检测和分离具有临床意义的Vibrio菌种需要使用选择性和鉴别性培养基。本研究评估了一种新型显色培养基在检测和鉴定V. parahaemolyticus及其他相关菌种方面的能力。结果表明，该新型培养基比传统培养基具有更高的敏感性和特异性。
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摘要
摘要
由食源性感染在美国引起的 弧菌 物种数量呈现上升趋势。在该属中 副溶血性弧菌，V. parahaemolyticus 负责大部分 弧菌属相关感染。因此，准确区分三者至关重要 弧菌属 物种和检测 副溶血性弧菌 对于确保食品安全至关重要。尽管分子检测技术日益普及，依赖培养的方法仍在常规使用，并在某些情况下被视为标准方法。因此，本研究测试了一种新型显色琼脂培养基，旨在提供一种更优的方法，用于分离和鉴别具有临床意义的微生物 弧菌 spp. 该方案比较了检测的灵敏度、特异性和检测限 副溶血性弧菌 新型显色培养基与传统培养基之间的比较。多种 副溶血性弧菌 菌株（n=22) 代表不同血清型和来源的菌株被使用。这些菌株先前由美国食品药品监督管理局（FDA）和疾病控制与预防中心（CDC）鉴定，并在我们的实验室中进一步验证 tlh-PCR。在至少四次独立实验中，将这些菌株分别接种于显色琼脂和硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂，后者是培养该物种推荐使用的培养基，随后在35–37 °C下培养24–96小时。三 副溶血性弧菌 菌株（13.6%）在TCBS培养基上未能最佳生长，但若生长则呈现绿色菌落。两株菌（9.1%）在显色琼脂上未产生预期的青色菌落。非副溶血性弧菌 菌株（n=32）也被用于检测显色琼脂的特异性。在这些菌株中，有31株未生长或表现出其他菌落形态。平均回收率 副溶血性弧菌 在显色琼脂上的相对计数约为添加2% NaCl的胰蛋白胨大豆琼脂的96.4%。综上所述，这种新型显色琼脂是一种有效的检测培养基 副溶血性弧菌 并将其与其他弧菌区分开来。
引言
作为该组织的一员 弧菌 属， 副溶血性弧菌 是一种革兰氏阴性、不形成芽孢、呈弯曲杆状的细菌。在液体和半固体环境中均表现出高度运动性。大多数 副溶血性弧菌 菌株对人类无致病性，但致病亚型曾引发流行病和大流行，因此该物种在许多国家被视为重要的食源性病原体1,2发病率 弧菌 自2000年以来，美国的感染率呈上升趋势3. 在……之中 弧菌 sp.（复数：spp.） 副溶血性弧菌 是美国报告引起疾病最频繁的物种4,5其他具有临床意义的物种包括 V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, 等等。 少数疾病由多种物种同时引起。
副溶血性弧菌 是海洋水体中的天然栖居物种，因此广泛分布于全球各地的海洋水域，包括河口地区。该物种于1950年因日本发生一起食物中毒暴发事件而被发现。在美国，该物种首次从普吉特湾地区的海水、沉积物及贝类中分离获得。6,7海洋栖息地中的滤食性生物，例如双壳类贝类，可能携带 副溶血性弧菌 作为其正常菌群的一部分8因此， 副溶血性弧菌 人类感染通常与食用受污染的海产品有关，尤其是生的或未煮....
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方案
1. 微生物菌株的培养基与培养
注意：所有实验均需使用无菌技术。使用无菌材料。使用前对所有容器、工具和试剂进行灭菌。由于被视为生物危害物，所有废弃材料在丢弃前必须经高压灭菌处理。以下所有操作的高压灭菌温度和时间组合为 ≥121 °C × ≥15 min。
- 配制约1升胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），首先将1升去离子水加入含有磁力搅拌子的2升锥形瓶中。所用锥形瓶的容积应至少为最终体积的两倍。向瓶中加入30 g胰蛋白胨大豆肉汤粉末和20 g琼脂颗粒。
注意：使用 2% 琼脂代替 1.5% 琼脂，以限制某些菌株的游走生长 弧菌 种（spp.）- 开启搅拌器，充分混匀。在搅拌的同时，开启加热使混合物沸腾。一旦混合物开始沸腾，立即将烧瓶从加热器上取下。用锡箔纸 loosely 覆盖烧瓶，用胶带将箔纸固定在烧瓶上，再进行高压灭菌。
- 配制胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）时，省略步骤1.1配方中的琼脂。
注：可使用瓶子代替锥形瓶。 - 在制备添加2%氯化钠（NaCl）的胰蛋白胨大豆琼脂（TSAS）时，于搅拌和加热前在混合物中加入20 g NaCl。在制备添加2% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤（TSBS）时，省略琼脂成分，并于搅拌和加热前在混合物中加入20 g NaCl。
- 制备脑心浸液（BHI）琼脂时，将37 g BHI粉末和15 g琼....
