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方法文章

新生心脏支架：再生研究中的新型基质

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DOI：

10.3791/54459

⸱

2016年11月5日

 ,  , 
1Lillehei Heart Institute, University of Minnesota

本文内容

摘要

在这些研究中，我们提供了一种用于再生研究的新型新生小鼠心脏支架的方法学。

摘要

治疗终末期心力衰竭的唯一确切方法是原位心脏移植。据估计，每年在美国进行心脏移植手术需要超过10万个供体心脏1-2。由于供体数量有限，美国每年仅能实施约2400例心脏移植手术2。迄今为止，已尝试多种方法，包括细胞治疗研究和植入机械辅助装置，单独或联合应用，旨在促进心脏自我修复或使衰竭的心脏得到休息3。尽管如此，目前心室辅助装置仍主要用于移植前的过渡治疗，而细胞治疗虽然具有一定的治愈潜力，但其应用仍局限于临床试验阶段。此外，异种直接移植也曾被尝试，但由于免疫排斥反应，成功率有限。显然，迫切需要另一种策略来制造可供移植的额外器官，理想情况下这些器官应为自体来源，以避免排斥反应及终身免疫抑制所带来的并发症。脱细胞化是一种去除组织中固有细胞以暴露天然细胞外基质（ECM）或支架结构的过程。灌注法脱细胞化可在保持组织大部分力学特性完整的同时，完整保留其三维结构4。这些支架可用于接种健康细胞，以构建研究模型，甚至可能生成急需的移植用器官。我们对新生小鼠（P3期）心脏进行了去污剂介导的脱细胞化处理，该阶段小鼠心脏已知具有显著的心脏再生能力5-8，并使用小鼠心肌细胞对所得支架进行再细胞化。这些研究证实了构建新生期心脏结构的可行性，同时也为进一步探索出生后早期心脏ECM是否含有可促进更优再细胞化策略的生物学信号提供了可能。

引言

心力衰竭是一种常见且致命的疾病。它是一种进行性疾病，会导致心脏收缩功能下降，从而损害向器官的血液供应，无法满足机体的代谢需求。据估计，美国有570万人患有心力衰竭，且它是美国住院治疗的主要原因9。在美国，治疗心力衰竭患者的总费用每年超过3000亿美元9-10。终末期心力衰竭的唯一根治性疗法是原位心脏移植。据估计，每年美国需要超过10万个供体心脏用于心脏移植手术1-2。由于供体数量有限，美国每年仅能实施约2400例心脏移植手术2。显然，必须解决器官短缺问题，因此需要开发其他策略以获得更多可用于移植的器官，理想情况下这些器官应为自体来源，以避免排斥反应及终身免疫抑制所带来的并发症。

哺乳动物成体心肌细胞在损伤后表现出有限的再生能力，但最近的研究表明，哺乳动物新生心脏在损伤后仍具有显著的再生能力5-8。具体而言，在出生至出生后第7天之间存在一个再生时间窗口，该窗口可通过部分外科切除术诱导发现。这一再生阶段的特征包括无纤维化瘢痕形成、新生血管生成、心外膜释放促血管生成因子以及心肌细胞增殖5-8,11。这一短暂的再生时间窗口为利用新生心脏作为构建生物人工心脏的新型材料来源提供了潜在可能。

已知细胞外基质可提供重要的信号，以促进心肌细胞的增殖与生长。已有研究探讨了新生期和成年期基质中分子可及性的显著差异及其促进再生的能力12，并进行了探索13。脱细胞化的成年基质已在多项研究中被用作细胞重植和构建生物人工心脏的细胞外基质支架。尽管这些研究以及干细胞技术的新发现正在快速推进，但仍存在若干尚未克服的障碍。例如，在基质天然结构的保存、细胞向基质壁的整合能力，以及支持细胞增殖和生长的能力等方面均存在局限，限制了该方法的成功。尽管新生心脏被认为具有更优越的再生特性，但使用此类组织的实际操作困难限制了对其的深入探索。

