Method Article

诱导位点特异性复制遇阻电子。大肠杆菌用荧光阻遏操作员系统

DOI:

10.3791/54434

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle

In This Article

Summary

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我们在这里描述了一个系统，该系统利用位点特异性、可逆的体内蛋白质块来阻止和折叠大肠杆菌中的复制叉。通过荧光显微镜评估复制块的建立，并使用中性 - 中性二维琼脂糖凝胶电泳来可视化复制中间体。

Abstract

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障碍物存在于DNA，包括紧密结合的蛋白质和各种病变，会严重抑制细胞的复制机制的进程。一个复制体的失速会导致其分解从染色体，部分或全部，从而导致复制叉的崩溃。从这个崩溃的恢复是细胞准确完整的染色体复制，随后将一个必需品。所发生还原的DNA的叉，并允许复制。因此，当合拢时，细胞已经发展多种机制以高的保真度来完成。先前，在细菌中这些复制修复途径已经使用紫外线的伤害，其具有不被局限于一个已知站点的缺点进行了研究。这份手稿描述了利用荧光阻遏操作员系统（FROS）创建一个特定站点蛋白块，能够引起失速和复制的崩溃FO系统RKS在大肠杆菌 。协议的细节如何复制的状态可在单个活细胞使用荧光显微镜和DNA复制中间体被可视化可以通过2维琼脂糖凝胶电泳进行分析。复制体部件（ 例如 DnaBts）的温度敏感突变体可以被合并到系统以诱导复制叉的一个同步崩溃。此外，所涉及的这些过程的重组蛋白质和解旋酶的作用可以使用本系统内的遗传击倒进行研究。

Introduction

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在DNA复制，在复制体面临上影响其进程中的DNA的障碍。包括病变和差距DNA损伤以及异常的结构可以防止复制体从出发1。最近，人们已经发现，结合到DNA的蛋白是障碍的最常见的来源，以复制叉级数2。以下用核蛋白块的复制体的遭遇的事件的知识先前已受限于无法在已知位置来诱导在活细胞中的染色体这样的块， 在体外分析已经增强了我们的动力学行为的理解当它满足核蛋白堵塞3，以及复制体本身4,5的机械细节的活性复制体。复制的修复当前的理解通常与紫外线的损伤剂进行研究，并在体内 6-8使用质粒DNA 。虽然可参与DNA修复它遇到的体内核蛋白块通常从这些研究中理解后，是否有由于在复制块中的不同原因的修复途径中的分子事件的变化仍还蛋白待确定。

在这里，我们描述了一个系统，它允许在使用荧光阻遏算系统（FROS）的染色体的特定位置，以建立一个核蛋白块。我们利用大肠杆菌菌株已具有整合到染色体9 240 TETO位点的阵列的大肠杆菌 。阵列内的每个TETO站点有侧翼它通过防止在阵列内的RecA介导的重组，以增加阵列的稳定性有10 bp的随机序列。这个数组，它的变化，原本是用来理解E.大肠杆菌染色体动态10,11

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Protocol

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1.阻止复制与FROS

  1. 诱导复制遇阻
    1. 稀释大肠的新鲜过夜培养（为0.17μmKH 2 PO 4，0.72 MK 2 HPO 4 0.1％胰蛋白胨，0.05％酵母提取物，0.1％氯化钠，）用抗生素如需要大肠杆菌菌株携带TETO阵列和PKM1 18至OD 600nm处 = 0.01在稀复合培养基供选择。
      注意:不要以供选择添加四环素，因为它不与本系统相兼容。使培养相当于每样至10毫升所需的体积。例如，对于图1中的实验设计的培养物体积为60毫升
    2. 在30℃生长，振摇直到OD 600纳米 = 0.05-0.1。除去10ml的样品作为未诱导对照和0.1％阿拉伯糖添加到剩余的培养以诱导从PKM1生产四面体-YFP的。继续增长这两个非诱导和诱导文化。 1小时后，检查用荧光显微镜的诱导培养的每个单元内的单个联络点的存在（见第2节）。
    3. 如果诱导细胞证实阻断（细胞的70％以上具有单焦点），记录OD 600nm的和通过2-D凝胶（见第3）取为分析7.5 ml样品。乘坐从非诱导控制文化的等效采样。
  2. 释放复制遇阻
    1. 要释放复制块，无偿诱导无水四环素（AT）的100纳克毫升<....

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Results

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所述FROS是诱导型，特定于站点的核蛋白块，使复制中间体在活细胞12,18被可视化。在图1中所示的一般实验设计的用于进行采样的细胞。在遗传背景的采样和变化的定时使该用于研究这样的块的修复一个通用的系统。概略说明了如何对温度敏感的突变体，如dnaB TS和DNAC TS先前已18使用时，可以在该系统中使用。

该FROS的诱导物在大肠杆菌中进行如在图1中所示的大肠杆菌菌株 用于非温度敏感菌株。要确认核蛋白块已经建立，使用后的0.1％，阿拉伯糖增长1小时荧光显微镜可视化的细胞。这个时限通常是足够的，以产生该块中的野生型菌株，但更苛刻的菌株可能需要优化。大多数细胞含有1焦点（ 图2A，+ ARA），对应于只有一个.......

