能力5,6，早期控制性被动活动在减少粘连形成方面相较于固定具有优势7，以及不同缝合方式对愈合过程的影响8,9。此外，犬模型已被用于测试转化性的组织工程策略以改善愈合效果10。然而，与大型动物模型相比，使用小鼠模型具有若干重要优势，包括相对较低的成本、小鼠特异性试剂的可获得性，以及构建全身敲除或组织特异性基因敲除/过表达模型的便利性。此外，人类与小鼠在屈肌腱方面的功能相似性11表明建立小鼠模型具有潜在的应用价值。

小鼠屈肌腱横断与修复模型的建立可模拟临床愈合过程中的多个方面，包括大量瘢痕组织的形成以及力学性能的下降。此处描述的模型并非对临床实践的真实再现，因为该模型在肌腱连接处横断趾深屈肌（FDL），以保护修复部位。此外，由于修复部位位于肌腱中段，该区域无滑膜鞘覆盖，因此该模型未考虑滑膜鞘细胞在愈合反应中的作用。尽管存在这些局限性，该模型的优势在于能够产生限制关节活动范围的粘连，而这一点在更接近临床情况的小鼠模型中尚未得到证实。该模型已被用于评估基因敲除小鼠模型12,13，以及测试多种药理学干预手段以促进肌腱愈合14-17。通过免疫组织化学和原位杂交对本模型进行组织学分析，可深入了解愈合过程中关键基因和蛋白质的空间定位。然而，组织学分析仅能提供横断面的空间信息，无法在整个组织范围内实现定量分析。流式细胞术是一种更具定量性的方法，但从该小鼠模型的愈合肌腱组织中仅能分离出极少量的细胞，且在固定、通透和洗涤步骤中细胞数量进一步减少。考虑到这些因素，流式细胞术因所需动物数量过多而变得不可行。因此，有必要采用一种替代方法，以最大限度地保留这一稀少的细胞群体，从而进一步表征愈合微环境。本文所示的方法是通过细胞离心技术将分离的细胞富集到载玻片上，随后进行免疫细胞化学染色。在本研究中，采用EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷，一种胸腺嘧啶类似物）掺入及后续标记技术，以确定愈合部位细胞的相对增殖状态。该方法可用于评估药理学治疗对细胞增殖的影响、基因敲除或过表达的效果，或用于鉴定和定量不同细胞群体。

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方案

罗切斯特大学动物研究委员会批准了所有动物实验。实验使用10至12周龄的雌性C57BL/6J小鼠。

1. 屈肌腱手术的动物准备（约15分钟）

  1. 将手术器械进行高压灭菌，全程佩戴无菌手套，并保持无菌手术区域。
  2. 通过腹腔注射（i.p.）给予小鼠按体重计算剂量的氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度。
  3. 通过皮下注射给予预先镇痛药物（布托啡诺，0.05–0.1 mg/kg）。涂抹眼膏以防止眼睛干燥。
  4. 通过剪除整个后肢的毛发准备手术部位。依次使用聚维酮碘擦洗皮肤，随后用70%乙醇擦拭，再用聚维酮碘擦拭一次，以对皮肤进行消毒。

2. 小鼠屈肌腱损伤与修复手术（约10分钟）

  1. 找到位于小腿内侧皮下的趾长屈肌（FDL）肌腱。使用手术刀，用显微剪刀在皮肤上做一个0.5–1 cm的小切口，以暴露肌腱。
  2. 使用镊子将FDL肌腱与周围组织分离，并沿其向上追踪至肌腱连接处。用弹簧剪刀在此连接处切断肌腱以将其释放，注意避免损伤胫后动脉。
  3. 用5-0尼龙缝线缝合皮肤。
    注意：FDL肌腱的切断与修复（步骤2.4）应使用体视显微镜进行。
  4. 使用弹簧显微剪刀在后足掌后外侧做一3 mm切口。用镊子轻轻牵开周围的软组织和肌肉，注意尽量减少组织损伤，并辨认出FDL肌腱。
    1. 轻轻提起FDL肌腱，用显微剪刀将其完全切断。使用8-0缝线以改良Kessler法将FDL肌腱两端缝合在一起，注意通过定期滴加生理盐水保持肌腱湿润，避免干燥。
    2. 将软组织和肌肉复位覆盖肌腱，然后用5-0尼龙缝线关闭切口。
  5. 将小鼠置于设定为37 °C的载物片加热器上，以维持体温直至从麻醉中恢复。
  6. 术后密切观察小鼠是否出现功能障碍或感染迹象，如发声增多、毛发竖立等。每12小时注射一次布托啡诺（50 µl/只）作为镇痛剂，直至小鼠不再表现出疼痛或痛苦迹象。
  7. 手术后让小鼠恢复10天，再进行后续步骤。
    注意：可在术后任意时间点采集细胞。本实验选择术后10天，因该时间点组织细胞含量相对较高。

