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方法文章

评估靶向HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中的有效性和毒性

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DOI：

10.3791/54486

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2016年9月5日

 ,  ,  ,  , 
1Virus-Cell Interactions Laboratory, Lady Davis Institute for Medical Research, 2Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 3Department of Medicine, McGill University

本文内容

摘要

本文描述了评估靶向HIV-1复制周期整合后步骤的RNA分子有效性和毒性的方法。这些方法可用于筛选新分子以及优化现有分子的结构形式。

摘要

针对HIV-1复制周期整合后步骤的小RNA疗法是当前基因治疗的首要候选方案之一，同时也具有作为HIV-1感染药物治疗的潜力。整合后抑制剂包括核酶、短发夹（sh）RNA、小干扰（si）RNA、U1干扰（U1i）RNA以及RNA适配体。其中许多抑制剂是通过瞬时共转染实验结合HIV-1表达质粒筛选获得的，部分已进入临床试验阶段。除了评估其有效性外，小RNA还被系统评价了对人类RNA表达的影响、对细胞生长和/或分化的作用，以及是否可能激活先天免疫反应。本文所述的实验方案包含一系列瞬时转染检测方法，旨在评估靶向HIV-1复制周期整合后步骤的RNA分子的有效性与毒性。我们已利用这些方法鉴定出新的核酶，并优化了靶向HIV-1 RNA的shRNA和siRNA的结构形式。这些方法提供了一套快速有效的检测体系，可用于筛选新型抗HIV-1 RNA分子，也可根据需要调整用于筛选其他HIV-1复制整合后抑制剂。

引言

目前人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）治疗的一个局限性在于，必须长期给药以防止疾病进展。移植对HIV-1具有抗性的T淋巴细胞或造血干细胞，有望在无需药物治疗的情况下长期控制HIV-1的复制1,2，并可能成为实现HIV-1治愈的有效策略3。使细胞获得HIV-1抗性的一种方法是在自体移植过程中，将编码抗HIV-1 RNA或肽类的一个或多个基因插入患者自身的细胞中4。目前已设计出多种候选抗HIV-1基因，其中部分基因已进入临床试验，采用两种5或三种6基因联合使用的方式，以防止HIV-1对单一基因产生耐受性。

由于抗HIV-1 RNA引发免疫反应的潜力较低，且由非常短的基因序列转录而来，因此是联合基因治疗的主要候选分子之一。一些抗HIV-1 RNA被设计用于靶向病毒进入和整合过程。然而，大多数抗HIV-1 RNA靶向的是病毒生命周期中的整合后阶段（图1）。整合后抑制剂包括诱饵RNA（decoy RNAs），用于靶向HIV-1调控蛋白Tat或Rev1；以及基于反义RNA的分子，用于靶向HIV-1 RNA中不同位点，例如核酶7、shRNA8和U1i RNA9。用于比较抗HIV-1 RNA有效性的方法包括：监测转导了编码候选RNA基因的细胞中病毒的复制情况，以及检测瞬时转染了表达候选RNA的质粒和HIV-1表达质粒的细胞中病毒的产生情况10-13。我们此前曾使用HIV-1病毒产量检测法来筛选HIV-1 RNA中新的核酶靶位点13-15。此后，这些方法得以优化，以改进从质粒DNA表达为shRNA或以合成siRNA形式递送的RNA干扰分子的实验形式16。该检测法通过测量人胚肾（HEK）293T细胞中成熟病毒的产生量，可用于比较靶向HIV-1复制周期中整合后步骤的抑制剂的作用效果（图1）。对于靶向整合前步骤的抑制剂，则需要使用其他检测方法，例如TZM-bl细胞感染性检测法17，以评估其抗病毒效力。

在临床中递送抗HIV-1 RNA的主要安全问题包括对人类RNA或蛋白质的潜在脱靶效应，以及对天然免疫感受器的激活。为了评估抗HIV-1 siRNA的毒性，我们已在不同细胞系中使用了细胞活力检测16。我们还检测了双链RNA免疫感受器——RNA激活的蛋白激酶R（PKR）和Toll样受体3（TLR3）的激活情况，以及干扰素刺激基因ADAR1 p150的表达水平。这些检测可用于确认抗HIV-1 RNA的疗效并非源于对细胞活力或免疫感受器激活的间接影响，同时也有助于排除具有潜在毒性的候选RNA，避免其进入后续开发阶段。

