本方案描述了一种使用髓内锁定钉进行股骨截骨标准化固定的骨接合技术，可用于分析小鼠正常及缺陷性骨愈合过程。
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本文内容
摘要
摘要
骨愈合模型对于开发临床骨折治疗的新治疗策略至关重要。此外，小鼠模型在创伤研究中的应用日益广泛。小鼠提供了大量突变品系和抗体，可用于分析骨愈合这一高度分化过程背后的分子机制。为了控制生物力学环境，在小鼠中必须采用标准化且特征明确的骨固定技术。本文报道了一种用于稳定小鼠开放性股骨截骨的髓内钉的设计与应用。该髓内钉由医用级不锈钢制成，具有较高的轴向和旋转刚度。该植入物还可实现从0.00 mm到2.00 mm之间精确且恒定的截骨间隙大小。当截骨间隙为0.00 mm和0.25 mm时，采用髓内锁定钉固定后可通过软骨内成骨和膜内成骨实现充分的骨愈合。而当截骨间隙为2.00 mm时，则导致萎缩性骨不连。因此，该髓内锁定钉可用于骨愈合与非愈合模型。与其它开放性骨愈合模型相比，使用该髓内钉的另一个优势在于能够稳定固定骨替代材料和支架，从而研究骨整合过程。其缺点是相较于闭合式模型，所有开放式手术本身更具侵入性。另一潜在缺点是所有髓内固定技术固有的问题，即可能对髓腔造成一定程度的损伤，相较于髓外固定技术而言更为明显。
引言
可利用细胞和球体培养在体外（in vitro）研究骨愈合的生物学过程，但也需要通过动物实验进行体内（in vivo）研究。尽管大动物实验在临床前测试中仍具有重要作用，但过去十年中，对产品或假设的早期测试已发生变化，如今通常在小动物模型中进行1。这一转变基于多种原因：与猪和羊相比，小鼠和大鼠的生产和维护成本更低；此外，小动物具有更短的繁殖周期和更短的正常愈合时间，这两点均有利于开展大规模的慢性实验。最后，基因靶向动物和特异性抗体的可获得性，使得能够分析骨愈合过程中的分子机制。然而，尽管先前在大动物模型中使用的骨固定技术可基本无变异地从人类或兽医临床护理中的类似操作直接转化应用，但在体型较小的大鼠和小鼠中开发和应用骨固定技术却面临挑战。
众所周知，生物力学环境对骨愈合过程具有显著影响2。根据人类骨折愈合的研究可知，骨折固定的稳定性差异会导致不同的愈合方式，包括刚性固定后发生的膜内成骨以及较不刚性固定并伴有微动时发生的软骨内成骨。完全的轴向或旋转不稳定可能会延缓愈合过程，甚至导致骨不连3。因此，我们认为有必要在小鼠和大鼠中开发先进的植入系统和骨固定技术。通过这种方式，可对生物力学条件进行适当标准化，从而在分析愈合过程时确保结果的有效性。
尽管近年来已引入多种高度复杂的鼠类固定技术，但目前最常用的技术仍然是简单的髓内针固定法。然....
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方案
所有操作均经机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循相关机构指南（德国萨尔布吕肯消费者保护局，官方兽医服务中央机构）。镇痛和感染预防措施应符合实验所在国家和机构的相应指南。
1. 植入物和外科手术器械的准备
- 从显微外科器械盒中选取手术刀片（15号）、小型解剖剪、精细镊子、敷料镊、小型钳子、24号（G）和27号（G）针头、不可吸收的5-0缝线以及持针器。
- 取出髓内钉、交锁针、专用瞄准装置、Gigli锯、Gigli锯模板、中心定位钻头（直径1 mm）、钻头（直径0.3 mm）和手动钻（图2；参见材料清单）。
注意：髓内钉（直径0.8 mm，长度15.7 mm）为医用级不锈钢材质制成的髓内锁定钉，用于逆行植入股骨。该髓内钉近端带有螺纹（长度4 mm），并设有两个孔，用于插入交锁针（直径0.3 mm），以实现轴向和旋转稳定性（图1）。 - 将植入物及所有手术器械浸入消毒液（例如，96%酒精）中5分钟，或进行灭菌处理（蒸汽灭菌，130 °C，25分钟）。消毒或灭菌后，将器械置于无菌手术巾上。将无菌手术巾紧邻小型动物手术台放置。
2. 动物、麻醉与镇痛
- 根据研究目的和科学问题选择合适品系、年龄和性别的小鼠。
注意：....
