利用数字全息显微术的多模态定量相位成像可准确评估肠道炎症与上皮伤口愈合

摘要

准确评估抗炎效果对于评价治疗炎症性肠病潜在新药至关重要。数字全息显微技术可对小鼠和人类结肠组织样本中的炎症进行评估，并实现上皮伤口愈合的自动化多模态分析 体外.

摘要

炎症性肠病的发病率， 即， 在过去十年中，克罗恩病和溃疡性结肠炎的发病率显著上升。炎症性肠病（IBD）的病因至今尚不明确，现有的治疗策略主要基于对免疫系统的非特异性抑制。开发能够特异性靶向肠道炎症和上皮伤口愈合的治疗方法，有望显著改善IBD的管理，但这需要对炎症变化进行准确检测。目前，潜在的药物候选物通常通过动物模型进行评估。 体内 或基于细胞培养的技术 体外组织学检查通常需要对目标细胞或组织进行染色，这可能会改变样本的特性，且研究结果的解读还可能因研究者经验不同而存在差异。数字全息显微术（DHM）基于光学路径长度延迟的检测，可实现无需染色的定量相位对比成像，从而使实验结果能够直接关联于绝对的生物物理参数。我们展示了如何利用DHM通过折射率测量来检测组织密度的变化，从而在无需染色的情况下定量评估患有结肠炎的小鼠和人类结肠组织样本中不同层次的炎症改变。此外，我们还展示了上皮伤口愈合过程的连续多模态无标记监测 体外，可通过数字全息显微技术（DHM）对损伤区域进行简单自动测定，同时测定迁移细胞的干质量、层厚度等形态学参数。综上所述，DHM 是一种有价值的、新颖且可定量的工具，可用于评估肠道炎症，并可获得参数的绝对值，简化上皮伤口愈合的定量分析 体外 因此在转化诊断应用方面具有很高的潜力。

引言

炎症性肠病（IBD）， 即， 溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）和克罗恩病（Crohn's disease, CD）是胃肠道的病因不明的炎症性疾病¹炎症性肠病（IBD）潜在病理生理机制的研究，以及对潜在新药或新型诊断方法的评估尤为重要。在基础研究和IBD患者的临床管理中，肠道黏膜已成为关注的重点。^2,3黏膜是一道解剖学边界，在此共生细菌、上皮细胞与肠道免疫系统的多种细胞组分相互作用，共同协调肠道稳态。^4,5然而，在炎症性肠病患者中，失控且持续的肠道炎症会导致黏膜损伤，表现为溃疡或狭窄，最终可能导致上皮屏障功能的破坏，而屏障功能的破坏本身又会加剧局部炎症。⁶.

因此，上皮伤口愈合对于炎症后上皮再生至关重要，同时也是胃肠道溃疡愈合或胃肠道手术后吻合口漏修复的基本要求⁷上皮伤口愈合可在体外模拟 体外 伤口愈合实验及小鼠肠道炎症模型^8,9. 两者 体外 和 体内 这些方法存在缺陷，限制了实验评估的准确性。 体外 检测方法，如经典的划痕实验，需要耗时的染色步骤或转染荧光发色团。这些方法通常受限于对细胞增殖和迁移的间断性监测，且难以实现自动化。¹⁰. 体内 模型，如葡聚糖硫酸钠（DSS）....

方案

所有动物实验均根据德国动物保护法，经地区伦理委员会（德国北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局，LANUV）批准。明斯特大学本地伦理委员会批准了将人体组织用于组织学和显微镜分析。

1. 动物与材料

1. 使用体重为20至25克的所需DSS敏感品系的雌性或雄性小鼠，并根据当地动物护理法规进行饲养。提供啮齿类动物专用饲料和经高压灭菌的饮用水 随意摄取.
2. 诱导 急性 通过在高压灭菌的自来水中添加3%（w/v）葡聚糖硫酸钠（DSS，分子量：36,000-50,000 Da）连续饮用5天，建立DSS结肠炎模型。
   注意： DSS 的效价因生产商和批次的不同而存在显著差异。在使用供应商提供的 DSS 诱导疾病活性前，应先行测试其效果，每日体重变化可作为可靠且客观的指标。
3. 为进行结肠组织样本的组织学评估，通过 CO₂ 处死小鼠₂ 实验结束时进行吹入（或根据国家和机构指南规定进行）。

2. DSS结肠炎的实验设置及 体外 伤口愈合实验

1. 细胞培养与伤口愈合实验的建立
   1. 在95%湿度和5% CO₂条件下培养Caco-2细胞₂ 37 °C 环境下培养。使用含 10% 胎牛血清（FBS....