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结果
本研究收集了54株微生物菌株，其中包括22株属于 副溶血性弧菌 物种，19 其他 弧菌 物种，以及13种非弧菌 物种（表1）。大多数 V. parahaemolyticus 菌株来自美国食品药品监督管理局（FDA）、疾病控制与预防中心（CDC）或其他州卫生部门，代表了多种血清型和分离来源。这些菌株此前已由监管机构鉴定确认，我们进一步验证了这些菌株的鉴定结果 副溶血性弧菌 通过进行 tlh-PCR21,22.
.......| 物种 | 测试菌株数量 |
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讨论
本研究聚焦于培养基的开发与评估。传统上，TCBS 是用于分离和检测的选用性和鉴别性培养基 副溶血性弧菌，霍乱弧菌 和 V. vulnificus12然而，已有研究报道了该培养基存在一些局限性，例如无法实现分化 V. cholerae 来自其他 弧菌属 物种。蔗糖和pH指示剂是TCBS中的鉴别成分。因此，能够发酵蔗糖的菌株产酸，导致培养基颜色改变。培养基的着色是TCBS的一个缺点，因为它可能妨碍对菌落形态的观察。新开发的显色培养基利用高pH和高盐浓度抑制非目标菌的生长弧菌 在许多海洋样本中发现的物种。该新型显色培养基的最终 pH 值为 8.6±0.2。每升去离子水中含有蛋白胨 10 g、海盐混合物 10 g、牛胆汁 10 g、硫代硫酸钠 10 g、酵母提取物 5 g、柠檬酸钠 5 g、碳酸钠 2.2 g、乳糖 2 g、丙酮酸钠 0.5 g、显色混合物 0.3 g 以及琼脂 15 g。该显色混合物可实现不同菌种间的区分 弧菌属 spp. 根据其产生特定酶的能力差异进行区分。与改变TCBS琼脂培养基颜色不同，不同的.......
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披露
部分培养基由加利福尼亚州圣玛丽亚的Hardy Diagnostics慷慨提供。Thorsen在加利福尼亚州立理工大学就读期间开展了本研究。他目前是Hardy Diagnostics的员工。
致谢
感谢 M. Channey、E. Chau 和 K. Tomas 在本项目中的协助。项目经费部分由加州理工州立大学资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/设备 | |||
| 琼脂 | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | 可使用其他品牌 |
| 高压灭菌器 | 任意 | ||
| BHI 粉末 | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | 可使用其他品牌 |
| 搅拌器 | 任意 | 用于搅碎牡蛎肉 | |
| CampyGen 气体发生器 | Hardy Diagnostics | CN035A | 用于提供微需氧环境；可使用其他品牌 |
| 巧克力琼脂平板 | Hardy Diagnostics | E14 | 可使用其他品牌 |
| 常规 PCR 试剂（dNTPs、MgCl2、Taq 聚合酶） | 任意 | 或使用 PCR 微珠（Fisher Sci 46-001-014） | |
| 培养管 | Fisher Scientific | S50712 | 可使用其他品牌 |
| Eppendorf 管 | Fisher Scientific | S348903 | 可使用其他品牌 |
| 凝胶成像系统 | 任意 | ||
| HardyChrom 弧菌琼脂平板 | Hardy Diagnostics | G319 | 本研究评估该培养基 |
| 培养箱 | 任意 | ||
| 接种环 | Fisher Scientific | 22-363-606 | 本研究使用 10 微升规格 |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | 可使用其他品牌 |
| 牡蛎 | 任意 | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | 可使用其他品牌 |
| 培养皿 | Fisher Scientific | FB0875713 | 可使用其他品牌 |
| 移液器及吸头 | 任意 | 需使用灭菌吸头 | |
| tlh 引物 | IDT DNA | ||
| 天平 | 任意 | ||
| 涂布棒 | Fisher Scientific | 08-100-11 | 可改用玻璃珠代替 |
| Stomacher 搅拌器 | Stomacher | 400 | 样品以 200 rpm 匀浆 30 秒。 可使用其他匀浆设备。 |
| 搅拌器用无菌滤袋 | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS 粉末 | Hardy Diagnostics | 265020 | 本研究评估该培养基 |
| PCR 仪 | 任意 | ||
| TSB 粉末 | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | 可使用其他品牌 |
| 紫外观察柜 | 任意 | 发射长波紫外光 | |
| 水浴锅 | 任意 | | |
| 名称 | 来源 | 目录编号 | 备注 |
| 细菌种类与菌株 | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae（血清型包括 O139、O1、非 O1、El Tor 生物型） | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisheri | 环境来源 | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus（血清型包括 O3:K6、O1:K56、O4:K8、O5:K15、O8、等） | ATCC, FDA, CDC, 环境来源 | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
参考文献
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections.
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