用于检测紫外反射结构并确定其在帆鳍花鳉 Poecilia latipinna 择偶偏好中作用的实验方法

摘要

本方案概述了利用分光光度法检测生物体上紫外线反射结构的方法（以帆鳍花鳉 Poecilia latipinna 为例），并描述了用于鱼类的二元选择实验，以推断紫外线信号在配偶选择过程中的作用。

摘要

许多生物在社交互动中会利用超出人类感知范围的线索和信号。在研究生物的行为与生态时，必须考虑它们如何感知自身所处的世界。对紫外光谱（UV；300 - 400 nm）的敏感性广泛存在于多个鸟类、鱼类、爬行动物、两栖动物，甚至哺乳动物的属中。本实验方案介绍了一种检测生物体是否存在紫外反射结构的技术，以及一种用于检验这些线索是否在配偶选择情境中作为社交信号使用的方法。通过分光光度计检测紫外反射的存在，以及个体间和性别间反射强度的差异。本文展示了一个应用该技术的实例：在双选择配偶偏好实验中，使性活跃的个体面对异性的个体，而后者视觉外观可通过滤光片进行操控，这些滤光片可透射全光谱或阻断紫外波段。该系统得以确定，雌性帆鳍花鳉 (Poecilia latipinna)在交配决策中会利用紫外标记，而雄性则不会。此类研究有助于拓展我们对利用紫外光的生物种类范围的认识，并揭示紫外光在其生命活动中所起的作用。

引言

了解动物社会互动中所使用的线索和信号，有助于我们理解种内和种间表型变异。这种变异在种群分化、性选择和物种形成等进化过程中发挥着重要作用。然而，研究人员通常局限于探索对人类感官系统最明显的线索，尤其是视觉或听觉范围内的线索。通过使用分光光度法，我们能够将研究范围扩展到人类可见光谱之外，进入可能在其他物种社会互动中具有重要意义的波长区域。

特别是，紫外线（UV；300 - 400 nm）敏感性所提供的短距离通信在配偶选择过程中可能具有显著优势¹。例如，许多依靠视觉捕食鸟类和鱼类的捕食者无法检测到紫外线辐射。在雄性向雌性进行复杂展示的系统中，雄性若利用紫外线光谱而非可见光谱中的信号进行交流，便可在维持吸引配偶能力的同时降低被捕食的风险^2,3。如果忽视生物体可能正在利用这些"私密通信通道"相互交流的可能性，则可能遗漏影响行为与进化的重要驱动因素。

本实验方案旨在研究帆鳍花鳉（Poecilia latipinna）在配偶选择中利用紫外光（UV）线索的行为。帆鳍花鳉是一种多配偶制鱼类，此前并未发现其具有感知紫外光或利用紫外标记的能力。该物种在系统发育上与其他对紫外光敏感的卵胎生鱼类关系密切⁴ ，且已有显微光谱学证据表明，P. latipinna 以及其他花鳉属物种（如 P. mexicana 和 P. formosa）具有一类视锥细胞（负责色觉的感光细胞），其对紫外波长最为敏感⁵。在这一具有明显性别二态性的物种中，雌性选择在雄性鲜艳且扩大的鳍的演化过程中起到了重要作用^6-9。本方法使我们能够探究紫外光是否是雌性评估雄性质量的另一种媒介。

本文详细介绍了使用配备光纤探头的分光光度计检测和测量P. latipinna紫外线标记的方法。此外，还探讨了具有接受性的雌性 mollies 在观察通过透射全光谱（包括 UV-A，[UV+]；320 - 700 nm）的光学滤光片与通过阻断紫外线滤光片（[UV-]；400 - 700 nm）呈现的雄性个体时，是否表现出不同的偏好行为。该方法在发现鱼类及其他生物中的紫外线敏感性与色彩模式方面具有广泛应用，有助于开展涉及紫外线及其在行为中作用的多种科学研究。

方案

所有实验均经俄亥俄卫斯理大学机构动物照护与使用委员会批准后进行。

1. 使用分光光度计记录鱼类的紫外反射率

1. 根据仪器或软件的建议，使用已知的白色标准在待测波长范围内校准分光光度计和光源。
2. 将鱼置于含有0.5%三甲基苯甲酸甲磺酸盐（MS-222）的溶液中，并加入等量碳酸氢钠缓冲，以麻醉鱼体，直至鱼失去反应。一旦鱼失去反应，立即将其放置在黑色、无反光的背景上。注意：MS-222可能具有毒性，操作时应始终佩戴手套。
3. 所有测量均应在暗室中进行，以尽量减少除分光光度计光源以外的多余光线干扰。
4. 使用光纤探头紧贴生物体表面测量反射率。确保光纤与生物体表面之间保持一致的45°角，部分探头设计中已内置该角度。注意：为保证测量一致性，可对每个身体区域进行多次扫描（2–5次）并取平均值。
5. 使用适当的反射率分析软件记录反射率数据。注意：本实验所用软件设置为：积分时间 = 2,000 秒，平均扫描次数 = 2，像素平滑 = 5。数据被复制并粘贴至电子表格中。
6. 在多个身体区域重复测量，以确定是否存在紫外反射以及个体间表型变异的范围。注意：初步扫描可能有助于确定哪些身体区域（如有）稳定显示紫外标记。
7. 将鱼放回充氧充足的暂养水族箱中，直至其完全恢复，表现为鳃盖正常开合及正常游动行为。注意：可添加市售保护剂以恢复体表黏液层，促进皮肤修复。
8. 在多个个体中重复上述操作，如需要可包括两性个体。
9. 在已汇总所有数据的电子表格中，使用散点图绘制数据，以反射率为Y轴，波长为X轴。紫外波段（300–400 nm）内的振幅峰值表明鱼体存在紫外反射。

