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方法文章

离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的测定方法

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DOI：

10.3791/54497

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2016年9月28日

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1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

本文内容

摘要

以下方案描述了用于定量测定离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的缓冲液的配制与使用方法。同时讨论了样品分析和数据解读所采用的方法。

摘要

哺乳动物心脏是ATP的主要消耗器官，需要持续供应能量底物以维持收缩功能。因此，心肌代谢的改变与收缩功能障碍及心力衰竭的发生密切相关也就不足为奇。揭示代谢与收缩功能之间的关联，将有助于阐明心脏在疾病状态下适应性或失代偿性变化的部分机制。离体工作大鼠心脏制备技术可用于实时、同步监测心脏收缩功能以及能量底物进入氧化代谢途径的流量。本实验方案旨在详细描述用于制备和使用缓冲液的方法，以定量测定葡萄糖和脂肪酸（心脏主要能量底物）的氧化速率。同时讨论了样品分析与数据解读所采用的方法。简而言之，该技术基于向心脏灌注 14C-放射性标记的葡萄糖和一种 3H-放射性标记的长链脂肪酸 离体 通过常温晶体液灌注维持跳动的心脏。 14CO2 和 3H2O，这些供能底物在酶促反应中产生的终末产物，随后从冠状窦流出液中被定量回收。结合所用放射性标记底物的比活性数据，即可分别定量测定葡萄糖和脂肪酸在氧化途径中的通量。利用适当的记录设备，可同时测定离体心脏的收缩功能，并将其直接与代谢通量数值进行关联分析。该技术对于研究在不同应激条件下（如前负荷和后负荷改变、缺血、药物或循环因子作用）或基因产物表达改变后，代谢与收缩功能之间的关系极为有用。

引言

临床相关性

在哺乳动物心脏中，氧化代谢途径中的底物通量、ATP生成与心脏做功之间存在显著的正相关关系1。在过去二十年中，对心脏代谢与功能之间复杂联系的研究表明，在不同类型的心脏疾病背景下，心脏代谢的改变是导致收缩功能障碍以及可能引发病理性结构重塑的原因2-4。因此，深入理解应激心脏代谢重构的调控机制，有望发现用于预防或治疗心力衰竭的治疗靶点5-7。美国心脏协会近期发布的关于"评估心脏代谢"的科学声明，凸显了科学界对该研究领域日益增长的关注8。尽管心脏成像技术的进步现已能够快速、准确地评估心脏形态与功能，但心脏代谢的体内研究仍受限且操作繁琐：核磁共振（NMR）波谱技术和正电子发射断层扫描（PET）成像可用于监测心脏高能磷酸盐代谢及三羧酸循环活性，但这些技术存在运行成本高昂、且无法在稳态条件下确定不同底物对氧化代谢贡献程度的局限性9。迄今为止，离体工作心脏模型仍是唯一可同时实时研究收缩功能与底物进入氧化代谢途径通量的技术7,9。以下实验方案旨在为制备和使用试剂提供指导，以测定离体工作大鼠心脏中底物利用速率。

离体工作大鼠心脏装置

尽管该技术已有近半个世纪的历史，离体工作大鼠心脏制备法仍然是心血管研究中的首选方法之一。与朗根多夫（Langendorff）心脏制备法类似，工作状态下的啮齿类动物心脏提供了一种相对简单、可靠且经济的方法，可在排除其他器官、神经激素及其他循环因子干扰的情况下，独立测定多种心脏参数。但与朗根多夫灌注心脏不同的是，工作心脏能够持续进行接近生理状态的心脏做功，这是产生与生理相关水平的氧化代谢通量的前提条件 体内 条件。通过将灌注缓冲液经连接左心房的插管输送至左心室（LV），当左心室充盈并收缩时，缓冲液在设定的后负荷静水压阻力下经主动脉导管射出。该灌注装置的设计最初由 Neely 及其同事描述10 随后由 Taegtmeyer、Hems 和 Krebs 进行了改进11，但自此之后几乎没有改变。根据原始装置的描述，可通过测定心输出量来评估心脏的收缩功能，仅需使用量筒和秒表即可测量主动脉和冠状动脉的血流。10,11目前，多家供应商提供完整的啮齿类动物心脏灌注系统。这些市售设备可配备流量探头、压力传感器、压力-容积导管，以及用于心脏功能数据采集与分析所需的所有仪器。供应商还提供详尽的文档资料和培训课程，帮助新用户熟悉其设备操作。此外，多篇综述文章也详细介绍了啮齿类动物工作心脏装置的实验方案，以及使用导管测量心脏功能的技术方法。12-15因此，我们仅简要提及灌流装置和记录设备的设置。本方案的主要目的是补充现有信息，描述可同时测定葡萄糖和长链脂肪酸氧化速率的方法，这两种底物是正常心脏中主要的能量来源。本文详细介绍了使用放射性标记能量底物评估心肌氧化代谢的全部步骤，包括试剂和缓冲液的配制、样品的收集与处理，以及数据分析。

