环状聚合物的合成及其在熔融态下单分子扩散运动的表征

Satoshi Habuchi; Takuya Yamamoto; Yasuyuki Tezuka

doi:10.3791/54503

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方法文章

环状聚合物的合成及其在熔融态下单分子扩散运动的表征

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DOI：

10.3791/54503

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2016年9月26日

Satoshi Habuchi¹ , Takuya Yamamoto²^,³ , Yasuyuki Tezuka³

¹Biological and Environmental Sciences and Engineering Division, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), ²Division of Applied Chemistry, Faculty of Engineering, Hokkaido University, ³Department of Organic and Polymeric Materials, Tokyo Institute of Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种在单分子水平上合成并表征环状聚合物扩散运动的实验方案。

摘要

我们展示了一种环状聚合物的合成方法，以及在熔融状态下对单个分子水平上其扩散运动进行表征的实验方案。采用静电自组装与共价固定（ESA-CF）方法合成环状聚四氢呋喃（poly(THF)）。通过在环状聚合物链中引入荧光团单元，利用单分子荧光成像技术可视化其在熔融状态下单个环状聚合物链的扩散运动。通过均方位移（MSD）分析与累积分布函数（CDF）分析相结合的方法，对链段的扩散行为进行定量表征。结果表明，环状聚合物呈现出多模式扩散行为，与其线性对应物显著不同。该研究结果表明，借助ESA-CF法高效合成环状聚合物，并结合MSD与CDF分析在单分子水平上对扩散行为进行定量分析，可揭示通常被系综平均所掩盖的聚合物扩散异质性。

引言

环状聚合物的独特之处在于其没有链末端。它们通常表现出与线性对应物不同的异常行为，包括通过线性到环状的转化提高聚合物胶束的热稳定性^1,2，以及通过成环实现细菌细胞中DNA的空间组织³。人们认为，环状链之间的拓扑相互作用是导致这些异常行为的关键因素^4,5。因此，在缠结条件下表征环状聚合物的运动与松弛行为，数十年来一直是聚合物科学中的重要研究课题⁶。

环状聚合物的动力学研究已通过核磁共振（NMR）、光散射和黏度测量等基于系综平均的实验方法，利用合成分子和天然分子开展^7-9。然而，这些研究常受限于样品中杂质分子的干扰¹⁰。此外，由于缠结聚合物本身结构的不均一性，单个分子运动在时空上的异质性往往在系综平均过程中被掩盖。为了在分子水平上表征环状聚合物的动力学行为，亟需发展一种能够制备高纯度环状聚合物的合成方法，以及能够在单分子水平上对分子运动进行定量表征的实验与分析方法。本文将介绍一种利用静电自组装与共价固定（ESA-CF）方法合成含荧光团单元的高纯度环状及双环状聚四氢呋喃（poly(THF)）的方法^11-13，以及结合均方位移（MSD）与累积分布函数（CDF）分析，对含荧光团聚合物链的单分子运动行为进行分析的方法。

已证明，适当的数据处理对于准确表征扩散运动至关重要。通过合理的均方位移（MSD）和累积分布函数（CDF）分析，揭示了环状及双环状聚合物在缠结线性聚合物熔体及半稀溶液中的多模式扩散行为^14-16，表明聚合物的拓扑结构状态对缠结条件下链段扩散运动具有显著影响¹⁷。尽管本实验方案中描述的是用于表征环状聚合物运动的实验与分析方法，但该方法同样可用于定量表征许多其他异质体系中的扩散行为。当需要分析样品中存在多个扩散组分时，该方法尤为适用。

