对于检测到的敏感性和特异性显色琼脂培养基发展副溶血性弧菌及其他弧菌物种

Summary

检测和分离临床相关的弧菌种类需要选择性和差异性培养基。本研究评估了一种新的显色培养基检测和鉴定副溶血性弧菌和其他相关物种的能力。发现新培养基比传统培养基具有更好的敏感性和特异性。

Abstract

造成弧菌美国食源性感染呈上升趋势。在弧菌属，副溶血性弧菌是负责为广大弧菌机相关感染。因此， 弧菌之间的辨证准确。和检测五 。 副溶血性弧菌是非常重要的，以确保食品供应的安全。虽然分子技术也越来越普遍，这取决于培养的方法仍然经常做，他们被认为在某些情况下的标准方法。因此，一种新的生色琼脂培养基用提供用于隔离和临床相关弧菌的分化更好方法的目标测试。该协议相比，检测V的敏感性，特异性和检测限新的显色培养基和传统媒体之间溶血性弧菌 。 五，各副溶血性弧菌菌株（N = 22），重呈现多样化的血清型和起源的源头中使用。他们以前由食品和药物管理局（FDA）和美国疾病控制和预防中心（CDC）鉴定，并通过TLH -PCR在我们的实验室中进一步验证。在至少四个独立的试验中，这些菌株在35-37℃下接种在显色琼脂和硫代 - 柠檬酸盐 - 胆盐 - 蔗糖（TCBS）琼脂，它是用于培养该种类推荐的培养基，然后孵育24 -96小时。三V.溶血性弧菌菌株（13.6％）未对TCBS最优生长，然而表现出绿色菌落是否有增长。两种菌株（9.1％）没有取得对生色琼脂预期青色菌落。 五，非溶血性弧菌菌株（32）也被测试，以确定显色琼脂的特异性。在这些菌株，31没有增长或者表现出其他菌落形态。 五的平均回收率副溶血性弧菌在chromoge网卡琼脂为〜相对于补充有2％的NaCl的胰蛋白酶大豆琼脂96.4％。最后，新的生色琼脂是检测V.有效介质副溶血性弧菌和其他弧菌区别开来。

Introduction

作为弧菌属，V的构件副溶血是革兰氏阴性，非孢子形成，弯曲的，棒状细菌。它显示出在液体和半固体环境中的高运动性。 五大部分溶血性弧菌菌株是非致病对人类，但致病亚型在许多国家^1,2-引起流行和大流行，因此这种被认为是一个重要的食源性病原体。 弧菌感染在美国的发病率自2000年³已经显示出上升的趋势，其中弧菌属，V.副溶血是报道最频繁的物种引起的疾病，在美国^4,5。其他临床相关品种包括V.溶藻弧菌 ，V.创伤弧菌 ，V.霍乱 等疾病的一小部分是由多个物种同时引起的。

副溶血性弧菌是一种自然的我海洋水nhabitant，因此广泛分布于世界各地的海洋水域，包括河口。该品种于1950年发现了以下食物中毒在日本爆发。在美国，该物种首次在海水，沉积物和贝类在普吉特海湾地区^6,7隔离。在海洋生物栖息地，如双壳贝类滤食动物，能够携带V.副溶血性弧菌作为他们的自然菌群⁸的一部分。正因为如此， 五在人类溶血性弧菌感染往往与受污染的海鲜，尤其是生的或未煮熟的贝类的消耗。当开放伤口暴露于海水，导致皮肤发生感染进....

Protocol

1.媒体和微生物菌种培养

注:在所有实验使用无菌技术。使用无菌材料。消毒使用前所有容器，工具和试剂。高压灭菌所有废旧物资处置前，因为它们被认为是生物危害。高压釜的温度和时间的组合是≥121℃的点¯x≥15分钟所有的以下过程。

1. 让〜1-L中的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）中，首先在含有磁性搅拌棒的2-L的锥形瓶中加1升去离子水。使用的烧瓶中，比最终体积大至少两次。添加30克胰蛋白酶大豆肉汤粉末和20g琼脂颗粒到烧瓶中。
   注:使用2％琼脂，而不是1.5％，限制某些弧菌的蜂拥。
   1. 通过接通搅拌器充分混合。在搅拌的同时，打开加热煮沸混合物。一旦除去来自加热器的烧瓶作为混合物开始沸腾。轻轻盖次Ë量瓶中，用锡箔。大盘箔釜前将其固定到烧瓶中。
   2. 为了使胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中，从配方省略琼脂在步骤1.1。
      注意:可以用，而不是锥形瓶中瓶。
   3. 使补充有2％氯化钠或氯化钠（旅游业附属帐户）胰蛋白酶大豆琼脂，在该混合物搅拌和加热之前加入20克氯化钠。使补充有2％的NaCl（TSB）的胰蛋白酶大豆肉汤，省略琼脂，在该混合物搅拌和加热之前加入20克氯化钠。
2. 使脑心脏浸液（BHI）琼脂，暂停37克BHI粉末并在1L的精制水琼脂15克颗粒。热火频繁搅拌溶解粉末。高压灭菌。省略了琼脂，使BHI肉汤。
3. 使TCBS琼脂，暂停89克的TCBS粉末在1L纯净水....

