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方法文章

通过RaPID方法分离新型RNA结合蛋白

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DOI：

10.3791/54467

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2016年9月30日

 , 
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology, 2Department of Biomolecular Sciences, Weizmann Institute of Science

本文内容

摘要

RNA-蛋白质相互作用是许多细胞过程的核心。本文介绍一种在活体（in vivo）条件下分离特定RNA并鉴定与其结合的新蛋白质的方法。该方法有助于揭示RNA在细胞内的调控机制。

摘要

RNA结合蛋白（RBPs）在RNA代谢和调控的各个方面发挥着重要作用。其鉴定是现代生物学中的一个重大挑战。目前仅有少数 体外 和 体内 方法能够鉴定与特定靶标mRNA相关的RNA结合蛋白（RBPs）。然而，其主要局限性在于鉴定过程发生在非细胞环境中（体外）或目标RNA分离效率低下（体内). 一种RNA结合蛋白纯化与鉴定（RaPID）方法被设计用于克服酵母系统中的这些局限性，并实现与目标RNA高效结合的蛋白质的有效分离 在体内 为实现这一目标，将目标RNA标记上MS2发卡结构，并与一种融合蛋白共表达，该融合蛋白由MS2结合蛋白和链霉亲和素结合蛋白（SBP）组成。随后对细胞进行交联并裂解，通过链霉亲和素磁珠分离复合物。与标记RNA共纯化的蛋白质可通过质谱分析进行鉴定。我们近期应用该方案鉴定了与内质网相关 PMP1 mRNA。本文提供了RaPID的详细实验方案，并讨论了其部分局限性与优势。

引言

RNA结合蛋白（RBPs）约占S. cerevisiae蛋白质的10%1,2，以及约15%的哺乳动物蛋白质3-5。它们参与多种细胞过程，如mRNA转录后加工与调控、翻译、核糖体生物合成、tRNA氨酰化与修饰、染色质重塑等。RBPs中一个重要亚群是mRNA结合蛋白（mRNPs）6,7。在mRNA成熟过程中，不同的RBPs会结合到转录本上，介导其在细胞核内的加工、出核转运、细胞内定位、翻译及降解过程6-8。因此，在任意时间点结合于特定转录本上的一组独特RBPs决定了该转录本的加工方式及其最终命运。

鉴定与特定mRNA结合的RNA结合蛋白（RBPs）可能显著增进我们对mRNA转录后调控机制的理解。已有多种遗传学、显微镜学、生物化学及生物信息学方法被用于鉴定参与mRNA调控的蛋白质（详见文献9-11）。然而，其中仅有少数方法能够实现对特定靶标mRNA所结合蛋白的鉴定。值得注意的是酵母三杂交系统（Y3H），该方法利用目标mRNA作为诱饵，在酵母细胞中筛选表达文库。阳性克隆通常通过生长选择或报告基因表达来识别12-14。该方法的主要优势在于可在细胞环境中扫描大量蛋白质，并能够评估RNA-蛋白质相互作用的强度。其局限性包括由于非特异性结合导致的假阳性结果较多，以及由于融合蛋白猎物或诱饵RNA可能发生错误折叠，从而导致较高的假阴性结果风险。

与基因学方法相对的另一种策略是通过亲和纯化分离与RNA结合的蛋白质。含有poly A尾的mRNA可通过寡核苷酸dT柱进行分离，并利用质谱技术检测其结合的蛋白质。通过交联技术可在细胞原位保留RNA-蛋白质相互作用，交联可形成短距离的共价键。使用寡核苷酸dT柱能够获得与所有含poly A尾mRNA相关的整个蛋白质组的全局视图3,5,15。然而，该方法无法提供与特定mRNA结合的蛋白质列表。目前可用于实现此类鉴定的方法极为有限。PAIR方法涉及转染一段与目标mRNA互补的核酸序列16,17，该核酸还连接有一个肽段，可在相互作用位点附近与RNA结合蛋白（RBP）发生交联。交联后，可分离RBP-肽段-核酸复合物并进行蛋白质组学分析。最近，一种基于适配体（aptamer）的方法已成功应用于哺乳动物细胞系提取物18。研究人员开发出一种对链霉亲和素具有更高亲和力的RNA适配体，并将其与目标序列（本例中为富含AU元件（ARE））融合。将适配体-ARE RNA连接至链霉亲和素包被的磁珠，再与细胞裂解液混合。与ARE序列结合的蛋白质被纯化后通过质谱（MS）进行鉴定。尽管该方法检测到的相互作用发生在细胞外环境（即，体外），但未来有望对其进行改进，将适配体整合入基因组中，从而实现在细胞内环境（即，体内）中分离与mRNA结合的蛋白质。在遗传操作技术成熟的酵母中，RaPID方法（由Jeff Gerst教授实验室开发）可揭示体内的RNA-蛋白质相互作用情况19。RaPID方法结合了MS2衣壳蛋白（MS2-CP）对MS2 RNA序列的高度特异性结合能力，以及链霉亲和素结合结构域（SBP）对链霉亲和素偶联磁珠的结合能力，从而可通过链霉亲和素磁珠高效纯化带有MS2标签的mRNA。此外，表达12个MS2发夹结构可允许多达6个MS2-CP同时结合于同一RNA分子，显著提高其纯化效率。因此，该方案被提出用于在洗脱样品经质谱进行蛋白质组学分析后，鉴定新的mRNA相关蛋白。