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方案

1. 单功能和双功能聚四氢呋喃的合成

单官能聚四氢呋喃
1. 火焰干燥一个100毫升两颈圆底烧瓶。抽真空并用氮气填充（重复3次）。
2. 向烧瓶中加入蒸馏四氢呋喃（THF）（50 ml）。将烧瓶置于水浴中 20 °C 并平衡温度。
3. 用注射器向烧瓶中加入三氟甲磺酸甲酯（0.5 mmol）。将混合物在室温下搅拌5–10分钟 20 °C.
4. 添加 N用注射器向烧瓶中加入苯基吡咯烷（4-6 当量）。搅拌混合物 30-60 分钟。
5. 在减压条件下完全除去溶剂（约 100 Torr）。将残留物溶于3-5 ml丙酮中。将丙酮溶液加入300-500 ml n己烷。过滤沉淀物并在减压条件下干燥。
双功能聚四氢呋喃
1. 将一个100毫升双颈圆底烧瓶用火焰干燥。抽真空并用氮气填充烧瓶（重复3次）。
2. 向烧瓶中加入蒸馏的四氢呋喃（50 ml）。将烧瓶置于水浴中 20 °C 并平衡温度。
3. 用注射器向烧瓶中加入三氟甲磺酸酐（0.3 mmol）。将混合物在室温下搅拌5–10分钟 20 °C.
4. 添加 N-苯基吡咯烷（4-6 当量）加入反应瓶中。搅拌反应混合物 30-60 分钟。
5. 在减压条件下彻底除去溶剂（约 100 Torr）。将残留物溶于3-5 ml丙酮中。将丙酮溶液加入300-500 ml n-己烷。过滤沉淀物，并在减压条件下干燥。

2. 含苝二酰亚胺的四臂星形及八元环状聚四氢呋喃的合成

武装星形聚四氢呋喃
1. 离子交换
  1. 将苝二酰亚胺四羧酸钠盐溶于水（10 mg/ml，150 ml）。将单官能团聚四氢呋喃溶于丙酮（160 mg/ml，4 ml）。将丙酮溶液逐滴加入剧烈搅拌的水溶液中。通过过滤收集生成的沉淀物。
  2. 对回收的沉淀物（2.1.1.1）重复上述步骤四次。
2. 共价固定
  1. 将所得沉淀物溶于甲苯（5 mg/ml），回流反应4小时。
  2. 在减压条件下完全除去溶剂（约 100 Torr）。用硅胶柱过滤残余物， n正己烷/丙酮（2/1 体积比）。将该溶液加入冰浴冷却的水（300–500 ml）中以析出产物。通过过滤收集沉淀物。
双环8字形聚四氢呋喃
1. 离子交换
  1. 将苝二酰亚胺四羧酸钠盐溶于水（6 mg/ml，50 ml）。将双官能团聚四氢呋喃（0.5 g）溶于30–50 ml丙酮中。在剧烈搅拌下，将丙酮溶液逐滴加入水溶液中 0 °C通过过滤收集形成的沉淀物。
  2. 重复上述步骤处理回收的沉淀物（2.2.1.1）。
2. 共价固定
  1. 将所得沉淀物溶解于甲苯中（0.05 g/L），回流反应4小时。
  2. 在减压条件下彻底除去溶剂（约 100 Torr）。加入甲苯使残留物部分溶解，再将其重新沉淀至 300–500 ml 的 n-己烷
  3. 通过硅胶塞过滤形成的沉淀 n正己烷/丙酮（2/1 体积比）。重新沉淀至 300–500 ml 水中。
  4. 通过柱层析纯化形成的沉淀物¹⁸ 使用聚苯乙烯凝胶通过制备型凝胶渗透色谱法（GPC）进一步纯化粗产物¹⁹ 以 CHCl 为洗脱剂₃ 通过监测折光指数（RI）和紫外（UV）检测器去除副产物。