结果

数字全息显微镜（DHM）成像的典型设置

为了进行明场成像和定量数字全息显微（DHM）相位对比成像，我们采用了如图1B所示的倒置显微镜。该系统通过连接一个DHM模块进行了改造，具体方法如前所述²⁵。在马赫-曾德尔光路配置下，使用倍频Nd:YAG激光器（λ = 532 nm）照射样品，生成数字全息图（图1A）。分离的组织样本被置于玻璃载片上进行离体（ex vivo）分析。活细胞培养物则在特制的培养皿中观察，用于检测伤口愈合过程，如图1C所示。样品通过透射照明方式，利用10倍物镜（NA = 0.3）和管镜成像。采用电荷耦合器件（CCD）相机记录由样品图像（物波）与轻微倾斜的参考波叠加所产生的干涉图样（数字离轴全息图）。所采集的数字全息图通过空间相移重建方法，并结合可选的全息自动聚焦技术.......

讨论

我们证明了数字全息显微技术（DHM）能够对小鼠结肠炎模型及人结肠组织样本进行准确的组织学损伤评估（ex vivo）。此外，我们还表明，DHM 可在连续监测上皮伤口愈合过程的同时，提供有关细胞变化的多模态信息。在 DHM 中，数字采集的全息图通过数值方法进行重建³²。因此，与明场显微镜、泽尼克相衬显微镜和微分干涉差显微镜相比，DHM 能够提供定量的相位对比图像，并可选择性地进行后续数值聚焦校正（多焦点成像）²⁷。定量相位成像基于光学路径长度变化的测定，因而对所使用的测量设备具有高度独立性。这简化了使用不同仪器获取的测量数据之间的比较。此外，DHM 仅需较低的光照强度即可实现样本照明。这使得对未染色离体组织的分析具有最小侵入性，并在活细胞的长期延时观察过程中显著减少了对样本的干扰。

过去二十年中，炎症性肠病（IBD）的治疗手段显著扩展。除了引入在溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）中均有效且安全性可接受的抗TNF-α疗法外，近年来靶向整合素的新型特异性抗体也已进入临床应用^34-37目前，还有多种其他有.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
偶氮甲烷（AOM）	Sigma - Aldrich，德国德意志豪芬	A5486
细胞培养瓶	Greiner Bio-One，德国弗里克豪森	658170
Costar Stripette	康宁公司，美国纽约	4488
葡聚糖硫酸钠（DSS）	TdB 顾问公司，乌普萨拉，瑞典	DB001
DMEM/Ham's F12	PAA实验室 - 帕兴 - 奥地利	E15-813
EGF	Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬	SPR3196
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma - Aldrich，德国德意志豪芬	E 9884
Falcon 50 ml 离心管	BD 生物科学公司，比利时埃伦博德海姆	352070
异戊烷（2-甲基丁烷）	Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬	M32631-1L
亚甲蓝	默克公司，达姆施塔特，德国	1159430025
丝裂霉素C	Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬	M4287
显微镜载玻片	G. Menzel，德国布伦瑞克	J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek 包埋剂	Sakura，Zoeterwonde，荷兰	4583
青霉素/链霉素/两性霉素B	Lonza，比利时韦尔维耶	1558
磷酸盐缓冲液，PBS	Lonza，比利时韦尔维耶	4629
RPMI 1640	Lonza，比利时韦尔维耶	3626
0.9% 氯化钠	德国美尔松根，勃朗公司	5/12211095/0411
标准饮食	Altromin，Lage，德国	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura，荷兰莱顿	4566
胰蛋白酶EDTA	Lonza，比利时韦尔维耶	7815
体外 – 云	R. Langenbrinck，德国滕宁根	04-0002
µ- 带高型细胞培养插件的35 mm培养皿	ibidi GmbH，德国慕尼黑	81176
DIC盖板 µ- 培养皿，带玻璃插片	ibidi GmbH，德国慕尼黑	80050
<强>仪器设备
MICROM HM550	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	46320
<强>数字全息显微镜
<强>组分	<强>模型	<强>公司
倒置显微镜	iMIC	Till Photonics，Graefelfing，德国
激光	Compass 315M	Coherent GmbH，德国吕贝克
显微镜物镜	蔡司 EC Plan Neofluar 10x/0.3	蔡司，德国哥廷根
CCD相机	DMK 41BF02	The Imaging Source，德国不来梅