基于新生心脏已证实的再生能力，我们通过建立一种针对出生后第3天（P3）小鼠心脏的脱细胞技术，开发出了新型基质。选择P3阶段的心脏进行本研究，是因为该时期处于心脏再生的时间窗口内（此前已确定6），同时心脏体积足够大，便于获取、脱细胞处理及再细胞化。本研究的目标是验证从新生小鼠心脏构建基质的可行性。我们的研究结果证明，尽管新生心脏体积微小，仍可成功实现脱细胞，并在过程中维持细胞外基质（ECM）的结构完整性和蛋白质成分的完整性。我们还展示了将表达mCherry的心肌细胞再接种至该心脏ECM中的能力，并在再细胞化后检测了这些心肌细胞对多种心脏标志物的表达情况。该技术将有助于评估新生心脏基质在构建生物人工心脏方面的优越性。

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方案

所有小鼠实验均依照美国动物福利法进行，并经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 小鼠心脏分离方法

  1. 使用一次性刀片通过断头法处死新生小鼠。
  2. 用70%乙醇擦拭胸部。
  3. 用标准剪刀剪开胸壁皮肤，并用#5镊子向侧方牵拉皮肤，将其从胸壁分离。
  4. 用剪刀在胸骨下方穿刺腹壁，进入腹腔。用#5镊子夹住剑突，向上前方牵拉胸骨，同时用剪刀剪断胸廓两侧的肋骨。用镊子将肋骨向上翻折，暴露心脏。
  5. 用#5镊子向侧方钝性分离胸腺的两个主要叶，暴露主动脉弓以及上下腔静脉和肺静脉。
  6. 用10 cm弹簧剪剪断主动脉弓发出的主要动脉及主动脉本身，保留心脏基底部至无名动脉之间的主动脉段。用#5镊子夹住被切断血管的断端，向前翻折心脏，使其与气管和食管分离。
  7. 用10 cm弹簧剪在心脏两侧肺与心脏之间剪断肺血管系统及其他主要静脉，保持静脉开放以利于引流。
  8. 用#5镊子夹住主要血管的断端，将心脏从纵隔中取出，放入含有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的60 mm培养皿中，用于后续插管操作。

2. 通过兰格多夫灌注进行脱细胞的方法

  1. 预先准备好导管组件。将一段 4 cm 的 PE 50 管在小型酒精火焰中拉制，以制成更小、更细的导管。用刀片修剪两端，使其达到所示尺寸（外径约 300 µm，末端带扩口，外径约 500 µm），如图 1所示。每次拉制可从两侧得到两个对称的导管。
  2. 将管子的切端短暂指向火焰，使细端开口处熔化形成一个扩口。
  3. 用 PBS 填充 12 ml 注射器，并通过在注射器上安装三通阀来组装导管。将一根 22 G × 1 针头连接至三通阀，并将其穿刺通过隔膜。将拉制好的 PE 管导管套入针头（图 1）。
  4. 用 PBS 冲洗组装好的各部件，确保所有气泡均已排出。
  5. 将按上述步骤准备好的导管插入离体心脏的主动脉中，注意不要超过主动脉瓣，并用一根 7-0 缝线结扎固定。使导管的扩口端紧靠结扎线近端，形成严密密封，防止心脏从导管上脱落。
  6. 在显微放大下观察插管过程，同时使用装有 PBS 的注射器轻柔灌注心脏。确保系统无泄漏，且随着隐性血液被清除，组织均匀变白。
  7. 将隔膜放入进样适配器的颈部，并通过将边缘折叠覆盖在玻璃上进行密封。
  8. 通过足够长度的管路将装有 60 ml 1% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶于重蒸水（dH2O）的储液瓶连接至系统，使液柱高度产生 20 mm Hg 的压力，如图 1所示。根据 1 mm Hg 相当于 1.3595 cm H2O 的换算关系，计算液柱高度对应的压力。
    注意：SDS 是一种强絮凝性粉末，具有刺激性，应避免接触。操作粉末时应穿戴适当的防护服。
  9. 用 1% SDS 对心脏灌注 14 小时。处理后的心脏将呈透明状，无可见残留组织。
  10. 冲洗系统至三通阀处，去除残留的 SDS 溶液，并替换为 10 ml dH2O。随后依次用 10 ml 1% Triton X-100（溶于重蒸水中）、10 ml dH2O 和 60 ml 含 1× 青霉素-链霉素（Pen-Strep）的 PBS 对心脏进行灌注。
  11. 将心脏保存在含 1× Pen-Strep 的 PBS 中，置于 4 °C 环境下。若去细胞化后的应用需要继续灌注，则应保留主动脉内的导管；否则剪断缝线并移除导管。

