快速特异性检测富含白细胞血液样本中的卤化过氧化物酶活性

摘要

本方案描述了从小份血液样本中快速富集白细胞，以进一步特异性测定细胞内卤化过氧化物酶活性的方法。该方法适用于人和非人样本，可能有助于新型炎症标志物的评估。

摘要

本文描述了一种从小体积全血样本中快速、标准化富集白细胞的实验方案。该方法基于红细胞的低渗裂解，既可用于人源样本，也可用于非人源血液样本。由于初始样本量仅需约 50 至 100 µl，该方法适用于小型实验动物的重复采血。此外，白细胞富集可在数分钟内完成，且在试剂和仪器方面所需材料成本低，因此可在多种实验室环境中应用。

标准化的白细胞纯化与高选择性染色方法相结合，用于评估血红素过氧化物酶髓过氧化物酶（MPO）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）的卤化过氧化物酶活性。 即， 次氯酸和次溴酸（HOCl 和 HOBr）的生成。髓过氧化物酶（MPO）在中性粒细胞中高表达，而中性粒细胞是人类血液中最丰富的免疫细胞类型，同时也表达于单核细胞中；相比之下，相关的酶嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）仅在嗜酸性粒细胞中表达。通过使用几乎特异性识别 HOCl 和 HOBr 的荧光探针氨基苯基荧光素（aminophenyl fluorescein, APF）以及过氧化物酶的主要底物过氧化氢，可检测这些酶的卤化活性。随后通过流式细胞术分析，可区分所有过氧化物酶阳性细胞（中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞），并定量其卤化过氧化物酶活性。由于 APF 染色可与细胞表面标志物联合应用，本实验方案可进一步扩展，用于特异性分析白细胞亚群。该方法适用于检测人和啮齿类动物白细胞中 HOCl 与 HOBr 的生成。

鉴于这些酶促产物在慢性炎症性疾病中广泛且多样化的免疫学作用，本方案可能有助于更好地理解白细胞来源的血红素过氧化物酶的免疫学意义。

引言

多形核白细胞（PMNs，也称为粒细胞）和单核细胞是血液中先天免疫系统的重要细胞组分^1,2。它们不仅参与对病原体的初级防御，还参与获得性免疫系统的激活以及全身性炎症反应的启动^2-4。特别是中性粒细胞——最丰富的粒细胞类型——以及单核细胞，在调控和终止急性炎症事件中也发挥着重要作用⁵。因此，这些细胞可能在类风湿性关节炎等慢性炎症性疾病中也具有重要意义^6,7。事实上，哮喘是一种慢性炎症性气道疾病，其特征是嗜酸性粒细胞凋亡受损，而嗜酸性粒细胞是血液中第二常见的粒细胞类型⁸。然而，粒细胞的凋亡及其被巨噬细胞快速清除，是炎症细胞终止过程中的两个关键步骤^9-11。

在上述免疫细胞中，存在两种密切相关的酶，即髓过氧化物酶（MPO，存在于中性粒细胞和单核细胞中）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO，存在于嗜酸性粒细胞中）^12,13。这些血红素过氧化物酶传统上与体液免疫反应相关，因其可通过双电子氧化机制将（类）卤化物氧化为相应的次（类）卤酸，后者具有已知的杀菌特性^14-16。在生理条件下，MPO 主要生成次氯酸（HOCl）和次硫氰酸根（^-OSCN），而 EPO 则生成后者及次溴酸（HOBr）^17-19。最新研究表明，这种（类）卤化酶活性可能还参与调控炎症反应以及终止免疫反应的过程^20,21。事实上，已有研究证实 MPO 产生的 HOCl 及其衍生产物能够抑制基于 T 细胞的适应性免疫反应^22-24。

为了更深入地了解先天免疫系统中白细胞在慢性炎症疾病中的免疫学作用，并确定髓过氧化物酶（MPO）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）在该生理功能中的贡献，我们建立了一种方法，可从少量血液样本中快速富集白细胞，进而特异性测定这些细胞中的卤化过氧化物酶活性。为去除红细胞，我们采用了一种标准化方法，包括使用蒸馏水进行两次连续的低渗裂解步骤，可在材料成本较低的情况下实现快速的白细胞富集。随后，为测定具有卤化活性的MPO和EPO活性，采用了对次氯酸（HOCl）和次溴酸（HOBr）特异的荧光探针氨基苯基荧光素（aminophenyl fluorescein, APF）^25-27。与非特异性的过氧化物酶染色方法^28,29相比，该方法能够选择性地检测卤化过氧化物酶活性，而这种活性在严重炎症状态下常受到损害^30,31。