3. 单分子荧光成像实验

样品制备
1. 显微镜盖玻片的清洗关键词：显微镜盖玻片，清洗，实验室清洁，玻璃器皿处理，表面处理
  1. 将24 x 24 mm的1.5号盖玻片放入染色缸中。
  2. 加入1 M氢氧化钾溶液（100 ml）至容器中，超声处理15分钟。通过倾析法倒去氢氧化钾溶液，用超纯水多次冲洗盖玻片。向容器中加入光谱纯乙醇（100 ml），超声处理15分钟。
  3. 倾去乙醇，用超纯水反复冲洗盖玻片数次。倾去超纯水后，重复步骤 3.1.1.2。
  4. 向容器中加入超纯水，超声处理15分钟。用超纯水多次冲洗盖玻片。使用塑料镊子将盖玻片从容器中取出，并用干燥空气或干燥氮气吹干。
2. 聚合物熔体样品的制备^14,15
  1. 添加 100 µl 未标记的线性聚四氢呋喃（poly(THF)）置于玻璃瓶中，并加热至熔点以上温度（约 25 °C）使用吹风机。
  2. 将掺入荧光团的聚合物（线性、四臂星形、环状或8字形双环，按2.1和2.2节合成）溶解于氯仿（1 ml，10^-6 M）。加入 1 µl 溶液的 100 µl 非标记线性聚四氢呋喃的熔融物
  3. 用移液枪头充分混匀样品后，将样品置于干燥仪中加热以蒸发氯仿。
    注意：此步骤可提供含有10的未标记线性聚(THF)的熔融物^-8 荧光团掺入聚合物的摩尔浓度。
  4. 取 10 µl 使用微量移液器吸取样品，滴加到一块已清洁的盖玻片上。将另一块已清洁的盖玻片覆盖在样品上，使样品夹在两块盖玻片之间。
  5. 使用塑料镊子轻轻按压样品。
宽场荧光成像系统装置¹⁵
1. 将激发激光（488 nm）引入倒置显微镜的后端端口
  1. 在光路中插入激发光带通滤光片和偏振器。
  2. 使用扩束器将光束扩展至直径约1 cm。
  3. 在光路中插入一个四分之一波片。将波片的光轴方向设置为与偏振片的光轴成45度角。或者，插入一个伯雷克补偿器，并将光学延迟调节至λ/4。
  4. 在激发光束路径中插入一个光圈以调节光束尺寸。
  5. 在将激光束引入倒置光学显微镜的后端口之前，将一个聚焦透镜（平凸透镜，焦距 ≈ 300 mm）置于激光束经物镜出射后呈准直的位置。
2. 在使用安装于滤光立方体上的二向色镜反射激光束后，通过高数值孔径（NA）物镜将激光束引入样品例如， NA 1.3，100倍放大，油浸。
3. 将物镜加热器连接至物镜，并将温度设定为 30 °C.
4. 将样品安装在倒置显微镜的载物台上
  1. 在物镜上滴加一滴镜油，然后将样品放置在显微镜载物台上。
  2. 确保样品厚度约为 10 µm 通过检测样品顶面和底面的轴向位置获得。
  3. 将显微镜的焦距调整至样品底面以上几微米处。
5. 在物镜下获得圆偏振激发光
  1. 在物镜出射的准直激光束中插入一个偏振片。
  2. 将功率计置于偏振片后，记录通过偏振片的激光强度。通过旋转偏振片，记录不同偏振角度下的透射激光功率。
  3. 如果在所有偏振角度下透射的激光功率不恒定，请轻微旋转插入激发光路中的四分之一波片或贝雷克补偿器。
  4. 重复步骤 3.2.5.2 和 3.2.5.3，直至在所有偏振角度下均获得稳定的透射激光功率。确保样品处获得圆偏振光。
6. 设置EM（电子倍增）电荷耦合器件（CCD）相机
  1. 将EM-CCD相机连接至显微镜的侧端口，并将其与图像采集软件连接。
  2. 必要时，可通过将 EM-CCD 相机生成的晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号发送至相应设备，使相机曝光与插入激发光路中的机械快门或声光可调滤光器同步；或者，将 EM-CCD 相机生成的 TTL 信号发送至激光器，以实现相机曝光与激光输出的同步。
    注意：后一种选项仅适用于使用输出功率可通过输入晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号调制的固态激光器进行实验的情况。
  3. 使用控制相机的软件对 CCD 相机应用 EM 增益（通常约为 300），以获得单个荧光分子的高质量荧光图像。
  4. 使用控制相机的软件设置一个感兴趣区域（ROI）（通常为视场中心的 128 x 128 像素）。
    注意：这使得在帧转移模式下以 100 - 200 Hz 的帧率进行成像实验成为可能，该条件对于观察熔融样品中含荧光标记的聚合物链的运动是必需的。
运行实验
1. 优化实验条件
  1. 调节样品的照明区域至大约 20 µm 使用插入激发光路中的孔径光阑调节至指定直径。
  2. 通过手动选择插入激发光路中的适当中性密度（ND）滤光片，将样品处的激发激光功率设置为 4 - 8 mW。
    注：这提供了 1 - 2 kW cm 的平均激光功率^-2 在样品上。
  3. 以100–200 Hz的帧率记录样品的荧光图像。如果单个荧光标记聚合物产生的荧光强度过低，可逐步增加激发光功率，通过中性密度滤光片（ND滤光片）调节，直至样品处的光功率达到约100 mW。
  4. 如果单分子荧光图像质量仍不理想，可通过记录未标记聚四氢呋喃（poly(THF)）纯熔体的荧光图像来检测样品中的荧光杂质。若观察到较高的荧光背景，则应更换不同批次的未标记聚四氢呋喃（poly(THF)）。
  5. 如果熔融状态下含荧光标记聚合物所产生的荧光斑点密度过高，无法实现空间上的分离（这将导致扩散运动分析出现误差），则应降低样品中含荧光标记聚合物的浓度，直至观察到空间上可分离的荧光斑点。
  6. 如果熔融状态下含荧光团的聚合物所产生的荧光点密度过低（这会导致成像实验通量降低），则增加样品中含荧光团聚合物的浓度，直至达到适当的荧光点密度。
  7. 如果从熔融状态下含荧光团的聚合物获得的荧光图像模糊，应提高成像采集的帧率。
    注：这通常需要较小的感兴趣区域，一般为 64 × 64 像素。
图像采集
1. 实验条件优化后，将装片样品置于显微镜载物台上静置一小时，使样品达到平衡状态。
2. 以100–200 Hz的帧率记录500–1,000组含荧光染料聚合物在熔融状态下的荧光图像序列。如果默认文件格式不是TIFF，则将所有图像序列转换为TIFF格式。

