在这些研究中，我们提供了一种用于再生研究的新型新生小鼠心脏支架的方法学。
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摘要
摘要
治疗终末期心力衰竭的唯一确切方法是原位心脏移植。据估计，每年在美国进行心脏移植手术需要超过10万个供体心脏1-2。由于供体数量有限，美国每年仅能实施约2400例心脏移植手术2。迄今为止，已尝试多种方法，包括细胞治疗研究和植入机械辅助装置，单独或联合应用，旨在促进心脏自我修复或使衰竭的心脏得到休息3。尽管如此，目前心室辅助装置仍主要用于移植前的过渡治疗，而细胞治疗虽然具有一定的治愈潜力，但其应用仍局限于临床试验阶段。此外，异种直接移植也曾被尝试，但由于免疫排斥反应，成功率有限。显然，迫切需要另一种策略来制造可供移植的额外器官，理想情况下这些器官应为自体来源，以避免排斥反应及终身免疫抑制所带来的并发症。脱细胞化是一种去除组织中固有细胞以暴露天然细胞外基质（ECM）或支架结构的过程。灌注法脱细胞化可在保持组织大部分力学特性完整的同时，完整保留其三维结构4。这些支架可用于接种健康细胞，以构建研究模型，甚至可能生成急需的移植用器官。我们对新生小鼠（P3期）心脏进行了去污剂介导的脱细胞化处理，该阶段小鼠心脏已知具有显著的心脏再生能力5-8，并使用小鼠心肌细胞对所得支架进行再细胞化。这些研究证实了构建新生期心脏结构的可行性，同时也为进一步探索出生后早期心脏ECM是否含有可促进更优再细胞化策略的生物学信号提供了可能。
引言
心力衰竭是一种常见且致命的疾病。它是一种进行性疾病，会导致心脏收缩功能下降，从而损害向器官的血液供应，无法满足机体的代谢需求。据估计，美国有570万人患有心力衰竭，且它是美国住院治疗的主要原因9。在美国，治疗心力衰竭患者的总费用每年超过3000亿美元9-10。终末期心力衰竭的唯一根治性疗法是原位心脏移植。据估计，每年美国需要超过10万个供体心脏用于心脏移植手术1-2。由于供体数量有限，美国每年仅能实施约2400例心脏移植手术2。显然，必须解决器官短缺问题，因此需要开发其他策略以获得更多可用于移植的器官，理想情况下这些器官应为自体来源，以避免排斥反应及终身免疫抑制所带来的并发症。
哺乳动物成体心肌细胞在损伤后表现出有限的再生能力，但最近的研究表明，哺乳动物新生心脏在损伤后仍具有显著的再生能力5-8。具体而言，在出生至出生后第7天之间存在一个再生时间窗口，该窗口可通过部分外科切除术诱导发现。这一再生阶段的特征包括无纤维化瘢痕形成、新生血管生成、心外膜释放促血管生成因子以及心肌细胞增殖5-8,11。这一短暂的再生时间窗口为利用新生心脏作为构建生物人工心脏的新型材料来源提供了潜在可能。
已知细胞外基质可提供重要的信号，以促进心肌细胞的增殖与生长。已有研究探讨了新生期和成年期基质中分子可及性的显著差异....
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方案
所有小鼠实验均依照美国动物福利法进行，并经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 小鼠心脏分离方法
- 使用一次性刀片通过断头法处死新生小鼠。
- 用70%乙醇擦拭胸部。
- 用标准剪刀剪开胸壁皮肤，并用#5镊子向侧方牵拉皮肤，将其从胸壁分离。
- 用剪刀在胸骨下方穿刺腹壁，进入腹腔。用#5镊子夹住剑突，向上前方牵拉胸骨，同时用剪刀剪断胸廓两侧的肋骨。用镊子将肋骨向上翻折，暴露心脏。
- 用#5镊子向侧方钝性分离胸腺的两个主要叶，暴露主动脉弓以及上下腔静脉和肺静脉。
- 用10 cm弹簧剪剪断主动脉弓发出的主要动脉及主动脉本身，保留心脏基底部至无名动脉之间的主动脉段。用#5镊子夹住被切断血管的断端，向前翻折心脏，使其与气管和食管分离。
- 用10 cm弹簧剪在心脏两侧肺与心脏之间剪断肺血管系统及其他主要静脉，保持静脉开放以利于引流。
- 用#5镊子夹住主要血管的断端，将心脏从纵隔中取出，放入含有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的60 mm培养皿中，用于后续插管操作。
2. 通过兰格多夫灌注进行脱细胞的方法
- 预先准备好导管组件。将一段 4 cm 的 PE 50 管在小型酒精火焰中拉制，以制成更小、更细的导管。用刀片修剪两端，使其达到所示尺寸（外径约 300 µm，末端带扩口，外径约 500 µ....