3. DNA 测定

  1. 使用含有 200 μg/ml 蛋白酶 K、50 mM KCl、2.5 mM MgCl2 和 0.45% Tween 20 的 10 mM Tris 缓冲液（pH 8.3）对脱细胞 ECM 或对照心脏组织进行消化处理。
  2. 将组织在 55 °C 条件下振荡孵育，直至组织完全溶解，通常需要 4–5 小时。
  3. 采用 DNA 结合检测法对匀浆液中的 DNA 含量进行定量分析4,11。

4. 组织的固定与切片

  1. 在室温下，用含4%多聚甲醛的PBS固定脱细胞、再细胞化或对照P3心脏30分钟。
  2. 用PBS洗涤组织3次。
  3. 将组织置于含7.5%蔗糖的0.1 M磷酸缓冲液中，4 °C孵育至组织沉底。
  4. 更换为含15%蔗糖的0.1 M磷酸缓冲液，同样在4 °C孵育至组织沉底。
  5. 将组织升温至37 °C，替换一半体积为含15%蔗糖和0.1 M磷酸缓冲液的明胶溶液，并过夜平衡。明胶浓度逐步增加，依次为1%、2.5%、5%，最后两次使用7.5%。
  6. 将样品置于包埋盒中，使用新鲜的7.5%明胶包埋。为恢复脱细胞样品的形态，可在包埋过程中将液态明胶灌注至心腔内。将包埋盒漂浮于液氮上进行速冻，随后在-80 °C保存。
  7. 使用冷冻切片机切取厚度为10 µm的切片。将载玻片靠近切片表面，观察切片因静电处理载玻片所带电荷而从刀面转移至载玻片表面。切片在室温下干燥过夜，并于-80 °C保存以备后续分析。
  8. 从冰箱中取出载玻片，恢复至室温，然后放入盛有PBS的考普林瓶中，在37 °C孵育20分钟以溶解明胶。
  9. 对第4.7步获得的切片进行苏木精-伊红（H&E）染色。将载玻片放入考普林瓶中，经第4.8步水化后的切片依次浸入苏木精45秒、自来水1.5分钟、缓冲液3分钟、自来水1分钟、蓝化剂1.5分钟、80%乙醇1分钟、醇溶性伊红Y 8秒、80%乙醇1分钟、100%乙醇1分钟（两次）、透明剂（二甲苯替代物）1分钟（三次），最后用树脂封片剂封片。在显微镜下观察切片。
  10. 为验证心脏ECM中细胞外基质蛋白反应性的保留情况，可对ECM结构蛋白（如IV型胶原）进行染色：将水化后的载玻片置于湿盒中，加入含0.1% Triton-X100的磷酸盐缓冲液（PBST）配制的10%正常驴血清（NDS），室温孵育1小时。使用足量液体覆盖组织切片。
  11. 吸除溶液，加入以5% NDS/PBST稀释至经验优化浓度的一抗。例如，IV型胶原抗体按1:150稀释。4 °C孵育过夜。
  12. 用PBST洗涤载玻片3次，加入与荧光染料偶联的二抗，按经验确定的稀释比例进行稀释。室温孵育1小时，再用PBS洗涤3次。
  13. 使用含DAPI的封片剂封片，通过DAPI染色观察细胞核是否缺失，以确认无细胞残留。
  14. 使用荧光显微镜在50至400倍放大下观察切片。