我们最近利用RaPID技术鉴定了与酵母PMP1 mRNA相关的新蛋白质20。PMP1 mRNA此前已被证明与内质网（ER）膜相关联，其3'非翻译区（UTR）被发现是介导这种关联的主要决定因素21。因此，结合PMP1 3' UTR的RNA结合蛋白（RBP）可能在其定位过程中发挥重要作用。通过RaPID结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，成功鉴定出多种与PMP1相互作用的新蛋白质20。本文中，我们提供了RaPID方法的详细实验方案、必需的关键对照实验，以及可提高产量和特异性的技术要点。

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方案

注意：将包含12个MS2结合位点（MS2结合环；MS2L）的序列插入目标基因组位点，通常位于开放阅读框（ORF）与3'非翻译区（3' UTR）之间。该整合的详细实验方案已在其他文献中提供22。通过PCR、Northern杂交分析或RT-PCR验证插入的正确性及表达情况20,23。重要的是需确认该整合未干扰3'UTR的合成。此外，应将一个表达MS2-CP与SBP融合蛋白的质粒导入细胞，该质粒由可诱导启动子（甲硫氨酸缺失）驱动表达24。应使用一个相同的菌株作为对照，但不含插入的MS12环序列，以检测非特异性信号。

1. RaPID 纯化

  1. 培养表达MS2标记mRNA的酵母细胞500 ml（根据目的基因的表达水平，可使用250–1,000 ml酵母细胞）20 MS2-CP-GFP-SBP 融合蛋白24 至 OD600 0.8 - 1.0（30时） o在适当生长培养基中例如合成葡萄糖（SD）选择性培养基
  2. 在室温下以 3,000 x g 离心 4 分钟 弃去上清液。
  3. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，按之前步骤离心（步骤1.2），在不含甲硫氨酸的SD培养基中重悬，体积与之前相同（步骤1.1），于30 °C孵育45–60分钟 oC以诱导MS2-CP-GFP-SBP融合蛋白的表达。
    注意：较长的诱导时间可能导致GFP聚集。
  4. 留出 10 ml 细胞，使用简易方法从该样品中提取 RNA "热酚" 方法25注意：苯酚具有高毒性，应根据其安全说明书进行操作。
    注意：该 RNA 可作为评估所分离 RNA 质量的良好参照图1A).
  5. 对于500 ml细胞，加入1.35 ml 37%甲醛，使终浓度为0.1%，以交联RNA-蛋白质复合物。继续在30℃下孵育 oC 反应 10 分钟。注意：甲醛具有高毒性，应根据其安全操作说明进行处理。
  6. 加入26.5 ml的2.5 M甘氨酸，使终浓度为0.125 M，孵育3分钟以终止交联反应。从这一步开始，将所有样品置于冰上，以尽量减少RNA降解。
  7. 在 4 ℃ 条件下以 3,000 × g 离心 4 分钟oC，用45 ml冷的1×PBS洗涤。
  8. 每 100 ml 初始细胞培养物中加入 1 ml RaPID 裂解缓冲液重悬细胞。
  9. 分装至带螺口盖的微量离心管中，每管500 µl，并向每管加入约400 mg预冷的玻璃珠（约为一满0.2 ml PCR管的量）。
  10. 在珠磨机中裂解细胞 3 分钟。立即将裂解液置于冰上。
    注意：细胞裂解会释放细胞内的RNase，这是导致RNA降解的主要原因。RaPID裂解缓冲液含有高浓度的RNase抑制剂，例如非特异性RNase抑制剂肝素以及特异性抑制剂。建议操作过程迅速，并始终保持低温环境。