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结果
脱细胞化
根据该方案，对 P3 新生小鼠心脏（平均重量为 23 mg）进行脱细胞化处理，平均所需时间约为 14 小时。
无细胞性
图3a展示了一个完整的P3新生小鼠心脏（整体封片）。图3b显示同一心脏经脱细胞处理后的结果。图4a和图4b分别为完整心脏与脱细胞心脏的苏木精-伊红染色结果。注意脱细胞心脏中苏木精阳性的细胞核消失，嗜伊红结构也明显减少。此外，脱细胞心脏的DNA含量从完整心脏的68.08 ± 2.25 µg（n=6）显著降低至4.73 ± 2.27 µg（n=5）。
胶原蛋白免疫反应性
去细胞化后细胞外基质（ECM）的保留对于外源性细.......
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讨论
该技术依赖于对心脏的反复灌注，因此避免栓塞是获得成功结果的关键环节。从步骤2.2-2.6中心脏的初始插管，到步骤2.8-2.14之间溶液的更换，每一个操作步骤均可能引入气泡，从而影响灌注液向心肌组织的正常流动。由于新生心脏体积微小，即使血管系统中存在极微小的气泡，也可能导致技术性梗死，从而使脱细胞过程不完全。此外，在后续的洗涤步骤中，灌注不充分可能导致去垢剂残留，进而对生物相容性产生负面影响。而且，温度的快速变化（例如按照步骤2.14建议将基质从4 °C储存环境中取出时）也需谨慎处理，因为温度改变可使溶解的气体析出形成气泡。在进行再细胞化操作时，配制细胞悬液的注射器应特别注意确保灌注过程中无气泡（步骤6.4）。
可能需要调整本方案的具体参数以适应其他类型的组织。已有多种脱细胞化方案被报道4,9,11，可提供参考。任何脱细胞化方案的最终目标都应包括维持细胞外基质（ECM）蛋白结构及相关生化特性，并充分去除天然细胞成分，后者可通过残留DNA的含量来评估。在此背景下，过高的灌注压力会导致ECM超微结构的破坏，这一现象可通过组织学方法观察到。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者们衷心感谢辛西娅·德凯女士在图表绘制方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1. 小鼠心脏分离所需材料 | |||
| P1 小鼠幼崽（如图所示；B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J） | Jackson Laboratories | 21577 | 或同等产品 |
| 60 mm 培养皿 | BD Falcon | 353004 | 或同等产品 |
| 磷酸盐缓冲液 pH 7.4（无菌） | Hyclone | SH30256.01 | 或同等产品 |
| 一次性刀片 | Stanley | 28-510 | 或同等产品 |
| 标准剪刀 | Moria Bonn（Fine Science Tools） | 14381-43 | 或同等产品 |
| 弹簧剪刀 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | 或同等产品 |
| Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口 | Fine Science Tools | 15000-00 | 或同等产品 |
| #5 镊子 | Dumnot（Fine Science Tools） | 11295-00 | 或同等产品 |
| 2. 脱细胞化所需材料 | |||
| 进样接头 | Chemglass | CG-1013 | 可高压灭菌 |
| 隔垫 | Chemglass | CG-3022-99 | 可高压灭菌 |
| 内径 1/8 英寸 × 外径 3/8 英寸 C-Flex 管 | Cole-Parmer | EW-06422-10 | 可高压灭菌 |
| 公鲁尔接头转 1/8" 软管接头 | McMaster-Carr | 51525K33 | 可高压灭菌 |
| 母鲁尔接头转 1/8" 软管接头 | McMaster-Carr | 51525K26 | 可高压灭菌 |
| Prolene 7-0 外科缝合线 | Ethicon | 8648G | 或同等产品 |
| 铁架台 | Fisher Scientific | S47807 | 或同等产品 |
| 夹子 | Fisher Scientific | 05-769-6Q | 或同等产品 |
| 夹子常规支架 | Fisher Scientific | 05-754Q | 或同等产品 |
| 60 cc 注射器筒体 | Coviden | 1186000777T | 或同等产品 |
| 烧杯 | Kimble | 14000250 | 或同等产品 |
| 22 G × 1 注射器针头 | BD | 305155 | 或同等产品 |
| 12 cc 注射器 | Coviden | 8881512878 | 或同等产品 |
| 三通旋塞阀 | Smith Medical | MX5311L | 或同等产品 |
| PE50 管 | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | 必须可通过加热塑形。推荐使用聚乙烯材质。 |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | 推荐使用超纯级。使用前新鲜配制并过滤除菌。 |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 使用 10% 储存液新鲜配制，并在使用前过滤除菌。 |
| 无菌 dH2O | Hyclone | SH30538.02 | 或 MilliQ 系统纯化水。 |
| 1× 青霉素/链霉素 | Corning CellGro | 30-001-Cl | 或同等产品 |
| 3. DNA 定量所需材料 | |||