方法原理

心肌细胞通过脂肪酸（主要是长链脂肪酸）和碳水化合物（葡萄糖和乳酸）的氧化磷酸化产生收缩所需的大部分能量。心脏的能量储备非常有限，依赖于血液循环持续供应这些能量底物。葡萄糖通过糖酵解途径分解产生丙酮酸，后者由线粒体内膜上的丙酮酸脱氢酶复合体进行脱羧反应。长链脂肪酸从循环中的白蛋白或脂蛋白甘油三酯中释放后，首先在细胞质中被活化为酰基辅酶A（acyl-CoA）分子，随后通过肉碱穿梭系统转运至线粒体基质，进入β-氧化途径。葡萄糖和脂肪酸分解产生的乙酰辅酶A（acetyl-CoA）分子进入三羧酸循环（Krebs循环），生成还原当量（NADH和FADH2），后者通过电子传递链在线粒体内膜上建立质子驱动力，并由ATP合酶催化生成ATP。三羧酸循环中酶促反应的最终副产物为水和二氧化碳。向离体工作心脏灌注14C和3H放射性标记的底物（如14C标记的葡萄糖和3H标记的油酸），将相应产生14CO2和3H2O，这些产物可从冠状静脉流出液中定量回收。通过将离体灌流心脏置于密闭腔室中，并在冠状静脉流出液离开心脏后立即收集，即可实现14CO2的收集。使用小型阴离子交换柱可从冠状静脉流出液中分离并回收3H2O。处理后的样品放射性通过液体闪烁计数器测定，结合所用放射性标记底物的比放射性，即可分别定量测定葡萄糖和脂肪酸在氧化途径中的代谢通量16,17。

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方案

注意：所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）《公共卫生服务动物照护与使用政策》进行，并经密西西比大学医学中心机构动物照护与使用委员会批准。涉及放射性同位素使用的各项操作均经密西西比大学医学中心辐射安全办公室批准，并严格遵循其规定执行。