  11. 将裂解液转移至新管中。用加热的针头（0.8 mm × 40 mm）在每个微量离心管底部刺一个小孔，将微量离心管置于15 ml离心管上方。使用5 ml注射器的头部作为微量离心管与15 ml离心管之间的适配器。将整套装置在4 ℃下以3,000 × g离心1分钟 oC.
  12. 将15 ml离心管中的流穿液转移至新的1.5 ml离心管中，在4℃下以10,000 × g离心10分钟 oC以清除细胞碎片。
  13. 将所有1.5 ml离心管中的上清液汇集至一个15 ml离心管中，并分别保留裂解液总体积的1/50和1/100用于RNA和蛋白质提取。
    注意：这些将作为 "输入" 用于后续分析的样品（图1).
  14. 向500 ml初始酵母培养物中加入300 µg亲和素，在4 °C孵育30分钟（可缩短至10分钟） oC，持续滚动（10 rpm）。
    注意：亲和素可阻断生物素及生物素化蛋白与链霉亲和素磁珠的结合。
  15. 在与细胞裂解液孵育前，预先洗涤链霉亲和素珠。
    1. 将约 300 µl 链霉亲和素磁珠悬液转移至 1.5 ml 微量离心管中，去除上清液，得到约 250 µl 磁珠。用 1 ml RaPID 裂解缓冲液洗涤磁珠两次。在 4 °C 条件下，以 660 × g 离心 2 分钟，收集链霉亲和素磁珠。o每步之间保持 C。
    2. 用 0.5 ml RaPID 裂解缓冲液、0.5 ml 10 mg/ml BSA 和 10 µl 10 mg/ml 酵母 tRNA 混合液于 beads 上，4°C 孵育 1 小时以进行封闭。beads 可在封闭液中于 4°C 过夜孵育。o必要时旋转 C。
    3. 用1 ml RaPID裂解缓冲液洗涤两次。
      注意：磁珠也可用于缩短时间并降低背景，但其结合容量低于Sepharose beads。
  16. 向亲和素裂解液（来自步骤1.14）中加入250 µl预清洗的链霉亲和素磁珠，于4 °C以10 rpm持续旋转孵育1小时。
    注意：该孵育时间是在保证足够结合时间与尽量减少RNA降解风险之间的一种折中方案。
  17. 在 4℃ 下以 660 × g 离心 2 分钟 oC，以清洗链霉亲和素珠，并将上清液转移至新的15 ml离心管中。保留裂解液体积的1/50和1/100，分别用于RNA和蛋白质的提取。
    注意：这些将是 "未结合" 样品
  18. 用1 ml RaPID裂解缓冲液洗涤磁珠，轻轻振荡，转移至新的1.5 ml微量离心管中，按步骤1.17进行离心。重复此步骤三次。
  19. 用1 ml RaPID Wash缓冲液洗涤磁珠，此次在4 °C下以10 rpm旋转5分钟。重复此步骤两次。
  20. 用1 ml 1×PBS洗涤磁珠，并按上述方法离心。
  21. 用120 µl的1x PBS再次洗涤磁珠。按上述条件离心，收集全部上清液用于RNA和蛋白质提取 "洗涤" 样品
    注意：最后一次洗涤样本将用于指示洗涤的严谨程度，其体积应与洗脱样本相同，以便于后续检测中的处理和上样。
  22. 为从柱子中洗脱RNA及与RNA结合的蛋白质，加入120 µl含6 mM生物素的1x PBS溶液，在4 °C下以10 rpm持续旋转孵育45分钟。
  23. 离心磁珠，操作同上，将洗脱液转移至新的1.5 ml离心管中。再次离心洗脱样品，将上清液转移至新的1.5 ml离心管，以确保无磁珠残留。
  24. 采集样本用于RNA或蛋白质提取。
    注意：所取体积应根据后续检测方法及目标 RNA 或蛋白的表达水平而定。作为参考，进行 Northern 分析时26取80%样品用于蛋白质印迹分析23,27 或RT-PCR28，取20%，用于质谱分析29 要发现新蛋白质，请取用全部样品。