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Discussion

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在染色体复制过程中，复制机制会遇到各种阻碍其进展的障碍。为了确保整个单源染色体被复制，细菌有许多修复DNA的途径，然后使复制体能够被重新加载20,21。病变、单链断裂、双链断裂和与 DNA 紧密结合的蛋白质都可以使用专用途径进行处理，尽管这些途径可能存在显着重叠。活细胞中复制体最常见的障碍是核蛋白块2。然而，研究复制体与核蛋白阻滞的碰撞的两个长期困难是如何将事件定位到染色体上的已知位置，以及如何使事件足够频繁以进行详细分析。关于 大肠杆菌 如何应对停滞/塌陷的复制叉的大部分知识来自使用紫外线作为 DNA 损伤剂。

这里描述的 FROS 协议是一种创建位点特异性核蛋白障碍的新方法，类似于复制体在复制过程中遇到与染色体紧密结合的蛋白质时会遇到的方法。该块的诱导阻断和受控释放允许以离散的步骤研究 DNA 加工的阶段。用于阻断复制的 tetO 位点阵列先前已用于可视化染色体组织9,10。虽然阵列可以放置在染色体中的任何位置，但就此处描述的阵列而言，它应该远离起点和末端，以避免在解释从起点.......

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Disclosures

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提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了澳大利亚研究委员会 [DP11010246] 的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
胰蛋白胨Sigma-Aldrich16922生长培养基成分
氯化钠VWR27810.364生长培养基成分
酵母提取物Sigma-Aldrich92144生长培养基成分
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP9791生长培养基成分;钾缓冲成分
磷酸氢二钾Sigma-AldrichP3786生长培养基成分;钾缓冲成分
L-阿拉伯糖Sigma-AldrichA3256用于诱导 TetR-YFP 的产生
无水四环素Sigma-Aldrich37919复制bloackage
Axioskop 2 荧光显微镜Zeiss452310细胞可视化
eYFP 滤光片组Chroma Technology41028YFP
CCD 相机HamamatsuOrca-AG
细胞的可视化 MetaMorph 软件 （Molecular Devices）SDR Scientific31282版本 7.8.0.0 用于准备本手稿
琼脂糖BiolineBIO-41025用于琼脂糖塞和凝胶电泳
原装玻璃防水剂 （Rain-X）AutobarnDIO1470用于琼脂糖塞子制造
TRISVWRVWRC103157PTE、TBE 缓冲液组分
乙烯二胺四乙酸Ajax FinechemAJA1800.5 M EDTA 二钠盐溶液，用 NaOH 调节至 pH 8.0。
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002抑菌剂
盐酸Sigma-Aldrich258148TE 缓冲液组分
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750细胞裂解缓冲液组分
N-月桂酰肌氨酸钠盐 （Sarkosyl）Sigma-AldrichL5125细胞裂解和 ESP 缓冲液组分
Rnase ASigma-AldrichR6513细胞裂解缓冲液组分
菌酶Amresco6300细胞裂解缓冲液组分
蛋白酶 KAmrescoAM0706ESP 缓冲液组分
亚细胞模型 192 细胞BioRad1704507电泳系统
紫外透射仪 2000BioRad1708110DNA 可视化
溴化乙锭BioRad1610433DNA 的可视化
酸VWRPROL20185.360TBE 成分
Hybond-XL 尼龙膜烷AmershamRPN203SZeta-Probe 膜烷 （BioRad 1620159） 也可以使用
3MM Whatman 色谱纸GE Healthcare Life Sciences3030690Southern 印迹
HL-2000 HybrilinkerUVP95-0031-01/02DNA 交联和杂交
来自鲑鱼精子的脱氧核糖核酸Sigma-Aldrich31149杂交缓冲液组分
氢氧化钠Sigma-AldrichS5881变性缓冲组分
柠檬酸三钠二水合VWRPROL27833.363转移缓冲液
十二烷基硫酸钠 （SDS）Amresco227缓冲液组分
血清白蛋白Sigma-AldrichA7906杂交缓冲液组分
随机Hexamer引物BiolineBIO-38028
Klenow片段New England BioLabsM0212L
dNTP套装BiolineBIO-39025
腺苷5'-三磷酸-32P-ATP珀金埃尔默BLU502A
存储荧光粉筛选GE Healthcare Life SciencesGEHE28-9564-76BAS-IP MS 3543 E 多用途标准 35 cm x 43 cm 筛选
台风 FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28-9558-09印迹可视化
杂交瓶UVP07-0194-0235 mm x 300 mm
盐酸 的可视化 溶硼物 洗涤牛

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. ....

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