1. 储存用缓冲液和试剂的制备

  1. Krebs-Henseleit (KH) 缓冲液储备溶液
    1. 配制 2 L 的 20 倍浓缩盐储备液，其成分（单位：mol/L）为：2.37 NaCl、0.0948 KCl、0.0236 KH2PO4 和 0.0236 MgSO4·7H2O。使用孔径为 0.45 µm 的滤器过滤，并在室温下保存，最长可保存 1 个月。
    2. 配制 2 L 的 20 倍浓缩（0.5 mol/L）NaHCO3 溶液。该溶液可在室温下长期保存。
    3. 配制 250 ml 的 1 mol/L CaCl2 储备液。使用孔径为 0.45 µm 的滤器过滤，并在室温下保存，最长可保存 1 个月。
  2. 将阴离子交换树脂从氯化物形式转化为氢氧化物形式
    1. 通过将树脂重悬于 1 L 超纯水中进行洗涤。待树脂沉降后，倾去上清液。重复此步骤 4 次。
    2. 将树脂倒入安装在抽滤瓶上的玻璃微量分析真空过滤器中。
    3. 缓慢通过 22 倍体积的 1 N NaOH，将树脂转化为氢氧化物形式。间歇性地使用不锈钢刮刀搅拌树脂浆液。
    4. 用超纯水洗涤树脂，直至 pH 值降至 9.0 以下。定期将 pH 试纸浸入树脂浆液表面附近检测 pH 值。将树脂用超纯水覆盖后储存于硼硅酸盐玻璃瓶中，并避光保存。使用前切勿让树脂干燥。
      注：若妥善保存，树脂可至少使用 3 个月。
  3. 油酸-白蛋白 8 倍浓缩储备液
    1. 在 4 L 锥形瓶中，将 200 ml 的 20 倍浓缩盐储备液和 200 ml 的 20 倍浓缩 NaHCO3 溶液与 3.6 L 超纯水混合。
    2. 使用带有烧结圆筒的气体分散管，以含 5% 二氧化碳和 95% 氧气的混合气体通气 15 分钟，以稳定溶液 pH 值。
    3. 将 470 ml 缓冲液倒入 1 L 玻璃烧杯中。向剩余的 3530 ml 缓冲液（仍置于 4 L 锥形瓶中）加入 8.75 ml 的 1 mol/L CaCl2 储备液，并放置备用。
    4. 向 1 L 玻璃烧杯中加入 40 g 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA），并用磁力搅拌子搅拌至完全溶解。
    5. 在 15 ml 圆底离心管中，用超纯水配制 4 ml 的 50%（v:v）乙醇溶液。加入 487 mg 油酸钠，涡旋振荡至粉末完全溶解。
      注：部分研究人员在灌注缓冲液中使用棕榈酸代替油酸。棕榈酸-白蛋白储备液可按照相同步骤配制。但建议将溶液在 70 ºC 下加热，以实现棕榈酸钠的完全溶解。
    6. 在持续搅拌下，将油酸盐溶液逐滴加入无脂肪酸 BSA 溶液中，并继续搅拌 10 分钟，使油酸-BSA 复合物充分形成。
      注：溶液应呈淡黄色，且无可见颗粒。若出现沉淀或不溶性颗粒，可能表明脂肪酸与 BSA 结合不完全。若发生此情况，应弃去溶液并重新配制。
      注：棕榈酸盐若在移液管中静置会析出沉淀，无法逐滴加入。可将 BSA 溶液在 37 ºC 下加热以促进棕榈酸结合。但切勿过热，以免导致 BSA 变性或聚集。
      警告：本实验后续步骤涉及放射性物质操作。请穿戴适当的个人防护装备（PPE），并遵守机构辐射安全办公室制定的安全与废物处理规定。
    7. 向正在搅拌的油酸-BSA 溶液中加入 160 µl（0.8 mCi）[9,10-3H]油酸，并继续搅拌 10 分钟。
    8. 向正在搅拌的油酸-BSA 溶液中加入 2.5 ml 的 1 mol/L CaCl2 储备液。
    9. 截取约 1.2 m 长的透析膜管，用自来水彻底冲洗内外表面。在自来水下用力揉搓透析管 10 至 15 分钟，以去除膜表面的甘油涂层。或者，也可在使用前将透析管浸泡于温水中 1 小时以去除涂层。最后用超纯水冲洗透析管。
    10. 将透析管一端牢固扎紧。灌入油酸-BSA 溶液后，将另一端也扎紧。
    11. 将装有溶液的透析管放入盛有 KH 缓冲液的 4 L 锥形瓶中，在 4 ºC 下轻轻搅拌过夜进行透析。
    12. 次日，从透析管中取出 8 倍浓缩的油酸-BSA 溶液。立即用于灌注，或分装后于 -20 ºC 保存。冷冻分装样品至少可稳定保存 2 个月。避免反复冻融，以免影响油酸-BSA 复合物的溶解性。
      注：配制心脏灌注所用试剂和缓冲液时，必须使用超纯水（25 ºC 时电阻率 18.2 MΩ·cm，总有机碳 <10 ppb，微生物 ≤1 CFU/ml，粒径大于 0.22 µm 的颗粒 ≤1 个/ml）。可通过直接购买氢氧化物形式的阴离子交换树脂来避免转化步骤，但成本较高（参见 材料表）。除油酸或棕榈酸外，只要存在氚标记版本，其他任何天然存在的脂肪酸也可用于追踪其氧化过程。

2. 灌注缓冲液的制备

  1. 在 4 L 的锥形瓶中，将 200 ml 的 20 倍浓缩盐储备液与 200 ml 的 20 倍浓缩 NaHCO3 溶液混合，并加入 3.6 L 的超纯水。用含 5% 二氧化碳和 95% 氧气的混合气体通气 15 分钟，然后加入 10 ml 的 1 mol/L CaCl2 储备液，使游离 Ca2+ 浓度达到 2.5 mmol/L。
    注意：以下步骤涉及放射性物质的操作。请穿戴适当的个人防护装备，并遵守机构辐射安全办公室制定的安全和废物处理规定。
  2. 将 1.750 L KH 缓冲液转移至一个 2 L 的硼硅酸盐玻璃瓶中。加入 250 ml 的 8 倍浓缩油酸-BSA 溶液、1.802 g D-葡萄糖、400 µl 胰岛素（0.4 U/ml）以及 200 µl（0.2 mCi）[U-14C]葡萄糖。翻转瓶身以混匀。由此得到 2 L 完整的灌注缓冲液，其中含有油酸（0.4 mmol/L）、D-葡萄糖（5 mmol/L）和胰岛素（40 µU/ml）。
    备注：2 L 体积足以在非循环条件下灌注成年大鼠心脏至少 60 分钟。
  3. 取部分非放射性的 KH 缓冲液填充两个解剖皿，并置于冰上冷却。

