在 E. coli 中利用荧光阻遏蛋白-操纵子系统诱导位点特异性复制阻滞

摘要

我们在此描述一种利用位点特异性、可逆的系统 体内 蛋白阻断导致复制叉停滞和崩溃 大肠杆菌通过荧光显微镜评估复制阻断的建立，并采用中性-中性二维琼脂糖凝胶电泳来可视化复制中间产物。

摘要

DNA 上存在的障碍物，包括紧密结合的蛋白质和各种损伤，会严重抑制细胞复制机器的前进。复制体的停滞可能导致其部分或完全从染色体上解离，从而引起复制叉的崩溃。细胞必须从这种崩溃中恢复，才能准确完成染色体复制并进行后续分裂。因此，当复制叉崩溃发生时，细胞已进化出多种机制来修复 DNA 复制叉，以高保真度完成复制过程。以往对细菌中这些复制修复通路的研究通常使用紫外线（UV）损伤模型，但该方法的缺点是损伤位置无法精确定位。本文描述了一种利用荧光阻遏蛋白-操纵序列系统（FROS）构建位点特异性蛋白阻断的方法，可在 Escherichia coli 中诱导复制叉的停滞与崩溃。文中详细说明了如何通过荧光显微镜在单个活细胞中可视化复制状态，以及如何通过二维琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 复制中间产物。此外，该系统可引入复制体组分的温度敏感型突变体（例如 DnaBts），以诱导复制叉同步崩溃。同时，还可利用该系统中的基因敲除菌株研究参与这些过程的重组蛋白和解旋酶的功能。

引言

在DNA复制过程中，复制体在DNA上会遇到阻碍其前进的障碍。DNA损伤（包括损伤位点和缺口）以及异常结构均可能阻止复制体继续推进¹。最近研究发现，结合在DNA上的蛋白质是阻碍复制叉前进的最常见因素²。过去，由于无法在活细胞染色体的已知位置诱导形成此类阻断，人们对复制体与核蛋白阻断物相遇后所发生事件的认识一直受限。体外分析加深了我们对活性复制体在遇到核蛋白阻断时动力学行为的理解³，同时也揭示了复制体自身的机制细节^4,5。目前对复制修复过程的研究通常以紫外线作为损伤因子，并利用质粒DNA在体内进行研究^6-8。尽管这些研究已基本明确了在DNA遭遇体内核蛋白阻断后可能参与修复的蛋白质，但由于复制阻断的原因不同，修复通路中的分子事件是否存在差异，仍有待进一步确定。

在此，我们描述了一种利用荧光阻遏蛋白-操纵序列系统（FROS）在染色体特定位置建立核蛋白阻断的系统。我们使用了一种菌株 E. coli 含有240个阵列的 tetO 整合到染色体中的位点⁹。每个 tetO 阵列中的每个位点侧翼均含有10个碱基对的随机序列，以防止RecA介导的阵列内重组，从而提高阵列的稳定性。该阵列及其多种变体最初被用于研究 E. coli 染色体动力学<....

方案

1. 使用 FROS 阻断复制

1. 诱导复制阻滞
   1. 稀释一份新鲜的过夜培养物 E. coli 携带的菌株 tetO 阵列和pKM1¹⁸ 至 OD_{600 nm} = 0.01，在稀释的复合培养基中（0.1% 胰蛋白胨，0.05% 酵母提取物，0.1% NaCl，0.17 M KH₂PO₄，0.72 M K₂HPO₄根据筛选需要加入抗生素。
      注意：不要添加四环素进行筛选，因为它与此系统不兼容。将培养物体积调整为每份样品所需10 ml。例如，对于实验设计中的培养物体积 图1 是 60 ml。
   2. 培养于 30 °C 振荡至OD_{600 nm} = 0.05–0.1。取10 ml样品作为未诱导对照，向剩余培养物中加入0.1%阿拉伯糖，以诱导pKM1质粒表达TetR-YFP。继续培养未诱导和诱导的两组培养物。诱导1小时后，使用荧光显微镜检测诱导组培养物中每个细胞内是否出现单一焦点（见第2节）。
   3. 如果诱导后的细胞被确认阻滞（超过70%的细胞具有单个焦点），记录OD值_{600 nm} 取7.5 ml样品用于二维凝胶分析（见第3节）。同时从未诱导的对照培养物中取等量样品。
2. 解....