方案

所有人体血液样本均来自健康志愿者，所采用的白细胞富集方案遵循莱比锡大学医学院伦理委员会的指导原则。大鼠血液实验经萨克森州地方管理局（Landesdirektion Sachsen，Referat 24）负责的当地伦理委员会批准，符合德国关于动物护理和使用的指南规定。

1. 实验设置

注意：由于从血液样本中通过低渗裂解法去除红细胞的操作具有严格的时间要求，因此请提前准备好该步骤所需的所有设备（例如缓冲液）。

1. 为每份血液样本标记一个15 ml离心管用于低渗裂解，另标记一个1.5 ml样品管用于后续氨基苯基荧光素（APF）染色。
   1. 若白细胞富集操作需在无菌条件下进行，则应在生物安全柜内完成标记。
2. 每份样本准备约12 ml磷酸盐缓冲液（PBS，10 mM）。根据是否需要在无菌条件下分离白细胞，选择使用供应商提供的无菌即用型溶液，或在蒸馏水中溶解PBS片剂来配制PBS。检测pH值，必要时用少量0.1 M HCl和NaOH溶液调节至pH 7.4。
   1. 将PBS片剂（见材料表）溶于200 ml蒸馏水中，得到约可满足16个样本使用的非无菌缓冲液。如需，可通过无菌过滤对该溶液进行灭菌。
3. 每份样本准备约1 ml含Ca²⁺的Hanks平衡盐溶液（HBSS）。
   1. 将970 mg HBSS盐溶于100 ml（终体积）重蒸水中。在定容前检测pH值，并调节至pH 7.4。由于其缓冲能力较低，该缓冲液需每日新鲜配制，并使用少量0.1 M HCl和NaOH溶液小心调节pH值。
      注：根据实验需求可使用无菌溶液，该溶液可通过无菌过滤进行灭菌。
4. 除上述两种缓冲液外，预先标记并准备一个容器（例如，50 ml离心管）或烧杯（例如，250 ml量杯），内装重蒸水用于低渗裂解步骤，每份样本准备约10 ml水。
5. 为后续在冰上进行的APF染色（第3节）准备一个装有碎冰的容器。
6. 提前分装APF，以便快速配制染色过程中使用的现用工作液（步骤3.2），并避免APF溶液反复冻融。
   注：APF通常以5 mg/ml（11.81 mM）的甲基乙酸酯溶液形式提供作为储备液。
   1. 将10–100 µl分装至0.5 ml离心管中并冷冻保存。APF染色时使用终浓度为10 µM的染料（步骤3.8）。

2. 红细胞低渗裂解

注意：除离心步骤外，低渗裂解步骤均需在层流罩内进行，以避免污染。整个操作过程应在室温下进行。由于低渗裂解是一个时间敏感的过程，在开始操作前应预先调节移液器以准确加入水（2 ml）和 PBS（5 ml），并提前打开水和 PBS 的瓶盖。使用前将 PBS 溶液和蒸馏水置于室温下保存。

1. 从每份血样中转移100 µl至相应的15 ml离心管中。
   注意：在我们的实验中，血液样本通常含有10 U/ml肝素，以防止凝固。然而，由于样本来源不同，抗凝剂的种类和浓度可能有所差异。其对APF染色的影响应通过将结果与添加了其他类型或浓度抗凝剂的血液样本所得结果进行比较来验证。
2. 加入2 ml蒸馏水，使用旋涡混合器（调至中速）混匀样品。将样品孵育60秒，然后每份样品加入5 ml PBS，再次使用旋涡混合器混匀。
   注意：最多可同时处理约5个样品。加入水和PBS时应保持样品顺序一致，以确保孵育时间具有可比性。
3. 在加入 PBS 恢复等渗条件后（步骤 2.2），于室温下以 450 × g 离心 6 分钟，沉淀所有样品中剩余的完整细胞。
4. 将上清液倒入台面废液桶中弃去。通过倒置离心管并轻敲管口接触纸巾，尽可能去除残留液体。确保细胞沉淀尽可能干燥。
5. 重复之前所述的低渗裂解步骤（步骤 2.2）。
   注意：原则上，根据所需获得的混合白细胞组分的纯度，低渗裂解步骤（步骤 2.3 至 2.5）可重复多次。经过两次裂解步骤后，所得混合细胞组分中残留红细胞的比例约为 25%。
6. 通过离心（室温，450 × g，6 分钟）使剩余的完整细胞沉淀。弃去上清液（参见步骤 2.4）。向沉淀中加入 500 µl HBSS，轻轻溶解至形成均一溶液。将每个样品转移至相应标记的 1.5 ml 样品管中。
7. 根据实验需要，直接分析所获得的样品（例如， 通过流式细胞术²⁵，用荧光标记的抗体染色（用于鉴定单细胞类型）³²，加入细胞刺激物孵育（用于细胞激活实验）³³ 或置于冰上保存以备后续使用。根据研究目的，应立即对混合白细胞组分进行后续实验，因为粒细胞的半衰期较短，约为20小时。
   注意：这也适用于下文所述的过氧化物酶活性染色。