3. 灌注装置的准备

注意：研究者可选择使用自行搭建的灌流装置（例如 Taegtmeyer、Hems 和 Krebs11 所描述的装置），或选用 commercially available 系统之一。灌流系统通常由下文图1所述的元件组成。除管路和玻璃器皿外，其余记录设备均为可选，其使用取决于研究者解答特定实验问题的需求。尽管如此，我们建议使用氧微电极来测定进入和流出冠状循环的缓冲液中的 O2 浓度（图1）。这有助于研究者确保心脏获得充足的氧气供应，并保证不同实验之间的氧气供给保持一致。此外，通过测定“动-静脉”氧差，可计算心肌耗氧量和心脏效率16,18。

  1. 打开循环水浴，设置温度为 37 ºC，以预热灌流装置。
  2. 打开计算机和用于测量心脏功能的数据采集系统。
  3. 连接记录设备（压力导管、压力-容积导管、氧微电极、流量计） 等等。) 连接到数据采集系统，并根据制造商的说明对仪器进行校准。
  4. 用超纯水填充缓冲液储液槽。打开蠕动泵，使水流经所有管路和玻璃器皿，以冲洗系统。关闭蠕动游戏副本，确保管路和/或玻璃器皿中无残留水分，以免影响灌注缓冲液的浓度及心脏标本的制备。
  5. 连接一个新的 1.0 µm 将玻璃纤维滤膜连接至系统。将含有5%二氧化碳和95%氧气混合气体的气瓶连接到氧合室。
    注意：以下步骤涉及放射性物质的操作。请穿戴适当的个人防护装备，并遵守机构辐射安全办公室制定的安全和废物处理规定。
  6. 用灌流缓冲液填充缓冲液储液槽。打开泵，确保所有管路和玻璃器皿均充满灌流缓冲液。将灌流装置设置为循环模式运行灌流缓冲液，并在使用前至少氧合30分钟。
  7. 在心脏腔室下方紧密连接一个20 ml注射器的管筒，以收集冠状静脉流出液。将该注射器的尖端连接至一个三通旋塞阀的顶部接口，侧臂连接一个3 ml注射器，底端接口通过管路连接至盛装液体放射性废物的容器。
    注意：使用脂肪酸-BSA复合物时，不能通过气体分散管直接通气来对灌注缓冲液进行氧合，因为这会导致溶液产生大量泡沫。应使用膜式氧合器（图1）或为此目的使用片流式氧合室。建议通过将氧微电极置于灌流回路中，以确认达到适当的氧合水平。 图1).

4. 大鼠心脏的分离与插管

  1. 将大鼠放在天平上称重。
  2. 准备一支注射器，内含150 mg/kg的硫丁巴比妥钠盐水合物麻醉剂量，另准备一支结核菌素注射器，内含200 USP单位肝素。
  3. 腹腔注射硫丁巴比妥钠，等待动物失去意识。可使用其他诱导麻醉剂，前提是不影响实验目的（参见下文 讨论 部分 中麻醉剂的选择）。
  4. 通过确认无趾夹反射来检查麻醉深度是否合适。务必维持适当的麻醉深度，以确保动物在操作过程中不感到疼痛。
  5. 当大鼠完全失去意识且对趾夹无反应时，将其仰卧位放置于手术台上，并用胶带或针固定四肢。
  6. 剃除腹部毛发，并沿腹中线做切口。此时暂不打开胸腔。将胃和肠移至一侧，暴露下腔静脉。将肝素直接注射至下腔静脉，等待5至10秒后再继续操作。
  7. 使用剪刀剪开膈肌及肋骨两侧，以暴露胸腔内容物。
  8. 用拇指、食指和中指轻柔夹住心脏，将心脏和肺一起完整切除。在降主动脉水平处切断，注意避免损伤主动脉弓和升主动脉。立即将心脏和肺转移至盛有冰冻KH缓冲液的解剖皿之一中。
  9. 待心脏停止跳动后，转移至第二个解剖皿中，在保持心脏浸没于冰冻KH缓冲液的同时，剪除附着的大块肺组织。在主动脉弓上方立即剪断降主动脉。
    警告：以下步骤涉及放射性物质的操作。请穿戴适当的个人防护装备，并遵守机构辐射安全办公室制定的安全与废物处理规定。
  10. 用剪刀冲洗灌流装置的主动脉通路，使主动脉套管充满温热缓冲液，并排除管路中可能残留的水或空气。让灌流缓冲液从主动脉套管中滴出，以最大限度减少心脏连接套管时发生空气栓塞的风险。
  11. 使用两把显微解剖镊子小心打开主动脉，并将心脏沿主动脉套管向上滑动。用微型夹夹紧主动脉于套管上，启动Langendorff灌流。观察心脏重新开始跳动，并在灌流开始后的数秒内排出冠状血管系统中残留的全部血液。
    注意：为防止心脏发生不可逆的缺血性损伤，必须尽快完成步骤4.6至4.10。有经验者整个操作应在1至2分钟内完成。将主动脉套入套管时，注意不要超过主动脉根部，以免导致心肌灌注不足或损伤主动脉瓣。
  12. 用3-0丝线将主动脉结扎固定于主动脉套管上，并移除微型夹。找到肺静脉。可能需要修剪部分非心脏组织以暴露肺静脉，但切勿过度切除，因其将用于将左心房结扎固定于套管上。
  13. 冲洗灌流装置的左心房通路，使心房套管充满温热缓冲液，并排除管路中可能残留的水或空气。特别注意彻底排除装置中的任何气泡，以最大限度减少心脏连接套管时发生空气栓塞的风险。
  14. 使用两把显微解剖镊子轻柔夹住肺静脉开口，将心脏沿心房套管向上滑动。为完成此步骤，可能需要通过轻轻旋转心房和/或主动脉套管来调整心脏位置。无论如何，应确保操作不对心脏施加过度张力，避免造成主动脉弯曲。用3-0丝线将左心房结扎固定于心房套管上。
  15. 打开心房通路，同时将主动脉通路由Langendorff模式切换至工作模式。若缓冲液从左心房泄漏，应关闭心房通路，将主动脉通路切换回Langendorff灌流模式，并使用另一根3-0丝线将左心房更牢固地结扎于套管上。