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结果
从皮肤切开到伤口闭合，整个手术过程的总时长约为30分钟。使用所提供的外科植入物，手术可在无体视显微镜的条件下进行。术后每日对动物进行监测。术后镇痛在3天后停止，因为此后所有动物均未表现出疼痛迹象（如发声、躁动、活动减少、不梳理毛发、异常姿势或对周围环境缺乏正常兴趣）。动物在术后2天内即恢复正常负重。在整个观察期间，未发现伤口感染或继发性骨折。
可能出现的最重要并发症是锁定钉植入位置错误，导致钉端突出于膝关节髁部水平（图3 A）。这主要由于瞄准装置操作不当，或使用了股骨过小的动物所致，尤其常见于体重低于20 g的小鼠。另一并发症是交锁针发生移位（图3 B）。该并发症可通过术中或术后立即进行放射影像学检查，确认植入物位置正确而避免。此问题主要由交锁针插入不完全引起。最后，在实验结束时取骨过程中曾数次遇到困难，原因是难以取出交锁针，这通常是由于针周围形成骨性桥接所致。
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讨论
手术技术中最关键的步骤是髓内钉、瞄准装置和锁钉的准确定位。髓内钉必须完全插入至其远端标记的凹槽处，因为若髓内钉在髁部水平突入膝关节腔，可能限制膝关节活动（图3 A）。因此，必须考虑股骨的大小以及相应动物的体重。外科医生还应特别注意连接髓内钉适配器法兰的瞄准装置的最终位置，以确保截骨部位始终位于骨干中段的相同位置。最后，交锁钉必须完全贯穿双侧皮质骨，以避免在观察期间发生钉移位（图3 B）。因此，应通过旋转动作并施加持续的轴向负荷将锁钉插入股骨。当达到交锁扭矩时，钉的驱动轴将自动折断。在将动物纳入研究方案之前，必须通过放射影像学检查确认髓内钉和锁钉的最终位置。
实验结束时，在取骨过程中最关键的步骤是从髓内钉中取出交锁螺钉。通常情况下，螺钉的末端会被新形成的骨组织覆盖。实际上，必须切除这些骨组织，直至能够顺利取出螺钉。此操作必须极为小心，因为任何对股骨的损伤都可能影响愈合后骨骼的生物力学特性。有时，从股骨的背侧更易于取出螺钉。使用普通的持针器即可轻松取出髓内钉本身。
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披露
Romano Matthys 是瑞士达沃斯 RISystem AG 公司的员工，该公司生产植入物及与植入物配套的专用器械。其他作者无利益冲突。
致谢
本工作由瑞士达沃斯的 RISystem AG 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MouseNail | RISystem AG | 221,122 | |
| MouseNail 定位装置 | RISystem AG | 221,201 | |
| MouseNail 髓内固定针 | RISystem AG | 221,121 | |
| 中心定位钻头 | RISystem AG | 592,205 | |
| 钻头 | RISystem AG | 590,200 | |
| Gigli 丝锯 | RISystem AG | 590,100 | |
| 缝线（5-0 Prolene） | Ethicon | 8614H | |
| 镊子 | Braun Aesculap AG &CoKG | BD520R | |
| 敷料镊 | Braun Aesculap AG &CoKG | BJ009R | |
| 剪刀 | Braun Aesculap AG &CoKG | BC100R | |
| 持针器 | Braun Aesculap AG &CoKG | BM024R | |
| 24 G 针头 | BD Mircolance 3 | 304100 | |
| 27 G 针头 | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| 15 号手术刀片 | Braun Aesculap AG &CoKG | 16600525 | |
| 钳子 | Knipex | 7932125 | |
| 加热保温装置 | Sanitas | 605.25 | |
| 脱毛膏 | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| 眼用润滑剂 | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| 赛拉嗪 | Bayer Vital GmbH | 1320422 | |
| 氯胺酮 | Serumwerke Bernburg | 7005294 | |
| 曲马多 | Grünenthal GmbH | 2256241 | |
| 消毒液（SoftaseptN） | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| CD-1 小鼠 | Charles River | 22 |
参考文献
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Claes, L., Augat, P., Suger, G., Wilke, H. J. Influence of size and stability of th....
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