2. RNA 提取

  1. 加入等体积的2倍交联逆转缓冲液，在65 °C孵育45分钟。随后直接进行RNA提取。
    注意：交联逆转缓冲液含有乙二胺四乙酸（EDTA），可显著提高RNA提取效率20。
  2. 采用标准的苯酚:氯仿法26从"input"和"unbound"样品中提取RNA（步骤1.13和1.17）。
    注意：这些样品中含有大量RNase抑制剂肝素，可能抑制后续依赖逆转录酶（RT）的实验（例如，RT-PCR）。因此建议采用LiCl沉淀法30将其去除。"wash"和"elution"样品（步骤1.21和1.24）中RNA含量较低，需通过以下步骤进行沉淀。
  3. 向"wash"和"elution"样品中加入等体积的8 M盐酸胍（GuHCl）及两倍体积的100%乙醇，在-80 °C孵育至少2小时。
    注意：盐酸胍可有效变性蛋白质，从而抑制样品中的RNase和蛋白酶活性。
  4. 在20,000 × g、4 °C条件下离心30分钟，弃去上清液。用预冷的80%乙醇洗涤沉淀，再次在20,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。
  5. 将RNA沉淀溶解于400 µl无RNase的水中，再次沉淀以去除残留的GuHCl或其他污染物。加入40 µl 3 M乙酸钠（pH 5.2）和800 µl 100%乙醇，在-20 °C孵育至少1小时。
  6. 按步骤2.4进行离心和洗涤，并用10 µl枪头彻底去除乙醇。将RNA沉淀重悬于10 µl无RNase的水中。操作时需格外小心，因RNA沉淀通常不可见。
    注意：样品可用于如文献23所述的Northern分析（图1）。

3. 蛋白质制备用于蛋白质印迹或质谱分析

  1. 向蛋白质样品中加入1/3体积的4x Laemmli上样缓冲液（LSB），在65 °C孵育45分钟，以逆转RNA与蛋白质之间的交联。
    注意：样品可在-20 °C保存。
  2. 将蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）31上电泳。根据待分析蛋白质的大小调整凝胶浓度。
    注意：10%丙烯酰胺凝胶具有较宽的分离范围，适合作为初步分析。
  3. 按照标准免疫印迹分析方法27将蛋白质转移至膜上，用于检测分离效率（图1C）。在进行质谱分析前，可使用考马斯亮蓝R250或银染对凝胶进行染色。
    注意：推荐使用银染，因其灵敏度更高，检测效果更佳（图1B）。染色可使用自行配制的溶液或商业试剂盒。凝胶在最终染色液中的孵育时间需通过实验确定。长时间孵育有助于检测低丰度蛋白质，但可能导致高表达蛋白（如MS2-CP-SBP-GFP）过度染色，掩盖其周围蛋白信号，同时可能产生较高背景。请密切观察反应过程，并在适当时间加入终止液。
  4. 从凝胶中切下目标条带并转移至1.5 ml离心管中。样品可于-20 °C保存，或直接送样进行蛋白质提取和胰蛋白酶消化，随后进行LC-MS/MS分析32。
  5. 作为排除凝胶分离步骤的替代蛋白质组学方法，可将步骤1.24中洗脱的产物在溶液中直接用胰蛋白酶消化，并进行LC-MS/MS分析33。
    注意：省略SDS-PAGE分离步骤可简化实验流程并提高得率。然而，样品中可能残留去垢剂NP-40，从而抑制质谱分析。为解决此问题，请执行以下步骤：
    1. 将蛋白质在SDS-PAGE31上电泳10–15分钟。
    2. 切下整个泳道区域（i.e.，蛋白质所在位置）。
      注意：蛋白样品中可能含有大量MS2-CP-SBP蛋白，可能掩盖低丰度蛋白的信号。

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结果

RaPID 可实现特定目标 RNA 及其结合蛋白的分离。该方法成功的关键在于尽可能保持 RNA 的完整性，从而获得足量的结合蛋白。为评估 RNA 分离的效率与质量，需进行 Northern 杂交分析（图 1A）。Northern 杂交的优势在于可直接反映 RaPID 的效率与 RNA 质量，因此可在一次实验中同时确定全长 RNA 与降解产物的相对含量。核糖体 RNA（rRNA）在溴化乙锭染色中易于检测，而洗脱组分中缺乏 rRNA 信号表明纯化过程具有较高的严谨性。纯化的严谨性与特异性还通过未标记 mRNA（ACT1，底部图）在洗脱组分中无信号进一步证实。FPR1 泳道中出现的微弱信号并非 ACT1 大小的条带，而是此前使用 MS2L 探针杂交残留的信号。Northern 杂交结果还显示，与采用热酚法提取的 RNA 相比（ACT1 探针组），输入 RNA 稍有降解。这归因于 RaPID 实验流程更长且更为复杂。尽管如此，Northern 杂交在洗脱组分中检测到强信号（MS2L 探针），表明有大量全长且带标签的 RNA 被特异性地成功分离。<...