5. 心脏功能测量与样本采集

注意：代谢流量的测定需要知晓冠状动脉流量（CF）。如下所述，冠状动脉流量值可通过简单使用秒表获得。此外，采用相同方法测量主动脉流量（AF），可进一步确定心输出量（CO = CF + AF），进而通过公式 CP = CO (m3/s) × 后负荷 (Pa) 计算心脏做功（CP），作为评估心脏功能的一般性指标。另一种可用于评估心脏功能的方法是利用压力换能器实时测量脉压（图3 和 图4）。尽管可选，但若要获得最准确且详尽的心脏收缩功能与血流动力学参数（包括左心室收缩与舒张功能的测定），应使用压力-容积（PV）导管。本节简要描述离体心脏的插管操作。有关PV导管的校准及使用统计软件进行数据分析的更多详细信息，可参见文献14,15。
警告：以下步骤涉及放射性物质的操作。请穿戴适当的个人防护装备，并遵守机构辐射安全办公室制定的安全规范与废物处理规定。

  1. 如果实验需使用导管直接测量左心室功能，可用26 G针头穿刺左心室心尖，再通过穿刺口插入导管。
  2. 使用压力-容积导管时，应仔细调整导管位置，使其轴线与左心室（LV）长轴对齐，远端电极位于主动脉瓣下方且紧邻心内膜边界，近端电极则刚好置于心室壁内侧。
  3. 将心脏密封至带水套的心脏灌流室中，使用数据采集软件监测心脏功能参数。待基线心脏参数稳定超过5分钟后，开始记录数据。
  4. 通过测量灌注液充满心脏腔室下方连接的20 ml注射器所需的时间，来确定冠状动脉流量。测量完成后，打开三通旋塞阀，将冠状动脉流出液排入放射性液体废物容器中。
    注意：也可使用流量计和流量探头进行流量测量。
  5. 使用连接在三通旋塞侧臂上的3 ml注射器收集从心脏流出的约2 ml冠状窦流出液。将0.5 ml冠状窦流出液转移至一支2 ml无盖微量离心管中，并立即进行葡萄糖氧化速率的测定（见下文第6节）。
  6. 将剩余的冠状窦流出液样本（约1.5 ml）转移至适当标记的微量离心管中，并置于冰上保存。
  7. 以固定时间间隔重复步骤 5.4 至 5.6例如 每5或10分钟一次，直至灌注实验结束。
  8. 若使用压力-容积导管，注入一 10 µl 在实验结束前，向心房导管线及心房插管前注入一剂高渗盐水（15%），利用此推注剂量计算并行导电容积（Vp)，对于准确测定心腔容积至关重要15.
  9. 打开心腔并取出左心室（LV）内的导管（如果实验中使用了导管）。采用以下任一方法回收心脏：
    1. 如果无需为后续分析分离心脏的特定区域，且灌注装置允许，可关闭心房和主动脉管路，立即使用预先在液氮中冷却的Wollenberger钳夹住心脏及其插管并进行冷冻夹取。
    2. 或者，将心脏从套管上剪下并放入冰冻的KH缓冲液中。用纸巾迅速擦干心脏并称量其湿重。随后可对心脏进行解剖，采集组织样本用于特定检测。使用经液氮预冷的Wollenberger镊子将剩余组织迅速冷冻。
  10. 将冷冻的心脏组织在 -80 ºC 下保存，直至进行干重测定（见第8节 计算方法）。