结果

FROS 是一种可诱导的、位点特异性的核蛋白阻断系统，能够在活细胞中可视化复制中间产物^12,18。用于取样细胞的一般实验设计如图1所示。取样时间点以及遗传背景的差异使该系统成为研究此类阻断修复机制的多功能工具。示意图展示了此前已使用的温度敏感型突变体（如dnaBts 和 dnaCts）¹⁸如何在该系统中被应用。

FROS 的诱导在 E. coli 菌株中进行，如图1所示，适用于非温度敏感型菌株。为确认已形成核蛋白阻断，细胞在含0.1% 阿拉伯糖的培养基中生长1小时后，通过荧光显微镜观察。该时间通常足以在野生型菌株中形成阻断，但对某些更难处理的菌株可能需要优化条件。大多数细胞含有1个焦点（图2A，+ ara），对应于细胞内仅存在一个阵列拷贝，表明复制已被阻断.......

讨论

在染色体复制过程中，复制机器会遇到各种阻碍其前进的障碍。为了确保单一起点的染色体能够完全复制，细菌拥有多种DNA修复途径，从而使得复制体能够重新加载^20,21。对于DNA损伤、单链断裂、双链断裂以及紧密结合在DNA上的蛋白质等不同问题，通常存在特定的修复通路加以应对，尽管这些通路之间可能存在显著的重叠。在活细胞中，复制体最常见的障碍是核蛋白阻断²。然而，长期以来研究复制体与核蛋白阻断发生碰撞所面临的两个难题在于：如何将该事件定位到染色体上的已知位置，以及如何使该事件的发生频率足够高，以便进行详细分析。目前关于大肠杆菌（E. coli）如何应对停滞或崩塌复制叉的大部分知识，主要来源于使用紫外线（UV）作为DNA损伤剂的研究。

本文所述的 FROS 协议是一种创建位点特异性核蛋白障碍的新方法，类似于复制体在复制过程中遇到紧密结合于染色体上的蛋白质时所遭遇的情况。通过诱导阻断并可控地释放该阻断，可将 DNA 加工过程的各个阶段以离散步骤进行研究。用于阻断复制的 tetO 位点阵列此前已被用于染色体结构的可视化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	Sigma-Aldrich	16922	生长培养基组分
氯化钠	VWR	27810.364	生长培养基组分
酵母提取物	Sigma-Aldrich	92144	生长培养基组分
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P9791	生长培养基组分；钾缓冲液组分
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	P3786	生长培养基组分；钾缓冲液组分
L-阿拉伯糖	Sigma-Aldrich	A3256	用于诱导 TetR-YFP 表达
盐酸脱水四环素	Sigma-Aldrich	37919	解除复制阻断
Axioskop 2 荧光显微镜	Zeiss	452310	细胞观察
eYFP 滤光片组	Chroma Technology	41028	YFP 观察
CCD 相机	Hamamatsu	Orca-AG	细胞观察
MetaMorph  软件（Molecular Devices）	SDR Scientific	31282	本文稿件制备中使用版本为 7.8.0.0
琼脂糖	Bioline	BIO-41025	用于制备琼脂糖胶块和凝胶电泳
Original Glass Water Repellent（Rain-X）	Autobarn	DIO1470	用于琼脂糖胶块制备
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE、TBE 缓冲液组分
乙二胺四乙酸	Ajax Finechem	AJA180	用 NaOH 调节至 pH 8.0 的 0.5 M EDTA 二钠盐溶液
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002	抑菌剂
盐酸	Sigma-Aldrich	258148	TE 缓冲液组分
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750	细胞裂解缓冲液组分
N-月桂酰肌氨酸钠盐（Sarkosyl）	Sigma-Aldrich	L5125	细胞裂解和 ESP 缓冲液组分
RNase A	Sigma-Aldrich	R6513	细胞裂解缓冲液组分
溶菌酶	Amresco	6300	细胞裂解缓冲液组分
蛋白酶 K	Amresco	AM0706	ESP 缓冲液组分
Sub-Cell Model 192 电泳槽	BioRad	1704507	电泳系统
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	DNA 观察
溴化乙锭	BioRad	1610433	DNA 观察
硼酸	VWR	PROL20185.360	TBE 组分
Hybond-XL 尼龙膜	Amersham	RPN203S	也可使用 Zeta-Probe 膜（BioRad 1620159）
3MM Whatman 层析纸	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern 印迹
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	DNA 交联与杂交
鲑鱼精 DNA	Sigma-Aldrich	31149	杂交缓冲液组分
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881	变性缓冲液组分
柠檬酸三钠二水合物	VWR	PROL27833.363	转移缓冲液
十二烷基硫酸钠（SDS）	Amresco	227	洗涤缓冲液组分
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906	杂交缓冲液组分
随机六聚体引物	Bioline	BIO-38028
Klenow 片段	New England BioLabs	M0212L
dNTP 混合物	Bioline	BIO-39025
腺苷-5’-三磷酸-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
存储磷屏	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E 多功能标准屏，35 cm × 43 cm
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	印迹成像
杂交瓶	UVP	07-0194-02	35 mm × 300 mm