5. 用于再细胞化的 P1 新生小鼠心室心肌细胞

  1. 用70%乙醇喷洒每只幼鼠，并使用一次性刀片进行断头处理。
  2. 用拇指和食指固定每只幼鼠，用小型无菌剪刀沿胸骨中线剪开胸腔以暴露胸腔。施加适当压力使心脏自由突出，同时剪断大血管和心房，仅保留心室组织。
  3. 将每颗心脏直接放入含有20 ml冰冻无钙、无碳酸氢盐的Hank's平衡盐溶液（含20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，CBFHH）的50 ml离心管中，直至收集完所有心脏。
  4. 吸除CBFHH溶液，向管中加入10–15 ml新鲜的冰冻CBFHH溶液。通过轻轻旋转离心管数次清洗组织。
  5. 将含有心脏的溶液倾倒入60 mm塑料培养皿中。
  6. 在冰上借助放大设备，用弹簧剪刀去除心脏上残留的心房组织，并将心室组织剪切成大小均一的小块。使用#5镊子移除培养皿中分离出的非心室组织。
  7. 用移液器吸取适量CBFHH溶液，将组织碎片转移至含有无菌微型搅拌子的小型无菌小瓶中。
  8. 让组织自然沉降至小瓶底部，随后吸除CBFHH溶液。
  9. 配制50 ml酶解液：含1.75 mg/ml胰蛋白酶和20 µg/ml DNase II的CBFHH溶液。移取5 ml该酶解液加入含有剪碎心室组织的离心管中，并置于磁力搅拌器上。在室温下以恒定速度（340 rpm）搅拌8分钟。
    注意：搅拌动作应轻柔，同时确保悬液保持悬浮状态。
  10. 将小瓶从搅拌器上取下，静置3分钟使组织沉淀。用移液器吸除初次消化的上清液，因其主要含有血细胞和组织碎片。
  11. 再次移取5 ml酶解液加入正在消化的心室组织中，继续搅拌8分钟，随后静置沉淀3分钟。在开始消化前，准备两个50 ml离心管（标记为1和2），每管加入12 ml冰冻胎牛血清（FBS），并在每管上方放置一个40 µm细胞滤筛。将此次上清液通过滤筛加入1号管中。
  12. 重复上述消化过程共8次，交替将消化后的上清液收集至两个含FBS的离心管中。最后一次上清液等量分装至1号和2号管，以确保每管总体积相等。
    注意：此时每个收集管中细胞悬液总体积为32.5 ml。
  13. 将含有上清液的离心管在4 °C条件下以150 × g离心6分钟。
  14. 在收集消化液的过程中，准备五个100 mm组织培养皿，每皿加入6 ml培养基（含10% FBS、1×青霉素-链霉素、1×L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基，DMEM）。将这些培养皿置于37 °C、5% CO2环境中孵育30分钟，以平衡培养基。
  15. 吸除CBFHH酶混合液，将细胞重悬于上述制备的30 ml培养基中，并合并两个收集管中的细胞。
  16. 将6 ml细胞悬液分别回加至每个100 mm培养皿中，在37 °C下孵育45分钟。
  17. 孵育结束后，将未贴壁细胞转移至5个新培养皿中，再次孵育45分钟（成纤维细胞组分将开始贴壁，可根据需要单独培养）。
  18. 第二轮预贴壁结束后，收集各培养皿中的培养基及未贴壁细胞，于150 × g离心6分钟。
  19. 吸除多余培养基，调整细胞至所需浓度（每100 µl灌注液中约含4.0 × 105个细胞）。取部分细胞悬液用于计数或活力检测14。

6. P3 心脏基质的生物反应器再细胞化

  1. 在添加细胞前，用培养基（参见步骤5.15）对分离的心脏基质进行过夜预处理。
  2. 按照图2所示组装Langendorff系统的各个部件。将玻璃部件进行高压灭菌，塑料部件采用环氧乙烷灭菌，以确保无菌。系统各子单元可在超净台内完成组装，再安装至支撑架上。为清晰起见，图中省略了循环水浴及加热水流路径。
  3. 向组装好的系统中加入120 ml组织培养基（参见步骤5.15）。
  4. 将步骤2.14中已插管的心脏基质置于60 mm培养皿中，在显微放大条件下，将装有步骤5.20所得细胞悬液的1 ml注射器（配22 G × 1针头）连接至导管。确保该装置中无气泡，以避免造成心脏栓塞。
  5. 通过冠状动脉将100 µl细胞悬液缓慢灌注至心脏基质中。灌注完成后，取下注射器与针头组合。
    注意：需以约每分钟20 µl的缓慢速度进行灌注，以防止细胞随静脉血流流出心脏。
  6. 将固定在生物反应器心脏罐盖底部Luer接头上的22G钝头插杆插入导管中，推动导管套牢于插杆上。
  7. 启动蠕动泵，观察灌注流路是否如图2所示。液体从储液罐经泵驱动，通过气泡捕获器，流向步骤2.5中置于主动脉内的导管（图2中的红色路径）。观察心脏循环液从静脉流出，并从心尖滴落，回流至培养基储液罐。
    注意：灌注流速取决于个体因素，如构建物的血管阻力和心脏大小，但50至100 µl/min是一个合适的起始范围。在中间时间点可进行功能评估。由于新生大鼠再细胞化心脏的尺寸较小，限制了可执行的评估手段，但我们已确定基于光学的系统可用于量化搏动行为，正如其在成年大鼠心脏中的应用一样。4 该构建物可进行长时间灌注（最长可达23小时）。