6. 心肌葡萄糖氧化速率的测定

注意：该方法包括使用氢氧化羟胺溶液定量捕获冠状动脉流出液中的14CO2。加入高氯酸酸化缓冲液后，以H14CO3-形式溶解的14CO2被释放并回收。样品应在收集后立即处理，因为气体在空气与样品之间的被动扩散会随时间推移导致14CO2损失。加入高氯酸后，应使用橡胶套塞将闪烁瓶严密封闭，以防止14CO2逸失。如有必要，可使用Parafilm封膜将橡胶套塞固定在瓶口（图2）。

  1. 向玻璃闪烁小瓶中加入 1 ml 10 倍浓缩的氢氧化四甲基铵（每个样品一个样品瓶，另加两个额外小瓶用于测定本底放射活性）。
    警告：氢氧化四甲基铵具有高毒性，可引起严重灼伤。请查阅产品 MSDS 以获取适当的处理和储存方法。
  2. 使用镊子小心地将含有 0.5 ml 冠状动脉流出液样品的 2 ml 无盖微量离心管转移至预先装有氢氧化四甲基铵的小瓶中。使用 0.5 ml 灌注缓冲液用于测定本底放射活性。
  3. 用橡胶套封口塞密封小瓶。可使用封口膜进一步确保密封性。使用 1 ml 注射器和 23 G 长针头，通过橡胶套封口塞将 200 µl 高氯酸（60% w:w%）注入 2 ml 无盖管中。
    注意：由于 BSA 沉淀，冠状动脉流出液应变为白色。
  4. 让小瓶静置过夜。
    ​警告：高氯酸具有强腐蚀性，可能作为氧化剂并/或引发爆炸危险。请查阅产品 MSDS 以获取适当的处理和储存方法。
  5. 次日，取下橡胶套封口塞。用镊子小心取出每个 2 ml 无盖管，并用 1 ml 闪烁液在打开的小瓶口上方冲洗管底，以回收全部氢氧化四甲基铵。将无盖管丢弃至适当标记的放射性废物容器中。
  6. 每小瓶再加入 9 ml 闪烁液。向两个装有 10 ml 液体闪烁液的小瓶中直接加入 0.5 ml 灌注缓冲液，用于测定特异性放射活性。手动剧烈振荡小瓶，并至少等待 6 小时使气泡消散，然后在为双标记实验适当设置的液体闪烁计数器中进行测量。
    注意：使用透明玻璃小瓶以便在穿刺橡胶套封口塞时观察针头位置。切勿将高氯酸滴入氢氧化四甲基铵中，否则会破坏反应。加入高氯酸会将冠状动脉流出液中的 14CO2 释放到空气中。尽管小瓶应严密密封且所有 14CO2 应被氢氧化四甲基铵捕获，仍建议在化学通风橱内进行此实验。

7. 心肌油酸氧化速率的测定

注意：该方法基于使用强阴离子交换树脂从冠状动脉流出液中定量分离和回收3H2O。与14CO2的回收不同，该方法不存在样品稳定性问题，冠状动脉流出液可在冰上保存或于冷冻保存，待后续进行检测。

  1. 使用玻璃棉填充3 ml注射器管的尖端，制备阴离子交换树脂柱（每个样品一根柱，另加两根额外柱用于测定本底放射活性）；用移液管将树脂/水混合液加入注射器管中，直至树脂达到注射器管上2 ml刻度处。
  2. 用2 ml超纯水通过柱子清洗树脂，重复此步骤两次。
  3. 在柱子下方放置开口的闪烁瓶，每根柱上加载0.5 ml冠状动脉流出液；为测定本底放射活性，在两根柱上分别加载0.5 ml灌注缓冲液。
  4. 依次用0.5 ml、1 ml和2 ml超纯水洗涤柱子。洗脱完成后，将柱子丢弃至适当标记的放射性废物容器中。
  5. 每瓶闪烁液中加入13 ml液体闪烁液；为测定特异性放射活性，直接向两瓶已含13 ml液体闪烁液的闪烁瓶中各加入0.5 ml灌注缓冲液。剧烈摇晃闪烁瓶，并在液体闪烁计数器上检测前至少等待6小时，仪器应预先设置为适合双标记实验的检测条件。

