程序的微生物实验室自适应演化的恒化

Summary

在这里，我们提出了一个协议，以获得使用恒化培养条件下微生物实验室适应性进化。此外，演进的株的基因组分析进行了讨论。

Abstract

自然进化涉及遗传多样性，例如环境变化和小种群之间的选择。适应性实验室进化 （ALE） 是指在受控条件和压力源下使用生物体观察进化的实验情况;因此，生物体被人为地强迫进行进化改变。微生物受到环境中各种压力源的影响，并且能够调节某些压力诱导的蛋白质以增加它们的生存机会。自然发生的自发突变会导致微生物基因组发生变化，从而影响其生存机会。长期暴露于恒化器培养物会引起自发突变的积累，并使适应性最强的菌株占主导地位。与集落转移和连续转移方法相比，恒温器培养需要最多的细胞分裂次数，因此也需要最多的不同群体。尽管 ALE 的化学止化器培养需要更复杂的培养设备，但一旦作开始，其劳动强度就较低。适应菌株的比较基因组和转录组分析提供了关于应激源如何促进克服应激的突变的进化线索。本文的目标是在受控的实验室条件下加速微生物的进化。

Introduction

微生物可以生存和适应不同的环境。在严峻的压力，可以通过随机的基因组突变和随后的正选择^1-3取得有益的表型发生调整。因此，微生物细胞可以通过改变代谢或调控网络对于最佳生长，这被称为"自适应进化"适应。最近的重要微生物的倾向，比如超级细菌爆发和强大的微生物菌种的发生，关系非常密切的压力条件下的适应性进化。下定义的实验室条件下，我们能够研究分子进化的机制和甚至控制各种应用微生物进化的方向。与多细胞生物，单细胞生物是非常适合自适应进化实验室（ALE），原因如下:他们很快再生，他们认为大量的人口，而且很容易创建和维护坎ogeneous环境。随着DNA测序技术和高通量技术最新进展相结合，ALE允许对基因组的变化，导致系统性监管政策的变化直接观察。突变动力学和人口的多样性也观察到。遗传工程策略可以从ALE菌株^4,5的分析来确定。

恒化器培养是用于获得稳态细胞和发酵过程⁶提高生产率的方法。新鲜培养基，并将该过程（后者包括介质和生物量）中培养液收获。长期培养恒然而，改变了文化的稳态生产力和文化（ 图1a）期间带来的自发突变和选择的积累。在各种选择压力（压力），突变的积累被提高。应力的长期逐渐增加恒化器提供了用于对给定的压力工作的突变，如温度，pH，渗透压，营养饥饿，氧化，有毒最终产品等菌落转移从液体介质中的固体培养基和串行传输（重复的连续选择分批培养），也让研究人员....

Protocol

1.设备的准备

1. 得到恒化器罐子（150-250毫升）或含有一个入口的Erlenmeyer烧瓶（250ml）和一出口。用硅管允许10-100毫升/小时的流速连接的端口。任选地，使用空气通气口，出气口，和温度控制的水的入口和出口端口。
2. 获得适合的恒化器罐子提供用于搅拌和温度控制装置（或使用旋转式摇床）。
3. 以提供新鲜培养基，并收集培养获得两个蠕动泵。
4. 得到含有介质出口和一个吸入口的储存罐（10-20升）。
5. 获得适合于稀释率硅管（ 即 ，ID0.8毫米，流量范围0.06-36毫升/分钟; L / S 13管）。

2.中型准备和灭菌

1. 初始介质
   1. 溶解0.3克葡萄糖，0.08克NH ₄氯，0.05克氯化钠，0.75克Na ₂ HPO _{4·2H 2} O，和0.3g KH ₂ PO ₄在90ml蒸馏水（DW）以恒化器罐子。
   2. 密封罐子恒用夹子管子一起。不密封该通气孔。
   3. 消毒在高压釜中的恒化器罐子在121℃下进行15分钟。灭菌后，在室温下储存的恒化器罐子。
   4. 溶解0.02克用MgSO _{4·7H 2} O 0.....

Results

对于高琥珀酸应力适应，野生型E.大肠杆菌 W3110菌株是一个恒化器培养在D = 0.1小时^-1 270天（ 图2）。

图2:E的高琥珀酸压力调适大肠杆菌 W3110采用恒化的文化。细箭头表示在该压力源浓度增加，与时俱进，大胆的箭头表示在该培养物保存的时间。用箭头数字表示应激，琥珀酸二钠六水合物的浓度。在生物量的ALE期间和变化压力源的浓度来表示。这个数字是从J.修改BIOSCI。生物工程学 ^7。 请点击此处查看该图的放.......

Discussion

微生物能够适应，因为他们的速度快速增长和遗传多样性几乎所有的环境。自适应实验室进化使微生物设计条件，这提供了选择个体生物窝藏自发突变是在给定的条件下有利的方式下发展。

恒化器的技术是用于实现比转移技术人工驱动进化原因如下更健壮:（a）一种稳定的环境 - 因为传输技术基于分批培养物无论是在固体或在液体介质中，该细胞的环境批次期间变化文化而恒化的环境压力稳定; （二）更多的人口和连续的选择 - 恒化的人口大提供了比转移技术的小群体更多的遗传多样性。该通道的连续选择emostat技术是实现进化比转移技术间歇选择一个更快的方法。至关重要的是，在恒化器培养不会受其它微生物的ALE过程中被污染，并在无菌条件是必需的整个恒化培养。在ALE程序可以通过改变压力，如氧化应激，渗透胁迫和有毒产品的压力进行修改。有由恒化培养了一些技术限制ALE。进化是偶然发生;因此，不同的研究人员可能不能够获得相同的进化结果，虽然突变的后果可能是相关的。另一个限制是在洗出恒化培养的时应激的浓度过快增加。如果生物量降低到一定量的（ 即 ，OD = 0.2在此过程中）应激物的浓度增加后，应激物施用应当停止.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
微型恒温发酵罐	Biotron Inc.	-	由特殊订单硅
管	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	管尺寸可根据稀释速率和发酵罐的大小而变化。
储液罐	Bellco	培养基储存瓶	20 L
化学品	Sigma-Aldrich		试剂级
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	ACS 试剂
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	用于分子生物学，适用于细胞培养，≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS 试剂，≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS 试剂，≥99%
硫酸镁4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS 试剂，≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS 试剂，≥96%
硫胺素·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	试剂级，≥99%
Na2·琥珀酸盐·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus， ≥99%