氯化铁诱导的小鼠血栓形成模型

摘要

我们报道了一种改良的三氯化铁（FeCl₃）诱导的颈动脉、肠系膜动脉以及静脉血栓形成模型，该模型可通过活体显微镜高效地监测闭塞性血栓形成的时间。

摘要

动脉血栓（血凝块）是许多与慢性炎症相关系统性疾病的常见并发症，包括动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、癌症以及慢性自身免疫性风湿性疾病。血栓是大多数心肌梗死、脑卒中和肢体缺血坏死的主要原因，因此血栓形成是一个极为重要的公共卫生问题。由于这些血栓源于血小板的异常活化及随后的凝血过程，针对这些系统的治疗干预在临床上具有重要意义，有助于开发更安全的治疗方法。由于止血系统的复杂性，体外（in vitro）实验无法完全模拟血液与血管壁之间的相互作用，因此体内（in vivo）研究对于理解血栓形成的病理机制至关重要。为此，研究人员已建立了多种小鼠血栓形成模型。其中，三氯化铁（FeCl₃）诱导的血管损伤是一种广泛使用的闭塞性血栓模型，可在无菌且封闭的血管系统环境中反映血小板的活化与聚集情况。该模型基于氧化还原反应诱导的内皮细胞损伤，操作简便，且对抗凝药物和抗血小板药物均具有良好的敏感性。血栓形成导致血流完全阻断所需的时间，可定量反映血管损伤程度以及血小板活化和聚集水平，与血栓性疾病具有相关性。我们对该FeCl₃诱导的血管血栓模型进行了显著优化，使实验数据具有高度可重复性且变异极小。本文将详细描述该模型，并展示来自多个实验设置的代表性数据，以说明该模型在血栓研究中的应用价值。

引言

动脉血栓（血凝块）是许多与慢性炎症相关系统性疾病的常见并发症，包括动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、癌症以及慢性自身免疫性风湿性疾病。动脉循环中发生的血栓源于血小板的异常活化、聚集及随后的凝血机制，与心肌梗死、脑卒中和肢体缺血性坏死密切相关。血管壁是一个复杂的系统，包含多种细胞类型，并受到多种外部因素的影响，包括剪切应力、循环血细胞、激素和细胞因子，以及血管壁内抗氧化蛋白的表达。体外实验无法复制这一复杂环境，因此利用动物模型开展体内研究对于深入理解血栓性疾病相关机制至关重要。

研究表明，小鼠在血栓形成、动脉粥样硬化、炎症和糖尿病等方面具有与人类相似的机制^1,2。此外，可构建转基因小鼠和基因敲除小鼠，以在复杂的生理或病理环境中检测特定基因产物的功能。此类研究可模拟人类疾病病理过程，有助于发现新的信号通路和治疗方法，并为表征药物对血栓形成的影响提供重要信息。

病理性动脉血栓的形成是由于内皮层受损或功能障碍，导致血液暴露于内皮下基质所致^3,4。目前已开发出多种血栓形成模型以诱导此类内皮损伤，例如机械性损伤、基于光敏化合物玫瑰红（Rose Bengal）的氧化性损伤以及激光损伤⁵。在这些模型中，三氯化铁（FeCl₃）诱导的血管损伤是一种广泛应用的血栓形成模型。当该试剂作用于血管外壁时，可引起血管细胞的氧化性损伤....

方案

所有动物实验操作均经克利夫兰诊所机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，符合美国公共卫生局 动物人道护理与使用政策，以及美国国立卫生研究院 实验动物护理和使用的指南.

1. 准备工作：

1. 用于标记血小板的荧光染料
   1. 用生理盐水配制 0.5 mg/ml 的罗丹明 6G 溶液，并使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
2. FeCl₃ 溶液
   1. 用纯水新鲜配制 30% 的 FeCl₃ 储存液（无水，相当于 1.85 M），并用 0.45 µm 滤膜过滤。在 6 cm 组织培养皿中，将 30% FeCl₃ 溶液用纯水稀释至所需浓度 [例如，2.5% (0.154 M)、5% (0.308 M)、7.5% (0.463 M)、10% (0.617 M) 和 12.5% (0.771 M)]，配制 5 ml 新鲜溶液，并保持皿盖关闭。
      注意： 使用培养皿比从窄口容器（如 1.5 ml 微离心管）中更容易取出浸透 FeCl₃ 溶液的滤纸片。FeCl₃ 具有极高危险性，操作时必须采取防护措施，例如佩戴手套、实验服等个人防护装备。