3. 卤化过氧化物酶活性染色

注意：血液来源的血红素过氧化物酶 MPO 和 EPO 产生的次氯酸（HOCl）和次溴酸（HOBr）可通过 APF 进行定量检测，APF 可被上述次卤酸氧化为荧光素。因此，若将荧光标记抗体的细胞染色与 APF 染色联合使用，应避免使用会干扰荧光素发射信号的荧光染料。

1. 在冰上于 4 °C 进行 APF 染色。
2. 配制APF工作液时，将染料的适当分装量解冻例如， 10 µl，11.81 mM）用 HBSS 稀释至恰好 1 mM（例如， 加入108.1 µl缓冲液至10 µl样本中。
   1. 为每个样品（500 µl 细胞溶液）配制 5 µl 上述 APF 工作液。因此，使用一份 10 µl 的 APF（11.81 mM）可配制约 118.1 µl 的 APF 工作液（1 mM），用于制备约 20 个样品。由于移液过程中存在损耗，应比计算量多配制约 10% 的 APF 工作液。
3. 为了检测APF染色的过氧化物酶特异性，使用血红素过氧化物酶抑制剂4-氨基苯甲酸肼（4-ABAH）制备对照样品。³⁵.
   1. 配制4-ABAH（151.17 g/mol）的1 M储存液：将75.6 mg 4-ABAH溶于500 µl二甲基亚砜（DMSO）中。随后用HBSS将4-ABAH溶液稀释10倍。
4. 用于制备 H₂O₂ 工作液 标记两个1.5 ml离心管 "70 mM H₂O₂" 和 "7 mM H₂O₂"分别。
   1. 在标记为的试管中 "70 mM H₂O₂"，新鲜稀释10 µl 30%的储存液（8.8 mM）H₂O₂ 使用990 µl蒸馏水配制，获得约88 mM的浓度。置于冰上保存，并在4小时内使用。
      注意：H₂O₂ 通常由供应商以30%的储存液形式提供。在4 °C下保存时，可稳定约3年。进行H的稀释时₂O₂ 在蒸馏水中以避免分解。H₂O₂ 稀释也可在0.1 M NaOH溶液中进行。
   2. 为了确定精确的 H₂O₂ 浓度：从第一份 H 进行 1 到 10 倍的进一步稀释₂O₂ 通过将此溶液100 µl加入至已标记的1.5 ml离心管中的900 µl蒸馏水中，配制成储备液（约88 mM） "7 mM H₂O₂".
   3. 在近紫外光区记录光谱（例如， 200-300 nm）范围内使用紫外-可见分光光度计测定，并采用240 nm处的吸光度（ε₂₄₀ = 34 M^-1 厘米^-1) 以确定实际的 H₂O₂ 第二次H中的浓度₂O₂ 储备液³⁴确保参比比色皿中仅含有蒸馏水。测量时使用石英比色皿，因为需记录紫外光谱范围内的吸收光谱。
   4. 根据该结果，计算出 H 的精确浓度₂O₂ 储备液。调整第一种储备液的浓度 "70 mM H₂O₂^" 通过加入适量蒸馏水，将样品管中的溶液准确稀释至70 mM。将所得工作液置于冰上保存，并在一小时内使用。
5. 向适当的样品中加入5 µl的4-ABAH工作液（100 mM），使终浓度为1 mM。在加入APF前，将样品于37 °C孵育箱中孵育15分钟。
6. 向每个500 µl样品中加入5 µl APF工作液（1 mM），使染料终浓度为10 µM。轻轻混匀样品例如， 使用涡旋混合器（中速）混匀，于37 °C孵育30分钟。
7. 加入5 µl H₂O₂ 将工作液（70 mM）加入每份500 µl样品中，使终浓度为700 µM。轻轻混匀样品，在37 °C孵育60分钟。同时进行适当的对照实验。
   注意：对照测量显示，700 µM H₂O₂ 对细胞无毒性，也未观察到任何显著的细胞反应。
   注意：APF 染色也可在不添加 H 的情况下进行₂O₂，具体取决于科学问题。在没有过氧化氢的情况下，仅测定基础的髓过氧化物酶（MPO）和嗜酸性过氧化物酶（EPO）氯化活性，而加入 H₂O₂ 后可测定其完全激活的活性。₂O₂ 可检测细胞产生次氯酸（HOCl）和次溴酸（HOBr）的最大量，后者意味着荧光信号显著增强。
8. 为沉淀细胞，将样品在室温下以400 × g离心10分钟。小心吸除上清液，避免破坏沉淀，加入250 µl HBSS重悬细胞。
   注意：样品现已准备好通过流式细胞术进行分析²⁵.
9. 将样品避光保存至分析，以避免荧光淬灭。在480-490 nm激发后，检测荧光素在约525 nm处的发射光。³⁷.