8. 计算

  1. 若尚未完成，请测定灌流心脏的湿重。
    注意：如果后续需对剩余组织进行分子和生化分析，则不得使冷冻组织解冻。
  2. 取全灌流心脏的一部分组织样本（约占整个心脏的15%至30%），测定其湿重。将该组织样本置于50 °C的烘箱中过夜，然后测定其干重。利用该组织样本的湿重/干重比值，计算整个心脏的干重（单位：g dry wt.）。
  3. 对于每个时间点 x，将冠状动脉流量 CFx 以 ml/min 表示。
  4. 葡萄糖氧化速率的测定
    1. 取两次测得的14C背景活性（d.p.m.）值的平均值，用于确定校正因子 14Cd.p.m.ba。
    2. 测定14C比活度的平均值 14Cd.p.m.sa。
    3. 应用以下公式计算葡萄糖的比放射性（d.p.m./µmol）（FGlu）：
      葡萄糖标记比公式，\(F_{Glu} = \frac{^{14}C \cdot d.p.m._{sa}}{n_{Glu}}\)
      注意：其中 nGlu（µmol）= CGlu（µmol/L）× 样品体积（L），当使用5 mmol/L葡萄糖且样品体积为0.5 ml时，其值为2.5。
    4. 对每个时间点 x，应用以下公式计算14CO2生成速率（d.p.m./min）（A）：
      放射性示踪剂计算公式；用于科学测量与分析的示意图
      注意：其中 Volx（ml）= 0.5
    5. 将 A 除以所测定的心脏干重，得到标准化的14CO2生成速率（ANorm），单位为 d.p.m./min 每 g dry wt.。
    6. 应用公式 GO = ANorm/FGlu，计算葡萄糖氧化速率（GO），单位为 µmol 葡萄糖/min 每 g dry wt.。
  5. 油酸氧化速率的测定
    1. 取两次测得的3H背景活性（d.p.m.）值的平均值，用于确定校正因子 3Hd.p.m.ba。
    2. 测定3H比活度的平均值 3Hd.p.m.sa。
    3. 应用以下公式计算油酸的比放射性（d.p.m./µmol）（FOle）：
      静态平衡公式 \( F_{Ole} = \frac{3H \cdot d.p.m_{sa}}{n_{Ole}} \)；数学示意图
      注意：其中 nOle（µmol）= COle（µmol/L）× 样品体积（L），当使用0.4 mmol/L油酸且样品体积为0.5 ml时，其值为0.2。
    4. 对每个时间点 x，应用以下公式计算3H2O生成速率（d.p.m./min）（B）：
      用于计算生化结合比的公式；显示微分公式 \( B = \frac{^{3}\!H d.p.m._{x} - ^{3}\!H d.p.m._{ba}}{Vol_{x}} \cdot CF_{x} \)
      注意：其中 Volx（ml）= 0.5
    5. 将 B 除以所测定的心脏干重，得到标准化的3H2O生成速率（BNorm），单位为 d.p.m./min 每 g dry wt.。
    6. 应用公式 OO = BNorm/FOle，计算油酸氧化速率（OO），单位为 µmol 油酸/min 每 g dry wt.。

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结果

下图描述了两个代表性实验。在这两个实验中，均采用前述方案制备的KH缓冲液，对16周龄雄性Sprague Dawley大鼠的心脏进行离体工作模式灌流。在每个实验中，心脏均受到某种应激条件处理以影响其做功。通过将压力传感器插入主动脉管路连续记录脉压，并测定心脏功率，以评估心肌收缩功能。同时通过测定葡萄糖和油酸氧化速率，确定每种应激条件对能量底物利用的影响。

在第一次实验中，通过将后负荷增加40%（通过手动升高主动脉溢流室实现）并在灌注缓冲液中添加肾上腺素（1 µmol/L），在接近生理负荷条件下灌注20分钟后模拟了工作负荷的急性增加（图3A）。心率可通过脉搏压曲线上收缩压峰值之间的时间间隔测定，在工作负荷骤增后立即上升超过50%（图3B）。在工作负荷增加时，心脏做功提高了40%以上，同时葡萄糖和油酸氧化速率均上升（图3C）。结果表明，在急性工作负荷增加的应...