Results

在这项研究中，54的微生物菌株被组装，其中包括五内22株副溶血弧菌种，其他19 弧菌和13非弧菌种（ 表1）。 五大部分副溶血性弧菌菌株无论是从FDA，CDC或其他国家卫生部门接收。他们代表不同的血清型和孤立的来源。这些菌株以前由监管机构标识。我们进一步确认了这些五的身份通过进行TLH-PCR ^21,22 溶血性弧菌 。

种类

株的测试号

生长和菌落.......

Discussion

本研究着重于文化传媒开发和评估。按照惯例，TCBS是选择性和鉴别培养基用于分离和检测V.副溶血性弧菌，霍乱弧菌和V.创伤弧菌 ^12。然而，限制已报道这个介质，例如无法区分V.从霍乱 弧菌等品种。蔗糖和pH指示剂是TCBS的分化剂。因此，产酸由蔗糖发酵导致介质的颜色变化。介质的着色是TCBS的一个缺点，因为它可能会掩盖菌落形态的观察。新开发的显色培养基采用高pH值和盐度抑制许多海洋样品中发现的非弧菌的生长。新的显色培养基具有8.6±0.2的最终pH值。每升去离子水，它由将10克蛋白胨，10克海盐混合物，10克牛胆汁，10克硫酸钠硫代，5克酵母提取物，5克的柠檬酸钠，2.2克碳酸钠，2克乳糖，0.5g的丙酮酸钠，0.3g的生色组合和15g琼脂。发色搭配让弧菌之间的分化。根据自己的不同的能力产生一定的酶。代替改变TCBS琼脂培养基，不同弧菌的颜色。将呈现新的显色培养基上菌落不同的颜色。相比之下，可商购的色培养基含有琼脂15克的，将8g蛋白胨和酵母提取物，51.4克盐，0.3g的生.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂/设备
琼脂	Fisher Scientific	DF0140-15-4	可使用其他品牌
高压灭菌	器 任何
BHI粉末	Fisher Scientific	DF0418-17-7	可使用其他品牌
混合			牡蛎肉
CampyGen 气体发生器	Hardy Diagnostics	CN035A	提供微需氧气氛;可使用其他品牌
巧克力琼脂板	Hardy Diagnostics	E14	可使用其他品牌
常用 PCR 试剂（dNTP、MgCl2、Taq聚合酶）	任何		或使用 PCR 珠 （Fisher Sci 46-001-014）
培养管	Fisher Scientific	S50712	可能使用其他品牌
Eppendorf 管	Fisher Scientific	S348903	可能使用其他品牌
凝胶文档	任何
HardyChrom 弧菌琼脂板	Hardy Diagnostics	G319	本研究评估这种培养基
培养箱	任何
接种环	Fisher Scientific	22-363-606	本研究中使用了 10 微升大小
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212	可以使用其他品牌
的牡蛎	任何
PBS	Fisher Scientific	R23701	可以使用其他品牌
皿	Fisher Scientific	FB0875713	可以使用其他品牌
移液器和吸头	任何		消毒过的吸头
tlh	IDT DNA
	可以使用任何
铺展器	Fisher Scientific	08-100-11	珠子代替
Stomacher 搅拌机	Stomacher	400	样品以 200 rpm 匀浆 30 秒。可以使用其他均质器。
用于搅拌机的无菌过滤袋	Fisher Scientific	01-812-5
TCBS 粉末	Hardy Diagnostics	265020	本研究评估了这种介质
热循环仪	任何
TSB 粉末	Fisher Scientific	DF0370-07-5	可能使用其他品牌
紫外线观察柜	任何		发射长波紫外线
水浴	Any
名称	>来源	目录号	评论
>细菌种类和菌株
嗜水气单胞菌	ATCC
em>白色念珠菌	ATCC
空肠弯曲杆菌	ATCC
大肠杆菌	ATCC
em>奇异变形杆菌	ATCC
铜绿假单胞菌	ATCC
金黄色葡萄球菌	ATCC
<>沙门氏菌 Choleraesuis	ATCC
em>Shigella boydii	ATCC
em> flexneri	ATCCem
<>Shigella sonnei	ATCC
溶藻弧菌	ATCC
V. cholerae（血清型包括 O139、O1， non O1、El Tor 生物型）	FDA、ATCC
em>V. damsela	FDA
V. fisheri	Environment
V. fluvialis	CDC
em>V. furnissii	CDC
em>V. hollisae	FDA
V. metschnikovii	ATCC
V. mimicus	>FDA
V. 副溶血性（血清型包括 O3：K6、O1：K56、O4：K8、O5：K15、O8、等）	ATCC、 FDA 美国疾病控制与预防中心， Environment
V. proteolyticus	FDA
V. vulnificus	FDA