在以下方案中，描述了识别新型治疗性RNA以及优化现有RNA形式的方法。这些方法可用于筛选基于RNA的HIV-1复制后期整合抑制剂，也可加以改造用于筛选其他类型的后期整合抑制剂，例如靶向Rev介导的病毒RNA输出的小分子18，或设计用于靶向整合型HIV-1 DNA的CRISPR/Cas系统19。

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方案

1. 细胞与转染

  1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK 293T细胞。用细胞培养基制备浓度为2 × 105 个细胞/ml的细胞悬液。分别向24孔板、96孔板和12孔板的每个孔中加入500、100和1,000 µl细胞悬液，用于病毒生产、细胞活力和免疫激活检测（图2A）。
  2. 轻轻摇匀培养板，在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。使细胞生长至50–70%融合度。
  3. 根据转染方案，在1.5 ml微量离心管中配制待测RNA及其对照的稀释液（示例见图2B）。
    1. 对于病毒生产检测，配制浓度为10 ng/µl的HIV-1表达质粒溶液，并向每管中加入10 µl。随后配制浓度为5 µM的待测RNA和阴性对照RNA溶液。根据需要，向对应管中分别加入2.5或10 µl待测RNA或阴性对照RNA稀释液，使终浓度分别为25或100 nM。
    2. 对于细胞活力检测，配制浓度为5 µM的待测RNA溶液和浓度为10 mg/ml的阳性对照RNA（低分子量Poly I:C）溶液。向对应管中分别加入2 µl待测RNA或阳性对照RNA稀释液，使终浓度分别为100 nM或200 µg/ml。
    3. 对于免疫激活检测，向对应管中分别加入20 µl步骤1.3.2中配制的待测RNA或阳性对照RNA稀释液，使终浓度分别为100 nM或200 µg/ml。
      注：若测试的是RNA表达质粒，则以10 ng/µl的质粒稀释液替代5 µM的待测RNA稀释液，在步骤1.3.1中终量分别为25和100 ng，在步骤1.3.2和1.3.3中终量均为100 ng。
  4. 分别向用于病毒生产、细胞活力和免疫激活检测的各转染管中加入50、25或75 µl DMEM。进行病毒生产检测时，在下一步操作前将细胞和已配制的转染管转移至生物安全三级（BSL3）实验室。
  5. 依次向各转染管中加入2 µl转染试剂，室温孵育15至20分钟，使转染复合物形成。具体使用的转染试剂参见材料表。
  6. 将每根微量离心管中的全部转染混合液逐滴加入对应细胞培养板的孔中。轻轻摇匀后，在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
  7. 在细胞培养板中检测HIV-1的产生（第2节）、细胞活力（第3节）和免疫激活情况（第4节）（图2C）。

2. 病毒产生检测

  1. 从培养箱中取出24孔细胞培养板，在BSL3细胞培养罩内轻轻摇晃。从每个孔中转移150 µl上清液至96孔平底板的对应孔中，用于定量HIV-1的产生。
    注意：常用的病毒定量方法包括通过酶联免疫吸附测定（ELISA）20检测HIV-1衣壳蛋白（p24）的表达、通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）21定量病毒RNA，以及检测HIV-1逆转录酶（RT）的活性。步骤2.2至2.5描述了定量HIV-1 RT活性的方法13,15,16。
  2. 将5 µl上清液转移至含有25 µl病毒裂解液15（表1）的96孔板对应孔中。室温孵育5分钟，然后将板转移至放射性工作站。
    注意：仅当BSL3实验室中无放射性工作站时，才需要执行步骤2.2。如果无需将板移出BSL3实验室，则直接进行步骤2.3，并用50 µl放射性/病毒裂解液（表1）替代25 µl放射性裂解液。
  3. 配制放射性反应液15（表1），并向每孔病毒上清液与裂解液混合物中加入25 µl。将板在37 °C孵育2小时。
  4. 取5 µl反应混合物点样于二乙氨基乙基（DEAE）玻璃纤维滤膜纸的对应方格中，静置干燥10分钟。点样时每隔一个方格点一次，确保任意两个样本之间不直接相邻。这有助于在步骤2.6测定每分钟计数（cpm）时避免样本间的交叉干扰。
  5. 用2倍浓度的柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液（表1）洗涤滤膜纸5次，每次5分钟，随后用95%乙醇洗涤2次，每次1分钟。让滤膜纸自然干燥，并将其密封于样品袋中。
  6. 将装有滤膜纸的样品袋固定在样品盒中，插入微孔板闪烁计数器。将计数器设置为检测32P的每分钟计数（cpm），并输入实验中所用[32P]dTTP批次的参考日期。根据板图选择需读取的样品，启动计数器。
  7. 对于任何病毒定量方法，将每个测试RNA所得数值除以其相邻的阴性对照值，再将结果乘以100，即可得到各测试RNA重复样本对HIV-1产生的抑制百分比。不同浓度下不同测试RNA的比较结果示例见图3。