4. 扩散运动的分析

均方位移（MSD）分析
1. 使用图像处理软件（如 ImageJ），对荧光图像序列进行裁剪，使每个图像序列包含一个单一且聚焦良好的掺入荧光分子的聚合物。
2. 当裁剪后的图像序列包含超过10帧时，将图像序列拆分为多个序列，使每个序列包含10帧。
3. 通过图像的二维高斯拟合，精确定位每幅图像序列中分子的位置。
4. 通过扩散轨迹的均方位移（MSD）分析，确定单个分子的扩散系数（D）即，利用方程计算分子的时间依赖性位置²⁰
  
  其中 x_i 和 y_i 是图像帧 i 中分子的位置，n 表示与帧 i 相隔时间间隔 Δt 的帧编号。
5. 在频率直方图中绘制扩散系数。
  注：通常，直方图由超过 100 个分子构建而成。
累积分布函数（CDF）分析
注意：CDF， P(r², iΔt) 对应于在半径范围内找到扩散分子的累积概率 r 在一定延迟时间后从起始点 iΔt.
1. 计算在 4.1.3 中获得的所有扩散轨迹在时间延迟为 1Δt、2Δt、····、iΔt 时的均方位移。
  注意：这些计算给出的是总 m_i iΔt 时间间隔下的均方位移
2. 计算平方位移的数量（l_i) 在总 m 内_i 小于 r 的数据集² 在不同 r² 值（0 < r2 < ∞）。归一化 l_i 与 r 比较² 曲线对应于 CDF，P(r², iΔt)
采用不同扩散模型分析CDFs
注意：所获得的 CDF 通过不同的扩散模型进行拟合；均相扩散模型、包含多种扩散模式的模型，其中的 D 分布由高斯分布（单高斯模型）描述，以及存在多种扩散模式的情况 D 分布由多个高斯函数描述（多高斯模型）。
1. 在均质扩散模型中，确定一个平均值 D 通过使用方程拟合累积分布函数（CDF）²¹
  
  注意：任何偏离该方程的情况均表明分子存在非均相扩散。
2. 在单高斯模型中，确定概率分布 D 由高斯函数描述的（f(D）通过拟合累积分布函数（CDF）使用¹⁵
  
  其中 A, w，以及 D₀ 是高斯函数的幅度、宽度和中心。
3. 在双高斯模型中，确定概率分布 j^th 组成部分 D 由高斯函数描述（f(D）通过拟合累积分布函数（CDF）¹⁴
  
  其中 A_j 是各扩散组分的比例，且 α_j, w_j，以及 D₀_j 幅度、宽度和中心位置 j^th 高斯函数的组分
扩散系数理论概率分布的计算
注意：概率分布的 D 由于统计误差所致（p(D)dD针对不同的扩散模型计算得出，包括均质扩散模型和多种扩散模式 D 分布由高斯分布描述（单高斯模型），以及多扩散模式，其中D分布由多个高斯分布描述（多高斯模型）。
1. 在均相扩散模型中，使用方程计算 D 的统计概率分布²²
  
  其中 N 为扩散轨迹中的数据点数量（N = 10，参见 4.1.2），D₀ 是平均扩散系数（通过CDF分析确定，见4.2.3.1），D 是单个轨迹实验测得的扩散系数。
2. 在单高斯扩散模型中，使用方程计算扩散系数 D 的统计概率分布¹⁵
  