3. 标记周期性细胞（约10分钟）

  1. 配制 EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）溶液（将 10 mg/ml 的 EdU 溶于无菌磷酸盐缓冲液 [PBS] 中，并加入 1% 二甲基亚砜 [DMSO] 以提高溶解度）。
  2. 在小鼠处死前 24 小时，通过腹腔注射给予 100 µl EdU（50 mg/kg）。

4. 收集细胞用于细胞学离心（总时长2.5小时，实际操作时间约30分钟）

  1. 在 PBS 中配制 3 mg/ml 的 I 型胶原酶溶液。
  2. 以不超过 3 L/min 的流速使用二氧化碳窒息法处死小鼠，并以颈椎脱位作为辅助措施。
  3. 利用上述步骤 2.4 定位修复后的肌腱，并用显微剪刀在损伤部位两侧各剪下约 2 mm，以分离肌腱组织。
    1. 在培养皿中用手术刀片将组织切碎，加入 1 ml 3 mg/ml 胶原酶溶液，然后用 18 G 针头反复吹打数次以进一步分散组织，将混合液收集至 1.5 ml 离心管中。
    2. 在 37 °C 条件下振荡消化肌腱组织 1 小时。
    3. 以 300 × g 离心 5 分钟，吸除胶原酶溶液，然后用移液器反复吹打数次，将细胞/组织重悬于 500 µl 含 3% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 中。
    4. 将细胞悬液经 70 µm 细胞滤网过滤，以去除碎片和较大的肌腱组织块，随后置于 37 °C 培养箱中备用。
    5. 将肌腱组织转移至另一 1.5 ml 离心管中，加入 1 ml 新鲜胶原酶溶液，反复吹打混匀。
    6. 在 37 °C 条件下继续振荡孵育 1 小时。
    7. 将消化后的肌腱组织以 300 × g 离心 5 分钟，然后用移液器反复吹打数次，将沉淀重悬于 500 µl 含 3% BSA 的 PBS 中。
    8. 将细胞悬液经 70 µm 细胞滤网过滤，与步骤 4.3.3 中获得的细胞悬液合并，随后用血细胞计数板进行细胞计数。
    9. 用含 3% BSA 的 PBS 再次洗涤细胞一次，然后重悬至 3–6 × 104/100 µl。
  4. 将细胞学离心漏斗安装到带正电荷的载玻片上并固定于载片架中。将整个装置插入细胞离心机，向漏斗中加入 100 µl 细胞悬液，以 300 × g 离心 5 分钟，使细胞均匀分布在载玻片上。

5. 免疫细胞化学法检测 EdU（2 小时，约 45 分钟动手时间）

注意：所有孵育步骤均应在避光条件下进行，以减少荧光染料的光漂白。

  1. 使用疏水性屏障笔在细胞周围画圈，以减少后续步骤所需的溶液量，然后立即加入 150 µl 含 3% 多聚甲醛的 PBS，在室温（RT）下固定 15 分钟。
    1. 用 150 µl 含 3% BSA 的 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
    2. 用含 0.5% Triton-X 100 的 PBS 在室温下对细胞进行透化处理，持续 20 分钟。
    3. 重复步骤 5.1.1 的洗涤步骤。
  2. 按照试剂盒说明书配制 EdU 反应混合液，使用前不超过 30 分钟。
    1. 向每张载玻片加入 150 µl 反应混合液，在室温下孵育 30 分钟。
    2. 重复步骤 5.1.1 的洗涤步骤。
  3. 加入 150 µl 核复染试剂 Hoechst33342（用 PBS 按 1:2,000 稀释），在室温下孵育 30 分钟。
    1. 用 150 µl 1x PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
  4. 向样本上滴加 1–2 滴抗荧光淬灭封片剂，然后缓慢盖上盖玻片，避免产生气泡。
    1. 在室温下避光静置过夜，使封片剂充分固化。
    2. 用透明指甲油将盖玻片密封固定在载玻片上。
  5. 使用配备可检测 DAPI（Hoechst33342）和 Texas Red（Alexa Fluor 594）的激发/发射滤光片的荧光显微镜，以 40 倍放大倍数对载玻片进行成像。