2. 双向交配试验

注意：进行对照观察，其中放置目标鱼、紫外滤光片和不透明滤光片。在这些试验中，当移除不透明滤光片时，目标鱼将暴露于鱼缸中具有和缺乏紫外光的区域，但这些区域不包含潜在的交配对象。有关本实验中二元选择测试有效性的详细信息，请参见Palmer和Hankison（2015）¹⁰，但需注意此类测试也存在局限性¹¹。

1. 使用性接受的个体作为观察对象，使用雌性 P. latipinna < 产后48小时⁵ 并在测试前至少隔离24小时，以提高其性动机的可能性。
2. 将一个焦点个体放入靠近两个选择区的中性区域。对于 P. latipinna 使用一个75.7 L的测试水族箱（30.5 cm × 30.5 cm × 75 cm； 图1由透明的Plexiglas隔板将水箱分为三个区域，形成一个中央区域供目标个体活动，两侧为大小相等的选择区。确保各水箱区域之间无水流或嗅觉信号交换。对每个待观察个体均重复此设置。

图1. 实验水族箱装置。 一个矩形水族箱被分为三个区域：中央区域用于放置目标个体，两个端部分隔区用于放置成对的物体（图中显示中央为一只雌性，两端为雄性个体）。可在分隔雌雄区域的玻璃隔板上放置可更换的滤光片，以选择性阻断或允许紫外线反射。该图改编自Palmer和Hankison（2015） ¹⁰。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 在全光谱光照条件（光谱延伸至紫外A波段的光照）下，将一个潜在的交配对象置于测试水族箱两端的每个隔间（选择隔间）中。确保两个潜在交配对象在体型、体色和展示特征上尽可能相似，从而使被隔离的两个交配对象之间最主要的区别在于其是否位于阻隔或透过紫外光的滤光片后方。
   注意：尽管本实验中颜色匹配是通过肉眼完成的，但建议在可见光谱范围内记录反射率，以实现最佳的颜色匹配。
4. 在视觉隔离（使用不透明滤光片）条件下使个体适应15分钟。确保此时已正确放置允许或阻止紫外线透过的滤光片（UV+ 和 UV- 滤光片）。适应结束后，移除不透明滤光片。为确保不存在侧向偏好（即个体对水箱任一侧的固有偏好，与物体无关），随机分配紫外线⁺ 和紫外光^- 每次试验中水箱的两侧。
5. 使用秒表记录目标个体在特定偏好区域（即选择隔间附近，此处约为两个标准体长的距离范围内）所花费的时间。对于雌性鱼，记录其在两条雄性鱼各自附近的停留时间；对于雄性目标鱼，则记录其在两条雌性鱼各自附近的停留时间。
   注意：也可使用事件记录软件进行记录。本实验采用15分钟的试验时长，对至少未访问过一次各偏好区域的鱼类，因其无响应表现，故从结果中剔除。
6. 记录并分析鱼类在空置紫外线区域附近停留的时间⁺ 和紫外光^- 隔室以确保不存在对特定光照环境的固有偏好，从而避免影响鱼类的交配选择。采用配对t检验来确定个体是否偏好某种紫外光条件。

结果

图1和图2展示了我们实验中用于交配偏好测试的水族箱装置以及紫外光测量位点。

通过测量紫外反射率，确定了P. latipinna确实具有紫外特征，尤其在其身体两侧（图3），并且这些特征存在个体差异。在发现紫外特征后，实验结果表明，雌性P. latipinna在交配选择中会利用这些特征，而雄性则不会（雌性：t₁₅ = 4.08，p = 0.001；雄性：t₁₄ = 0.67，p = 0.517；图4）。尽管两性均具有紫外特征，但仅雌性将其用于配偶偏好，这可能表明这些特征在P. latipinna的其他社会行为（如群游或觅食）中也具有一定作用。

讨论

分光光度法成功鉴定了 P. latipinna身上的紫外标记。P. latipinna的两性个体在体侧均具有紫外标记。此外，部分雄性个体的背鳍上也存在紫外标记，而这一特征此前已被发现对雌性交配偏好具有重要意义⁷。

我们建议使用紫外分光光度法作为检测紫外标记存在的手段。进一步的研究可确定其在社会互动中的作用，包括交配偏好（如本文所述）。此外，紫外特征可能影响群集行为、个体识别、性别识别、物种识别或种内性别间的相互作用^{3, 12-15}。

尽管分光光度法在深入理解生物体的紫外特性（尤其是与其社会行为相关方面）方面具有重要价值，但仍有一些关键步骤需要完成，才能全面理解这些行为，同时该方法的结论也存在一定的局限性。所有实验均应通过在两侧选择箱中设置不含测试个体的对照组，来检验目标个体是否对含紫外（UV⁺）或不含紫外（UV^-）的环境具有偏好，尤其因为阻断紫外光可能引起生物所感知的"亮度"或光亮度发生变...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分光光度计，P1000	Ocean Optics		更新的型号可供选择
DT 1000 氙紫外光源	Ocean Optics		更新的型号可供选择
Ocean Optics Overture 软件	Ocean Optics		更新版本的软件可供使用
R200-Angle-UV 分叉光纤探头（Guided Wave）	Ocean Optics		更新的型号可供选择
经认证的白色反射标准板	labsphere
75.7 L 水族箱，带分隔	Experimental Builder
全光谱灯泡	Nature's Sunlight
紫外线阻隔片	GAM UV Sheet