3. 细胞活力检测

  1. 从培养箱中取出96孔板，向每孔加入20 µl用Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释的5 mg/ml MTT（3-[4,5-二甲基-2-噻唑基]-2,5-二苯基-2H-四氮唑溴盐）。于37 °C孵育3小时。
  2. 向每孔加入150 µl含去污剂的酸性异丙醇溶液（含1% NP-40和4 mM HCl的异丙醇），于室温孵育2小时。
  3. 使用微孔板分光光度计测定570 nm处的吸光度。
  4. 通过将每个阳性对照和待测RNA样品的测定值除以其相邻转染对照的值，计算相对MTT代谢率。不同待测RNA与阳性对照的比较结果示例见图4。

4. 免疫激活检测

  1. 从培养箱中取出12孔板，吸除培养基。用DPBS轻轻洗涤细胞两次，每孔加入70 µl冷裂解缓冲液22（包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂，表1）。将板置于冰上孵育10分钟。
  2. 将细胞裂解物转移至微量离心管中，通过将管子浸入液氮中快速冷冻。待样品完全解冻后，重复冻融循环2次，共进行3次冻融循环。
  3. 在4 °C、15,700 × g条件下离心裂解物15分钟，以沉淀细胞碎片。将上清液转移至新的微量离心管中，使用考马斯亮蓝（Bradford）法23,24测定蛋白浓度。
  4. 取每个样品75 µg蛋白，在10%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，并如前所述将蛋白转移至硝酸纤维素膜25,26。
  5. 电泳完成后并转移至膜上，将膜在Ponceau S染色液（表1）中孵育1分钟以显色蛋白条带，随后用双蒸水洗涤。利用可见的蛋白条带和蛋白分子量标记作为参考，在80 kDa和55 kDa处裁剪膜。
    注意：在步骤4.4中，样品可在16 × 18 cm2的凝胶上电泳至34 kDa，便于在指定位置裁剪膜而不切断目标蛋白条带。或者，也可使用多个相同样品的凝胶以避免裁剪膜。
  6. 用含0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST，表1）洗去Ponceau S染色。加入含5%脱脂奶粉的TBST完全覆盖膜，室温下振荡孵育1小时。
  7. 将膜在含3%牛血清白蛋白（BSA）的TBST中与一抗抗体共同孵育过夜（O/N），一抗稀释比例为1:1,000，分别针对ADAR1（110和150 kDa）、磷酸化PKR（62 kDa）和磷酸化IRF3（47 kDa），对应膜的上、中、下三部分。
  8. 用TBST洗涤膜5次，每次5分钟，然后在含5%脱脂奶粉的TBST中加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（稀释比例为1:5,000），室温孵育1小时。
  9. 用TBST洗涤膜5次，每次5分钟，随后加入化学发光（ECL）检测试剂，按照制造商说明在X光片上显影蛋白条带。
  10. 在X光片上观察到蛋白条带后，用抗体 stripping 溶液对膜的中、下部分各洗涤10分钟。随后将膜在含3% BSA的TBST中与一抗抗体过夜（O/N）孵育，一抗分别为总PKR抗体（稀释比例1:500）和IRF3抗体（稀释比例1:1,000），分别对应膜的中、下部分。重复步骤4.8和4.9，针对PKR膜（中部）使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗替代抗兔二抗。
  11. 用TBST洗涤膜的下部5次，每次5分钟，然后在含3% BSA的TBST中加入抗肌动蛋白（actin）抗体（稀释比例1:5,000），室温孵育1小时。重复步骤4.8和4.9，使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗替代抗兔二抗。不同测试RNA与阳性对照的实验结果示例见图5。具体所用抗体详见材料表。