  其中，f(D) 表示由累积分布函数（CDF）分析（见 4.2.3.2）确定的 D 的概率分布，且 D₀ 是平均扩散系数（由CDF分析确定，参见4.2.3.2）。
3. 在双高斯扩散模型中，使用方程计算 D 的统计概率分布¹⁴
  
  其中 f(D_j) 表示第 j 个概率分布^th D 组分（D_j）由CDF分析确定（见4.2.3.3），以及D_0j 是 j 的平均扩散系数^th 组分（由CDF分析确定，参见4.2.3.3）。

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结果

采用静电自组装与共价固定（ESA-CF）方法合成了含苝二酰亚胺的四臂星形和八字形双环聚四氢呋喃（poly(THF)）（图1，图2）。对四臂（图3a）和八字形（图3b）聚合物测定了时间序列单分子荧光图像。图3中的时间序列荧光图像显示了空间分离的明亮且锐利的荧光斑点，这是由于高荧光性的苝二酰亚胺荧光团被引入聚合物链所致²³。通过时间序列图像的均方位移（MSD）分析，计算了四臂（图4a）和八字形（图4b）聚合物的扩散系数频率直方图。MSD曲线和累积分布函数（CDF）的计算采用MATLAB编写的程序完成。实验获得的CDF拟合使用Origin Pro等数据处理软件进行。由MSD分析确定的扩散系数频率直方图呈现出宽泛的分布（图4），这源于分析过程中的统计误差以及扩散行为的异质性。频率直方图明显偏...

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讨论

采用 ESA-CF 方案制备了四臂和8字形聚合物（图1），这是合成过程中的关键步骤^12,24。具有 N-苯基哌啶𬭩端基的单功能和双功能线性聚四氢呋喃（poly(THF)）根据先前的方法合成¹¹。通过将含有三氟甲磺酸根反离子的聚合物前体丙酮溶液重新沉淀至含过量羧酸根的水溶液中，完成离子交换。

四臂星形聚合物的离子交换产物在甲苯（4.9 g/L）中通过回流反应4小时进行共价转化。若转化不完全，可延长反应时间。通过硅胶柱层析（丙酮/n-己烷体系）及在水中再沉淀，得到共价键合产物。四臂聚合物的¹H NMR谱图见图2a。该ESA-CF方法可有效合成环状聚合物，但本方案仅适用于具有环状铵端基的聚合物。

对于8字形聚合物产物，反应在甲苯中稀释（0.2 g/L）条件下回流进行4小时，结果生成了大量不溶性组分，推测是由于分子间反应产物所致。可溶性组分随后在 n

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了日本科学技术振兴机构科学研究费补助金（编号 22750122，S.H.）、（编号 26288099，T.Y.）和（编号 23350050，Y.T.）的资助。S.H. 感谢久保田纪念日立科学技术财团的支持。本出版物所报告的研究工作得到了沙特国王科技大学（S.H.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
材料
THF	Godo
Wakosil C-300	和光纯药工业
丙酮	Godo
甲苯	Godo
n-己烷	Godo
CHCl₃	关东化学
Bio-Beads S-X1	Bio-Rad
三氟甲磺酸甲酯	中和 Tesque
三氟甲磺酸酐	中和 Tesque
氢氧化钾	和光纯药工业
乙醇	和光纯药工业
聚四氢呋喃	Aldrich
氯仿	和光纯药工业
浸油	Cargille	37型 / A型
设备
双口100 ml圆底烧瓶
烧瓶
烧杯
漏斗
滤纸	Whatman
回流冷凝器
注射器
水浴锅
磁力搅拌器
旋转蒸发仪
显微镜盖玻片（24 × 24 mm，No. 1）	松野玻璃	CO22241
染色缸	AS ONE Corporation	1-7934-01
超声波清洗器	VWR International	142-0047
倒置显微镜	Olympus	IX71
Ar-Kr离子激光器	Coherent	Innova 70C
Berek补偿器	Newport	5540
激发滤光片	Semrock	LL01-488-12.5
二向色镜	Omega optical	500DRLP
发射滤光片	Semrock	BLP01-488R-25
透镜和反射镜	Thorlabs
EM-CCD相机	Andor Technology	iXon
物镜（100X，N.A. = 1.3）	Olympus	UPLFLN 100XOP
物镜加热器	Bioptechs
制备型GPC	日本分析工业	LC-908

参考文献

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环状聚合物的合成及其在熔融态下单分子扩散运动的表征

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