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讨论

前述方案详细描述了在离体工作大鼠心脏中同时定量测定葡萄糖氧化和脂肪酸氧化底物通量的方法。随后可将这些测量结果与记录的心脏功能参数叠加，以确定在基础状态和应激条件下（如负荷变化、缺血-再灌注）底物代谢与心脏做功之间的关系。 等等……还可以评估诸如心力衰竭和糖尿病等既往疾病状态对代谢与收缩功能关系的影响。此外，可利用基因修饰啮齿类动物的心脏来探究特定蛋白质对心肌代谢和功能的作用。最后，这些参数还可用于单独测试药物及其他循环因子的影响。由于葡萄糖经糖酵解的通量并不总是与葡萄糖氧化速率相关，因此在单次实验条件下同时监测葡萄糖在两条通路中的代谢速率可能更具信息价值。

糖酵解速率可通过向灌注缓冲液中添加[5-3H]葡萄糖来测定，因为3H2O的释放由糖酵解过程中烯醇化酶步骤的活性决定20。 alternatively，可使用[2-3H]葡萄糖，其在糖酵解途径的磷酸葡萄糖异构酶步骤中产生3H2O，以检测心肌对葡萄糖的摄取速率

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 R00 HL112952（授予 R. H.）、R01 HL108618（授予 J.P.G.）、P01 HL051971 和 P20 GM104357。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钠（NaCl）Fisher ScientificBP358
氯化钾（KCl）Fisher ScientificBP366
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)Fisher ScientificP284
七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4*7H2OFisher ScientificM63
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)Fisher ScientificS233
氯化钙（CaCl2)Sigma-AldrichC5670
AG 1-X8 树脂，氯离子型，100 - 200 干燥目数，500 gBio-Rad1401441此物品可通过直接购买氢氧化物形式来替换  （参见下文参考文献），但成本将高出近8倍
AG 1-X8 树脂，氢氧型，100 - 200 干燥目数，100 g伯乐（Bio-Rad）1432445购买此物品可省去将阴离子交换树脂从氯化物形式转化为氢氧化物形式的步骤（见方案第1.2节）
玻璃微分析真空过滤器支架Fisher Scientific09-753-2
氢氧化钠（NaOH）Fisher ScientificS318腐蚀性物质。请查阅产品材料安全数据表（MSDS），以获取正确的操作和储存方法。
带烧结圆筒的气体分散管Fisher Scientific11-138B
Probumin 牛血清白蛋白 无脂肪酸，粉末状EMD Millipore820027建议使用活性炭脱脂的BSA，因为其他纯化工艺（如冷乙醇分级沉淀）可能会残留对心脏有毒性的物质。
油酸钠Sigma-AldrichO7501
油酸，[9,10-3H(N)]-PerkinElmerNET289005MC放射性物质。请遵循所在机构辐射安全办公室关于订购和操作的指导方针。
透析膜管，29 mm 直径Fisher Scientific08-667E
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG7021
葡萄糖，D-[14C(U)]-PerkinElmerNEC042B005MC放射性物质。请遵循所在机构辐射安全办公室关于订购和操作的指导方针。
Humulin R U-100礼来公司NDC 0002-8215-01（HI-210）
Inactin HydrateSigma-AldrichT133美国缉毒局（DEA）管制物质第三类
3-0 丝线黑色编织线Roboz SurgicalSUT-15-3
10x 氢氧化苄基二甲基十二烷基铵PerkinElmer6003005剧毒，可引起严重灼伤。请查阅产品材料安全数据表（MSDS），以获取正确的操作与储存方法
20 ml 玻璃闪烁瓶Fisher Scientific03-341-25E使用玻璃小瓶以实现定量回收 14CO2
20 ml HDPE 闪烁瓶Fisher Scientific03-337-23B使用HDPE小瓶进行定量回收 3H2O
红色橡胶套管塞Fisher Scientific14-126DD20 mL 闪烁瓶；可重复使用
BD PrecisionGlide 针头 23G × 40 mmBD305194用于通过CO的橡胶套管塞注入高氯酸2 陷阱
高氯酸，60%Fisher ScientificA228具有强腐蚀性，可能起氧化剂作用和/或引起爆炸危险。请查阅产品材料安全数据表（MSDS）以获取正确的操作和储存方法
Ultima Gold，闪烁液混合物PerkinElmer6013327
玻璃棉Fisher ScientificAC38606
Decon Dri-Clean 洗涤剂粉末Fisher Scientific04-355用于玻璃器皿、塑料部件和管路的清洗
Alconox Tergazyme 酶活性粉状清洁剂Fisher Scientific16-000-115用于清洗 "难以到达" 被脂肪酸-BSA 残留物污染的表面（管路、玻璃器皿）

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离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的测定方法
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