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结果

实验流程的总体示意图见图2，其中图2B提供了针对三种测试RNA和一种对照RNA的转染方案示例。在进行病毒产生和细胞活力检测时，每种测试载体的结果均相对于阴性对照进行归一化处理。重复实验以组为单位进行转染，使得每种测试RNA均以其相邻的阴性对照为基准进行归一化。这样做是为了避免因复合物形成与转染之间的时间差异而导致的数据偏差，例如若所有阴性对照先被转染就可能产生此类偏差。由于HIV-1可能影响免疫反应27,28，在进行细胞活力和免疫激活检测时，不加入表达HIV-1的质粒。

为了确定靶向HIV-1 RNA中保守位点（HIV-1 NL4-3株，位置1498-1519）的RNA干扰分子的最佳长度13，设计了一组siRNA（图3A）。利用HIV-1产生检测法，计算了共转染不同量待测siRNA与100 ng表达HIV-1...

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讨论

所述的 HIV-1 产生检测使用 HEK293T 细胞（图 2）进行，类似于用于筛选有效核酶13、shRNA10,29、siRNA30 和 U1i RNA11,31 靶位点的 HIV-1 RNA 检测方法。大多数研究采用不同的方法定量 HIV-1 产生量，通常在将 HIV-1 表达质粒与候选 RNA 共转染后 48 小时测量病毒产量。HIV-1 产生后，未成熟的病毒颗粒通过 HIV-1 蛋白酶对其多蛋白进行蛋白水解切割，转变为具有感染新细胞能力的成熟病毒颗粒。在步骤 2.2 至 2.5 所述的 HIV-1 逆转录酶（RT）活性检测中，同时评估了病毒的产生和成熟过程，因为 RT 酶仅在成熟病毒颗粒中具有活性。相比之下，衣壳蛋白和病毒 RNA 可能同时存在于成熟和未成熟的病毒颗粒中。因此，通过 p24 ELISA 或 RT-PCR 定量 HIV-1 产生量可能会遗漏作用于 HIV-1 复制周期成熟阶段的治疗性 RNA 的效应，例如定位于 HIV-1 病毒颗粒的核酶32，以及除抑制 HIV-1 蛋白表...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作由加拿大卫生研究院（CIHR）资助（资助号 DCB-120266、PPP-133377 和 HBF-348967，授予 A.G.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
青霉素/链霉素 GibcoThermo Fisher15140-122
细胞培养板，96 孔、24 孔、6 孔Corning353075, 353047, 353043
微量离心管 AxygenCorning311-08-051
低分子量 Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01合成 RNA 转染试剂
TransIT-LT1MirusMIR 2300RNA 表达质粒转染试剂
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA 模板 Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA 引物Thermo Fisher18418-012
DEAE 滤膜纸 Perkin Elmer1450-522
微孔板闪烁计数器Perkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
微孔板分光光度计Bio-rad1706930
裂解缓冲液片剂Roche4693159001, 4906837001蛋白酶和磷酸酶抑制剂
微量离心机Eppendorf5415R
Bradford 试剂Bio-rad500-0006
凝胶电泳槽HoeferSE600
半干式转膜仪Bio-rad1703940
蛋白分子量标准 EZ-RunThermo FisherBP3603-500
硝酸纤维素膜Bio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
抗体 stripping 溶液Millipore2504
ECL - PierceThermo Fisher PI32106
ADAR1 抗体来自 Dr. B.L. Bass
磷酸化-T446-PKR 抗体Abcamab32036
磷酸化-S396-IRF3 抗体Cell Signaling4947
PKR 抗体来自 Dr. A. Hovanessian
IRF3 抗体Cell Signaling11904
肌动蛋白抗体MilliporeMAB1501
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体KPL474-1506
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体KPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5

参考文献

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HIV-1 RNA 靶向RNA 疗效检测RNA 毒性筛选瞬时转染实验病毒生成检测细胞活力检测免疫激活检测核酶优化shRNA siRNA 设计BSL-3 实验室操作规程
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