结果

颈动脉血栓形成模型
对于C57BL6背景的小鼠，我们建议以7.5% FeCl₃处理血管1分钟作为起始条件。在7.5% FeCl₃处理下，显微镜下可清晰分辨损伤区域与正常血管壁的边界（见在线视频1），提示内皮层已受到显著损伤。血栓在FeCl₃处理后立即形成，并在所有野生型C57BL6小鼠中于损伤后1分钟内可见。初始形成的血栓不稳定，部分通常会被血流冲走，因此在损伤后2–3分钟时血栓体积变小。从滤纸移除后3–4分钟开始，血栓重新增大，此后形成的血栓较为稳定，通常不会被血流冲走。当使用7.5% FeCl₃时，C57BL6小鼠的平均闭塞时间为11.3 ± 3.16分钟（n = 14）^6,7,19（图5A和在线视频1）。在先前的研究中，我们已证明FeCl₃浓度过低或过高均会削弱抗血栓小鼠品系与野生型小鼠之间的差.......

讨论

FeCl₃诱导模型是最广泛应用的血栓模型之一，不仅可以提供有关基因修饰对血小板功能和血栓形成影响的重要信息^{7,8,16,19,31-33}，还可作为评估治疗性化合物及治疗和预防动脉粥样血栓性疾病策略的有力工具^11,17,34-37。本文展示了我们对该模型的改进与优化，并提供了更多证据以证明该技术的实用性，其灵敏度足以检测抗凝药物（tPA）和抗血小板药物（PAR4抗体）的作用效果。除了用于血栓形成机制研究外，该模型还可用于基于纳米技术的靶向血栓药物递送研究。此外，通过注射荧光活性氧（ROS）指示剂，该模型还可用于检测血管壁活性氧的生成²¹。

进行这些模型实验需要精细的技术。操作者应具备足够的外科手术技能，以及对血管和血细胞生物学的深入理解。三氯化铁（FeCl₃）模型中的几个关键要点包括：₃ 诱导性颈动脉血栓模型为⁶：(1) 暴露足够长度的颈动脉（约5 mm），以便放置滤纸，并预留空间用于在后期通过活体显微镜观察血流情况；(2) 彻底剥离颈动脉周围的外膜软组.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术剪 - 碳化钨	Fine Science Tools	14502-14	剪切并夹持皮肤
显微有齿镊 - 带齿/直型/12 cm	Fine Science Tools	11018-12	剪切并夹持皮肤
梅岑鲍姆精细剪 - 碳化钨/弯型/钝头-钝头/14.5 cm	Fine Science Tools	14519-14	用于解剖和分离软组织
超细止血钳 - 光滑/弯型/12.5 cm	Fine Science Tools	13021-12	用于解剖和分离软组织
格拉费镊 - 带齿/直型/10 cm	Fine Science Tools	11050-10	用于解剖和分离软组织
杜蒙特#5精细镊 - 生物学尖端/直型/不锈钢/11 cm	Fine Science Tools	11254-20	从周围组织中分离血管
杜蒙特#5XL镊 - 标准尖端/直型/不锈钢/15 cm	Fine Science Tools	11253-10	从周围组织中分离血管
钝头钩 - 12 cm/0.3 mm 尖端直径	Fine Science Tools	10062-12	从周围组织中分离血管
卡斯特罗维霍显微持针器	Fine Science Tools	12061-02	持针器
4-0 缝合线	Fine Science Tools	18020-40	用于将门齿固定在载片上
6-0 缝合线	Fine Science Tools	18020-60	用于所有外科手术和结扎
卡尔特缝合针	Fine Science Tools	12050-03
罗丹明6G	Sigma	83697-1G	用于标记血小板
FeCl3（无水）	Sigma	12321	用于诱导血管损伤
盐酸罂粟碱	Sigma	P3510	用于抑制肠道蠕动
Medline 外科器械灭菌蒸汽高压灭菌胶带	Medline	111625	用于将小鼠固定在载片上
Fisherbrand™ 注射器滤器 - 无菌 0.22 µm	Fisher	09-720-004	用于过滤注射给小鼠的溶液
Fisherbrand™ 注射器滤器 - 无菌 0.45 µm	Fisher	09-719D	用于过滤 FeCl3 溶液
无菌酒精擦拭垫	Fisher	06-669-62	用于手术部位的消毒
琼脂糖	BioExpress	E-3120-500	用于制备凝胶载片
Leica DMLFS 荧光显微镜	Leica		活体显微镜
GIBRALTAR 平台及带加热板的 X-Y 位移系统	npi electronic GmbH		http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix 版本 3.17.2 软件	NorPix		https://www.norpix.com/