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讨论

多种方法利用特异性mRNA的分离来鉴定与其结合的蛋白质11,34 35这些方法适用 体外 和 体内 探究RNA-蛋白质相互作用的策略 体外 方法：将体外转录的RNA与细胞裂解液共同孵育，以捕获RNA结合蛋白并分离核糖核蛋白复合物36,37一种此类有效方法 recently 被提出，该方法能够鉴定出与调控性 RNA 模体结合的新型蛋白质18这些方法的一个缺点是会在细胞外环境中发生非特异性RNA结合蛋白的结合。 在体 方法，即在蛋白质处于天然环境时进行交联，可更真实地反映RNA-蛋白相互作用。此外，交联可在分离过程中实现更高的严谨性，从而提高特异性。PAIR方法17 利用靶向RNA的反义序列转染，将肽段引导至RNA结合蛋白（RBP）附近，随后可使肽段与RBP发生交联，并通过连接有与反义序列互补序列的磁珠进行富集。PAIR方法的优势在于其操作简便，适用于多种细胞类型，无需复杂的基因组操作。然而，该方法依赖于转染效率，若仅有较低比例的细胞成功摄入反义序列，则会导致实...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们感谢 Jeff Gerst 教授和 Boris Slobodin 在建立 RaPID 方案以及提供必要质粒过程中给予的有益建议。我们还感谢 Avigail Atir-Lande 博士在建立本方案过程中的帮助，以及 Smoler 蛋白质组学中心的 Tamar Ziv 博士在 LC-MS/MS 分析方面的协助。我们感谢 Rutgers 大学的 T.G. Kinzy 教授提供 YEF3 抗体。本研究由美国-以色列两国科学基金会（Binational Science Foundation）资助，项目编号为 2011013。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
TrissigmaT1503
SDSbio-lab1981232300
DTTsigmaD9779
酸性苯酚（pH 4.3）sigmaP4682
酸性苯酚:氯仿（5:1，pH 4.3）sigmaP1944
氯仿bio-lab3080521
甲醛Frutarom5551820
甘氨酸sigmaG7126
NP-40Calbiochem492016
肝素SigmaH3393
苯甲基磺酰氟（PMSF）SigmaP7626
亮抑蛋白酶肽SigmaL2884
抑肽酶SigmaA1153
大豆胰蛋白酶抑制剂SigmaT9003
胃蛋白酶抑制剂SigmaP5318
DNase IPromegaM610A
核糖核酸酶 抑制剂Takara2313A
玻璃珠SartoriusBBI-8541701直径0.4-0.6 mm 
微型珠磨机BioSpecMini BeadBeater 16
胍基SigmaG4505
亲和素SigmaA9275
链霉亲和素磁珠GE Healthcare 17-5113-01
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA7906
酵母tRNASigmaR8508
生物素SigmaB4501
酵母提取物Bacto288620
蛋白胨Bacto211677
葡萄糖SigmaG8270
1×磷酸盐缓冲液（PBS）
0.2 M NaOH
4×Laemmli上样缓冲液（LSB）0.2 M Tris-HCl pH 6.8，8% SDS，0.4 M DTT，40%甘油，0.04%溴酚蓝。
热苯酚裂解缓冲液10 mM Tris pH 7.5，10 mM EDTA，0.5% SDS 
3 M 醋酸钠 pH 5.2
100% 和 70% 乙醇（EtOH）
无RNase水
RaPID裂解缓冲液20 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，1.8 mM MgCl2，0.5% NP-40，5 mg/ml 肝素，1 mM 二硫苏糖醇（DTT），1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），10 µg/ml 亮抑蛋白酶肽，10 µg/ml 抑肽酶，10 µg/ml 大豆胰蛋白酶抑制剂，10 µg/ml 胃蛋白酶抑制剂，20 U/ml DNase I，100 U/ml 核糖核酸酶 抑制剂。
2×交联逆转缓冲液100 mM Tris pH 7.4，10 mM EDTA，20 mM DTT，2% SDS。
RaPID洗涤缓冲液20 mM Tris-HCl pH 7.5， 300 mM NaCl，0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
银染增强试剂盒Bio-Rad 161-0449用于检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质
SD选择性培养基 1.7 g/l 无氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础培养基，5 g/l 硫酸铵，2% 葡萄糖，350 mg/l 苏氨酸，40 mg/l 甲硫氨酸，40 mg/l 腺嘌呤，50 mg/l 赖氨酸，50 mg/l 色氨酸，20 mg/l 组氨酸，80 mg/l 亮氨酸，30 mg/l 酪氨酸，40 mg/l 精氨酸
抗eEF3抗体（EF3A, YEF3）Kinzy TG.（UMDNJ Robert Wood Johnson 医学院）惠赠1:5,000
抗GFP抗体Santa Cruzsc-83341:3,000
抗兔IgG-HRP偶联抗体SIGMAA91691:10,000

参考文献

  1. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255(2008).
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