结果

如先前报道，上述方法被证明适用于人源和非人源样本³²。此外，针对患有哮喘症状小鼠的研究显示，APF染色可能是检测系统性促炎状态差异的合适工具。因此，在后续研究中，我们采用本方案对患有矿物油诱导性关节炎（PIA）的雌性Dark Agouti大鼠体内髓过氧化物酶（MPO）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）的卤化活性进行了多次评估。本实验中进行的白细胞富集与染色的一个代表性示例如图1所示。在动物麻醉状态下，从其眼球后静脉丛采集约200 µl全血，并用肝素抗凝。使用100 µl样本体积进行红细胞去除及随后的APF染色。之后通过流式细胞术分析样本。

如通过绘制细胞大小与细胞颗粒度的关系图所示（图1A)，实现了样本中红细胞的显著去除。此外，不同类型的白细胞清晰可辨，通过应用荧光标记的细胞表面标志物进行鉴定（未展示）。简而言之，红细胞（CD235a阳性）/细胞...

讨论

由于中性粒细胞是人体血液中最丰富的白细胞，过氧化物酶阳性细胞的分离通常仅针对这些细胞，并通过密度梯度离心法将中性粒细胞与其他白细胞分离³⁸。然而，由于中性粒细胞在小鼠血液样本中含量较低³⁹，因此对后者必须采用更为复杂的方法⁴⁰。此外，这两种方法均会导致样本中过氧化物酶阳性的单核细胞被去除，并且由于需要较大的血液体积（例如，400 µl⁴¹），不适用于从小型实验动物反复采血所获得的微量样本^38,40。从小鼠腹腔渗出液中纯化中性粒细胞还需牺牲动物，且无法获得来源于血液的粒细胞^38,40。近年来发展的一些从小鼠血液中获取高纯度粒细胞组分的方法（例如，使用抗体）往往成本高、操作复杂且耗时较长^40,42,43，并且仍然仅专注于一种过氧化物酶阳性白细胞类型的纯化。

因此，本文所述方法相较于其他用于纯化过氧化物酶阳性白细胞的方法具有一些优势。由于该方法仅需少量血液样本，所获得的细胞能够代表循环系统中的真实情况...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料/设备
15 ml 离心管	VWR/Corning	734-0451	-
1.5 ml 样品管	VWR/Eppendorf	211-2130DE	-
最大加样量为 5 ml 的移液器	Eppendorf	例如，3120000070	我们使用的是 Eppendorf Research plus 可调式移液器，其可调体积范围分别为 1–10 µl、10–100 µl、100–1,000 µl 和 500–5,000 µl
层流工作台	Thermo Electron Corperation	HeraSafe	-
涡旋混合器	Bender & Hobein AG	Vortex Genie 2	-
台式离心机	Kendro Laboratory Products	Laborfuge 400R	离心机应可在 450 × g 条件下运行
小型离心机	Eppendorf	5415D	离心机应可在 400 × g 条件下运行
培养箱	Heraeus	cytoperm 2	设置条件：37 °C，95% 湿度，5% CO2 含量
紫外-可见分光光度计	Varian	Cary 50 bio	需记录 200 至 300 nm 范围内的光谱，因此必须使用石英比色皿
流式细胞仪	Becton, Dickinson	BD Facs Calibur	可使用任何配备适合激发荧光素的激光器的流式细胞仪（例如，488 nm 氩离子激光器）
名称	公司	目录编号	备注
化学试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	amresco	K812	无菌溶液，可直接使用
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	P4417	每 200 ml 去离子水中溶解一片，配制成溶液
含 Ca2+ 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Sigma-Aldrich	H1387	970 mg/100 ml，需仔细检查并调节 pH 值至 7.4
盐酸	Merck Millipore	1.09057.1000	1 M 溶液
氢氧化钠	Riedel-deHaën	30620	固体颗粒。配制 1 M 溶液时，将 4 g 溶于 100 ml 去离子水中
氨基苯基荧光素	Cayman	10157	配制成 5 mg/ml（11.81 mM）的乙酸甲酯溶液，分装（例如 100 µl）后于 -20 °C 保存
过氧化氢	Sigma-Aldrich	H1009	该 30% 储存液浓度约为 8.8 M。使用前需用蒸馏水新鲜稀释，并通过吸光度测定确定其浓度
4-氨基苯甲酸肼（4-ABAH）	Sigma-Aldrich	A41909	先用 DMSO 配制 1 M 储存液，再用 HBSS 稀释 10 倍得到 100 mM 工作液
DMSO	VWR chemicals	23500.26	-