本方案描述了从小份血液样本中快速富集白细胞，以进一步特异性测定细胞内卤化过氧化物酶活性的方法。该方法适用于人和非人样本，可能有助于新型炎症标志物的评估。
本方案描述了从小份血液样本中快速富集白细胞，以进一步特异性测定细胞内卤化过氧化物酶活性的方法。该方法适用于人和非人样本，可能有助于新型炎症标志物的评估。
本文描述了一种从小体积全血样本中快速、标准化富集白细胞的实验方案。该方法基于红细胞的低渗裂解，既可用于人源样本，也可用于非人源血液样本。由于初始样本量仅需约 50 至 100 µl，该方法适用于小型实验动物的重复采血。此外，白细胞富集可在数分钟内完成，且在试剂和仪器方面所需材料成本低，因此可在多种实验室环境中应用。
标准化的白细胞纯化与高选择性染色方法相结合，用于评估血红素过氧化物酶髓过氧化物酶（MPO）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）的卤化过氧化物酶活性。 即， 次氯酸和次溴酸（HOCl 和 HOBr）的生成。髓过氧化物酶（MPO）在中性粒细胞中高表达，而中性粒细胞是人类血液中最丰富的免疫细胞类型，同时也表达于单核细胞中；相比之下，相关的酶嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）仅在嗜酸性粒细胞中表达。通过使用几乎特异性识别 HOCl 和 HOBr 的荧光探针氨基苯基荧光素（aminophenyl fluorescein, APF）以及过氧化物酶的主要底物过氧化氢，可检测这些酶的卤化活性。随后通过流式细胞术分析，可区分所有过氧化物酶阳性细胞（中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞），并定量其卤化过氧化物酶活性。由于 APF 染色可与细胞表面标志物联合应用，本实验方案可进一步扩展，用于特异性分析白细胞亚群。该方法适用于检测人和啮齿类动物白细胞中 HOCl 与 HOBr 的生成。
鉴于这些酶促产物在慢性炎症性疾病中广泛且多样化的免疫学作用，本方案可能有助于更好地理解白细胞来源的血红素过氧化物酶的免疫学意义。
多形核白细胞（PMNs，也称为粒细胞）和单核细胞是血液中先天免疫系统的重要细胞组分1,2。它们不仅参与对病原体的初级防御，还参与获得性免疫系统的激活以及全身性炎症反应的启动2-4。特别是中性粒细胞——最丰富的粒细胞类型——以及单核细胞，在调控和终止急性炎症事件中也发挥着重要作用5。因此，这些细胞可能在类风湿性关节炎等慢性炎症性疾病中也具有重要意义6,7。事实上，哮喘是一种慢性炎症性气道疾病，其特征是嗜酸性粒细胞凋亡受损，而嗜酸性粒细胞是血液中第二常见的粒细胞类型8。然而，粒细胞的凋亡及其被巨噬细胞快速清除，是炎症细胞终止过程中的两个关键步骤9-11。
在上述免疫细胞中，存在两种密切相关的酶，即髓过氧化物酶（MPO，存在于中性粒细胞和单核细胞中）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO，存在于嗜酸性粒细胞中）12,13。这些血红素过氧化物酶传统上与体液免疫反应相关，因其可通过双电子氧化机制将（类）卤化物氧化为相应的次（类）卤酸，后者具有已知的杀菌特性14-16。在生理条件下，MPO 主要生成次氯酸（HOCl）和次硫氰酸根（-OSCN），而 EPO 则生成后者及次溴酸（HOBr）17-19。最新研究表明，这种（类）卤化酶活性可能还参与调控炎症反应以及终止免疫反应的过程
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所有人体血液样本均来自健康志愿者，所采用的白细胞富集方案遵循莱比锡大学医学院伦理委员会的指导原则。大鼠血液实验经萨克森州地方管理局（Landesdirektion Sachsen，Referat 24）负责的当地伦理委员会批准，符合德国关于动物护理和使用的指南规定。
1. 实验设置
注意：由于从血液样本中通过低渗裂解法去除红细胞的操作具有严格的时间要求，因此请提前准备好该步骤所需的所有设备（例如缓冲液）。
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如先前报道，上述方法被证明适用于人源和非人源样本32。此外，针对患有哮喘症状小鼠的研究显示，APF染色可能是检测系统性促炎状态差异的合适工具。因此，在后续研究中，我们采用本方案对患有戊烷诱导性关节炎（PIA）的雌性Dark Agouti大鼠体内髓过氧化物酶（MPO）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）的卤化活性进行了多次评估。本实验中进行的白细胞富集与染色的一个代表性示例如图1所示。在麻醉条件下，从动物的眼后静脉丛采集约200 µl全血，并用肝素抗凝。使用100 µl样本体积进行红细胞去除及随后的APF染色。之后通过流式细胞术分析样本。
如细胞大小与细胞颗粒度的散点图所示（图1A），样本中红细胞被显著去除。此外，不同类型的白细胞清晰可辨，通过荧光标记的细胞表面标志物进行鉴定（未展示）。简言之，红细胞（CD235a阳性）/细胞碎片区域仅占总事件的22.......