| 蛋白酶 K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg 活性 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | 或同等产品 |
| MgCl2·6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | 或同等产品 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 或同等产品 |
| Tris 碱/盐酸盐 | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | 或同等产品 |
| Pico-Green dsDNA 检测试剂盒 | Life Technologies | P7589 | 需使用荧光计读数 |
| 4. 组织固定与切片方法 | |||
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 或同等产品 |
| 猪皮来源 A 型明胶 | Sigma-Aldrich | G2500 | 必须为 300 bloom 或更高 |
| 5. 组织学方法 | |||
| 冷冻模具 10 × 10 × 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | 或同等产品 |
| 冷冻切片机 | Hacker/Bright | Model OTF | 或同等产品 |
| 显微镜载玻片 25 × 75 × 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | 或同等产品 |
| 苏木精 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | 或同等产品 |
| 乙醇 | Decon Laboratories | 2701 | 或同等产品 |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | 或同等产品 |
| 蓝色缓冲液 | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | 或同等产品 |
| 醇溶性伊红 Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | 或同等产品 |
| Formula 83 二甲苯替代品 | CBG Biotech | CH0104B | 或同等产品 |
| Permount 封片介质 | Fisher Chemical | SP15-500 | 或同等产品 |
| IV 型胶原抗体 | Rockland | 600-401-106.1 | 或同等产品 |
| α-肌动蛋白抗体 | Abcam | AB9465 | 或同等产品 |
| mCherry 抗体 | Abcam | AB205402 | 或同等产品 |
| NKX2.5 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | 或同等产品 |
| 驴抗小鼠 AF488 抗体 | Life Technology | A21202 | 或同等产品 |
| 驴抗鸡 AF594 抗体 | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | 或同等产品 |
| 驴抗山羊 CY5 抗体 | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | 或同等产品 |
| Fab 片段山羊抗兔 IgG（H+L）AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | 或同等产品 |
| 含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | ThermoFisher | P36930 | 或同等产品 |
| 6. 使用预铺板法分离新生大鼠心室心肌细胞 | |||
| HBSS（无钙、无镁） | Hyclone | SH30031.02 | 或同等产品 |
| HEPES（1 M） | Corning CellGro | 25-060-Cl | 或同等产品 |
| 细胞筛 | BD Falcon | 352340 | 或同等产品 |
| 50 ml 离心管 | BD Falcon | 352070 | 或同等产品 |
| Primeria 100 mm 培养板 | Corning | 353803 | Primeria 表面可增强成纤维细胞贴附，从而提高心肌细胞纯度 |
| 胰蛋白酶 | Difco | 215240 | 或同等产品 |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | 或同等产品 |
| DMEM（Dulbecco 改良最低必需培养基） | Hyclone | SH30022.01 | 或同等产品 |
| 维生素 B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | 或同等产品 |
| 纤维连接蛋白包被培养板 | BD Bioscience | 354501 | 或同等产品 |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30910.03 | 或同等产品 |
| 心脏生物反应器玻璃器皿 | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | 必须可通过高压灭菌或气体灭菌。 |
参考文献
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al.
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