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结果

位于小腿的趾长屈肌（flexor digitorum longus, FDL）通过屈肌腱作用于小鼠后足脚趾的屈曲（在图1A中以蓝色轮廓标示，并在图2A中显示其组织学结构），该肌腱从肌腱连接处近端延伸，止于远端指骨。在此屈肌腱愈合模型中，FDL肌腱在后足趾部分叉近端的足中部被横断并修复（红色箭头，图1A）。为防止修复部位断裂（断裂将导致无法进行实验分析），需在肌腱连接处切断或松解肌腱（及其邻近肌肉）（图1B中的黄色箭头，松解操作见图1C）。尽管该步骤并不模拟临床实际情况，但对保护修复部位至关重要，因其可降低损伤部位所受的张力。图2D展示了屈肌腱修复失败（断裂）的组织学实例，而图2C则显示了成功修复的案例。在成功修复的情况下，肉芽组织的细胞密度显著高于未受伤的肌腱（图2B），该细胞群体可进一步通过细胞离心涂片...

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讨论

本研究介绍了小鼠指深屈肌腱完全横断与修复的手术操作方法。此外，还展示了一种利用细胞学离心机浓缩少量细胞的新应用，从而实现对屈肌腱愈合过程中细胞微环境进行定量免疫细胞化学分析。该屈肌腱修复模型具有可重复的愈合反应，可用于评估基因敲除模型或药物干预对愈合过程的影响。术后24小时内即开始出现炎症反应，细胞被募集至损伤部位，纤维组织痂开始形成。约第4天进入增殖期，修复部位细胞数量显著增加，并大量沉积无序的细胞外基质，导致在14至21天之间形成粘连。组织重塑过程持续至第35天，此时屈肌腱的连续性和结构得以恢复，细胞密度也相应降低18。

目前，除了本文所述模型外，还有多种小鼠屈肌腱修复模型。Tsubone 等人， 已描述一种 体外 屈肌腱愈合模型 19虽然该模型能够评估基因表达随时间的变化，但无法反映外源性细胞的募集或炎症/细胞因子环境的变化 体内. 体内已开发出两种部分横断模型，分别采用切开性或切除性缺损方式 20,21。最近，Wong 等

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益

致谢

本工作部分得到了美国手外科学会启动奖以及美国国立卫生研究院/国家关节与肌肉骨骼疾病研究所 1K01AR068386-01 （授予 AEL）和国家关节与肌肉骨骼疾病研究所/美国国立卫生研究院 P30AR061307 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
手术准备
C57BL/6J 小鼠 Jackson Laboratories000664
氯胺酮HospiraNDC# 0409-2051-05
赛拉嗪Lloyd Inc.NDC# 61311-482-10
丁丙诺啡Par Pharmaceutical Inc.NDC# 42023-179-10
0.9% 氯化钠冲洗液HospiraNDC# 0409-6138-03用于配制氯胺酮/赛拉嗪和丁丙诺啡溶液
1 ml 注射器BD309659
30 G 针头BD305106
聚维酮碘溶液Aplicare82-226
70% 乙醇
Puralube 兽用眼膏Dechra Veterinary ProductsNDC# 17033-211-38
名称公司目录编号备注
手术器械
200 g 便携式天平OhausSP202
弹簧剪刀Fine Science Tools15124-12
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-30
持针器Fine Science Tools91201-13
微型弹簧剪刀Fine Science Tools15003-08
微型持针器Fine Science Tools12061-02
5-0 尼龙缝线Ethicon668G
8-0 显微外科尼龙缝线Ethicon2808G
Lab-Line 组织切片烘片台Barnstead International26025
名称公司目录编号备注
细胞离心涂片法
I 型胶原酶，冻干粉Life Technologies 1700-017
牛血清白蛋白Cell Signaling Technologies9998S
1x PBSThermo Fisher10010-023
细胞学漏斗Fisher HealthCare10-354
HistoBond+ 显微镜载玻片VWR16005-110
Cytospin 2 离心机ShandonSH-CYTO2
名称公司目录编号备注
免疫细胞化学
带黑色盖子的玻片染色槽IHC WorldM920-2
Click-iT Plus EdU 成像试剂盒Life Technologies C10639包含 EdU 和  Hoeschst 33342
Immedge 疏水屏障笔Vector LaboratoriesH-4000
ProLong Diamond 封片剂Thermo FisherP36970
玻璃盖玻片 24 x 50 mm #1.5
透明指甲油

参考文献

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