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由于中性粒细胞是人体血液中最丰富的白细胞，过氧化物酶阳性细胞的分离通常仅针对这些细胞，并通过密度梯度离心法将中性粒细胞与其他白细胞分离38。然而，由于中性粒细胞在小鼠血液样本中含量较低39，因此对后者必须采用更为复杂的方法40。此外，这两种方法均会导致样本中过氧化物酶阳性的单核细胞被去除，并且由于需要较大的血液体积（例如，400 µl41），不适用于从小型实验动物反复采血所获得的微量样本38,40。从小鼠腹腔渗出液中纯化中性粒细胞还需牺牲动物，且无法获得来源于血液的粒细胞38,40。近年来发展的一些从小鼠血液中获取高纯度粒细胞组分的方法（例如，使用抗体）往往成本高、操作复杂且耗时较长40,42,43，并且仍然仅专注于一种过氧化物酶阳性白细胞类型的纯化。
因此，本文所述方法相较于其他用于纯化过氧化物酶阳性白细胞的方法具有一些优势。由于该方法仅需少量血液样本，所获得的细胞能够代表循环系统中的真实情况.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作得到了德国联邦教育与研究部（BMBF, 1315883）的资助，以及萨克森州复兴银行（SAB）项目100116526的资助，该资助来自欧洲区域发展基金（ERDF）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料/设备 | |||
| 15 ml 离心管 | VWR/Corning | 734-0451 | - |
| 1.5 ml 样品管 | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | - |
| 最大加样量为 5 ml 的移液器 | Eppendorf | 例如，3120000070 | 我们使用的是 Eppendorf Research plus 可调式移液器，其可调体积范围分别为 1–10 µl、10–100 µl、100–1,000 µl 和 500–5,000 µl |
| 层流工作台 | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | - |
| 涡旋混合器 | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | - |
| 台式离心机 | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | 离心机应可在 450 × g 条件下运行 |
| 小型离心机 | Eppendorf | 5415D | 离心机应可在 400 × g 条件下运行 |
| 培养箱 | Heraeus | cytoperm 2 | 设置条件：37 °C，95% 湿度，5% CO2 含量 |
| 紫外-可见分光光度计 | Varian | Cary 50 bio | 需记录 200 至 300 nm 范围内的光谱，因此必须使用石英比色皿 |
| 流式细胞仪 | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | 可使用任何配备适合激发荧光素的激光器的流式细胞仪（例如，488 nm 氩离子激光器） |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 化学试剂 | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | amresco | K812 | 无菌溶液，可直接使用 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P4417 | 每 200 ml 去离子水中溶解一片，配制成溶液 |
| 含 Ca2+ 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml，需仔细检查并调节 pH 值至 7.4 |
| 盐酸 | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1 M 溶液 |
| 氢氧化钠 | Riedel-deHaën | 30620 | 固体颗粒。配制 1 M 溶液时，将 4 g 溶于 100 ml 去离子水中 |
| 氨基苯基荧光素 | Cayman | 10157 | 配制成 5 mg/ml（11.81 mM）的乙酸甲酯溶液，分装（例如 100 µl）后于 -20 °C 保存 |
| 过氧化氢 | Sigma-Aldrich | H1009 | 该 30% 储存液浓度约为 8.8 M。使用前需用蒸馏水新鲜稀释，并通过吸光度测定确定其浓度 |
| 4-氨基苯甲酸肼（4-ABAH） | Sigma-Aldrich | A41909 | 先用 DMSO 配制 1 M 储存液，再用 HBSS 稀释 10 倍得到 100 mM 工作液 |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | - |
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