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结果

脱细胞化
根据该方案，以出生后第3天（P3）新生小鼠心脏为例，平均心脏重量为23 mg时，完成脱细胞化过程平均约需14小时。

无细胞性
图3a展示了一个完全完整的小鼠出生后第3天（P3）新生心脏（整体封片）。图3b显示同一心脏经去细胞化处理后的结果。图4a和图4b分别为完整心脏和去细胞化心脏的苏木精-伊红染色结果。注意去细胞化心脏中苏木精阳性的细胞核消失，嗜伊红结构明显减少。此外，去细胞化心脏的DNA含量从完整心脏的68.08 ± 2.25 µg（n=6）显著降低至4.73 ± 2.27 µg（n=5）。

胶原蛋白免疫反应性
在脱细胞后维持细...

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讨论

该技术依赖于对心脏的反复灌注，因此避免栓塞是获得成功结果的关键环节。从步骤2.2-2.6中心脏的初始插管，到步骤2.8-2.14之间溶液的更换，每一个操作步骤均可能引入气泡，从而影响灌注液向心肌组织的正常流动。由于新生心脏体积微小，即使血管系统中存在极微小的气泡，也可能导致技术性梗死，从而使脱细胞过程不完全。此外，在后续的洗涤步骤中，灌注不充分可能导致去垢剂残留，进而对生物相容性产生负面影响。而且，温度的快速变化（例如按照步骤2.14建议将基质从4 °C储存环境中取出时）也需谨慎处理，因为温度改变可使溶解的气体析出形成气泡。在进行再细胞化操作时，配制细胞悬液的注射器应特别注意确保灌注过程中无气泡（步骤6.4）。

可能需要调整本方案的具体参数以适应其他类型的组织。已有多种脱细胞化方案被报道4,9,11，可提供参考。任何脱细胞化方案的最终目标都应包括维持细胞外基质（ECM）蛋白结构及相关生化特性，并充分去除天然细胞成分，后者可通过残留DNA的含量来评估。在此背景下，过高的灌注压力会导致ECM超微结构的破坏，这一现象可通过组织学方法观察到。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者们衷心感谢辛西娅·德凯女士在图表绘制方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1. 小鼠心脏分离所需材料
P1 小鼠幼崽（如图所示；B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J）Jackson Laboratories21577或同等产品
60 mm 培养皿BD Falcon353004或同等产品
磷酸盐缓冲液 pH 7.4（无菌）HycloneSH30256.01或同等产品
一次性刀片Stanley28-510或同等产品
标准剪刀Moria Bonn（Fine Science Tools）14381-43或同等产品
弹簧剪刀 10 cmFine Science Tools15024-10或同等产品
Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口Fine Science Tools15000-00或同等产品
#5 镊子Dumnot（Fine Science Tools）11295-00或同等产品
2. 脱细胞化所需材料
进样接头ChemglassCG-1013可高压灭菌
隔垫ChemglassCG-3022-99可高压灭菌
内径 1/8 英寸 × 外径 3/8 英寸 C-Flex 管Cole-ParmerEW-06422-10可高压灭菌
公鲁尔接头转 1/8" 软管接头McMaster-Carr51525K33可高压灭菌
母鲁尔接头转 1/8" 软管接头McMaster-Carr51525K26可高压灭菌
Prolene 7-0 外科缝合线 Ethicon8648G或同等产品
铁架台Fisher ScientificS47807或同等产品
夹子Fisher Scientific05-769-6Q或同等产品
夹子常规支架Fisher Scientific05-754Q或同等产品
60 cc 注射器筒体 Coviden1186000777T或同等产品
烧杯Kimble14000250或同等产品
22 G × 1 注射器针头BD305155或同等产品
12 cc 注射器Coviden8881512878或同等产品
三通旋塞阀Smith MedicalMX5311L或同等产品
PE50 管BD Clay Adams Intramedic427411必须可通过加热塑形。推荐使用聚乙烯材质。
1% SDSInvitrogen15525-017推荐使用超纯级。使用前新鲜配制并过滤除菌。
1% Triton X-100 Sigma-AldrichT8787使用 10% 储存液新鲜配制，并在使用前过滤除菌。 
无菌 dH2OHycloneSH30538.02或 MilliQ 系统纯化水。
1× 青霉素/链霉素Corning CellGro30-001-Cl或同等产品
 
3. DNA 定量所需材料
蛋白酶 KFisherBP1700>30 U/mg 活性
KClSigma-AldrichP9333或同等产品
MgCl2·6H2OMallinckrodt5958-04或同等产品
Tween 20 Sigma-AldrichP1379或同等产品
Tris 碱/盐酸盐Sigma-AldrichT1503/T5941或同等产品
Pico-Green dsDNA 检测试剂盒Life Technologies P7589需使用荧光计读数
4. 组织固定与切片方法
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148或同等产品
猪皮来源 A 型明胶Sigma-AldrichG2500必须为 300 bloom 或更高
5. 组织学方法
冷冻模具 10 × 10 × 5 mmTissue-Tek4565或同等产品
冷冻切片机Hacker/BrightModel OTF或同等产品
显微镜载玻片  25 × 75 × 1 mmFisher Scientific12-550-19或同等产品
苏木精 560 Surgipath/Leica Selectech 3801570或同等产品
乙醇Decon Laboratories2701或同等产品
DefineSurgipath/Leica Selectech 3803590或同等产品
蓝色缓冲液 Surgipath/Leica Selectech 3802915或同等产品
醇溶性伊红 Y 515 Surgipath/Leica Selectech 3801615或同等产品
Formula 83 二甲苯替代品 CBG Biotech CH0104B或同等产品
Permount 封片介质 Fisher Chemical SP15-500或同等产品
IV 型胶原抗体Rockland600-401-106.1或同等产品
α-肌动蛋白抗体AbcamAB9465或同等产品
mCherry 抗体AbcamAB205402或同等产品
NKX2.5 抗体Santa Cruz BiotechnologySC-8697或同等产品
驴抗小鼠 AF488 抗体Life TechnologyA21202或同等产品
驴抗鸡 AF594 抗体Jackson Immunoresearch703-585-155 或同等产品
驴抗山羊 CY5 抗体Jackson Immunoresearch 705-175-147或同等产品
Fab 片段山羊抗兔 IgG（H+L）AF594Jackson Immunoresearch111-587-003或同等产品
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂ThermoFisherP36930或同等产品
6. 使用预铺板法分离新生大鼠心室心肌细胞
HBSS（无钙、无镁）HycloneSH30031.02或同等产品
HEPES（1 M）Corning CellGro25-060-Cl或同等产品
细胞筛BD Falcon352340或同等产品
50 ml 离心管BD Falcon352070或同等产品
Primeria 100 mm 培养板Corning353803Primeria 表面可增强成纤维细胞贴附，从而提高心肌细胞纯度
胰蛋白酶Difco215240或同等产品
DNase IISigma-AldrichD8764或同等产品
DMEM（Dulbecco 改良最低必需培养基）HycloneSH30022.01或同等产品
维生素 B12 Sigma-AldrichV6629或同等产品
纤维连接蛋白包被培养板 BD Bioscience354501或同等产品
胎牛血清 HycloneSH30910.03或同等产品
心脏生物反应器玻璃器皿Radnoti Glass Technology120101BEZ必须可通过高压灭菌或气体灭菌。

参考文献

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