环状聚合物的合成及其在熔融状态扩散运动的表征在单分子水平

Summary

一种用于合成和在单分子水平的环状聚合物的扩散运动的表征协议提出。

Abstract

我们展示了一种合成环状聚合物的方法和一种在单分子水平上表征它们在熔融状态下的扩散运动的方案。静电自组装和共价固定 （ESA-CF） 工艺用于合成环状聚四氢呋喃 （poly（THF））。通过在环链中加入荧光团单元，使用单分子荧光成像来可视化单个环状聚合物链在熔融状态下的扩散运动。通过均方位移 （MSD） 分析和累积分布函数 （CDF） 分析的组合来定量表征链的扩散运动。环状聚合物表现出与线性聚合物不同的多模式扩散。结果表明，通过使用 ESA-CF 工艺有效合成环状聚合物以及使用 MSD 和 CDF 分析对单分子水平的扩散运动进行定量分析，可以揭示通常隐藏在集成平均后面的聚合物的扩散异质性。

Introduction

环状聚合物的独特之处在于它们没有链端。它们通常表现出与线性对应物不同的不寻常行为，包括通过线性到循环转化提高聚合物胶束的热稳定性^1,2 以及通过环形成在细菌细胞中 DNA 的空间组织。³ 环链之间的拓扑相互作用被认为是这种不寻常行为的关键因素。^4,5 因此，几十年来，表征环状聚合物在纠缠条件下的运动和松弛一直是聚合物科学的一个重要研究课题。⁶

已经通过集成平均实验方法（如核磁共振 （NMR）、光散射和粘度测量）使用合成和天然存在的分子研究了循环聚合物动力学。^7-9 然而，这些研究经常受到样品中杂质分子的影响。¹⁰ 此外，由缠结聚合物的固有结构异质性引起的单个分子运动的时空异质性通常隐藏在这些研究的集合平均后面。为了表征环状聚合物的分子水平动力学，必须开发一种提供高纯度环状聚合物的合成方法以及一种允许在单分子水平上定量表征分子运动的实验和分析方法。在这里，我们将展示一种使用静电自组装和共价固定 （ESA-CF） 工艺^11-13 合成高纯度环状和双环状聚 （THF） 的方法，该方法包含荧光团单元，以及一种使用均方置换 （MSD） 和累积分布函数 （CDF） 分析的组合分析单个荧光团掺入的聚合物链的运动的方法。

已证明适当的数据处理对于准确表征扩散运动至关重要。通过适当的 MSD 和 CDF 分析，已经揭示了环状和双环状聚合物在线性聚合物链的熔融和半稀溶液中的多模式扩散，^14-16 表明聚合物的拓扑状态对纠缠条件下链的扩散运动有显着影响。¹⁷ 虽然本协议描述了表征环状聚合物运动的实验和分析方法，但相同的方法可用于定量表征许多其他非均相系统中的扩散运动。当需要分析样品中存在的多个扩散组分时，该方法特别适用。

Protocol

1.单功能和双功能合成聚（THF）

1. 单官能聚（THF）中
   1. 火焰干燥的2颈100毫升圆底烧瓶中。真空和填充氮气（3次）的烧瓶中。
   2. 蒸馏的四氢呋喃（THF）（50毫升）添加到该烧瓶中。把烧瓶的水浴中在20℃和平衡的温度。
   3. 通过注射器甲基三氟甲磺酸酯（0.5毫摩尔）添加到该烧瓶中。搅拌在20℃下5-10分钟的混合物。
   4. 通过注射器加入正 -苯基吡咯烷（4-6当量）的烧瓶中。搅拌30-60分钟该混合物。
   5. 在减压（ 约 100托）完全除去溶剂。溶解残留物在3-5毫升丙酮中。丙酮溶液加入到300-500毫升正己烷的。过滤沉淀物，并减压干燥。
2. 双官能的聚（四氢呋喃）
   1. 火焰干燥的2颈100毫升圆底烧瓶中。弗吉尼亚州cuum和填充氮气（3次）的烧瓶中。
   2. 蒸馏过的THF（50毫升）添加到该烧瓶中。把烧瓶的水浴中在20℃和平衡的温度。
   3. 通过注射器添加三氟甲磺酸酐（0.3毫摩尔）至该烧瓶中。搅拌在20℃下5-10分钟的混合物。
   4. 通过注射器加入正 -苯基吡咯烷（4-6当量）的烧瓶中。搅拌30-60分钟该混合物。
   5. 在减压（ 约 100托）完全除去溶剂。溶解残留物在3-5毫升丙酮中。丙酮溶液加入到300-500毫升正己烷的。过滤沉淀物，并减压干燥。

2.苝的合成二酰亚胺注册成立的4星武装和8字形双环聚（THF）

1. 臂的星形聚（THF）中
   1. 离子交换
      1. 溶于水（10毫克/毫升，150毫升）中的苝酰亚胺四甲酸二钠盐。溶解在丙酮单官能聚（THF）（160毫克/毫升，4ml）中。添加丙酮溶液逐滴加入剧烈搅拌的水溶液。通过过滤收集形成的沉淀。
      2. 重复上述过程以将回收的沉淀物（2.1.1.1）的四倍。
   2. 共价固定
      1. 溶解在甲苯中所获得的沉淀物（5毫克/毫升）。回流4小时的溶液中。
      2. 在减压（ 约 100托）完全除去溶剂。通过硅胶用正己烷 /丙酮（2/1体积/体积）的插头过滤残余物。将溶液加入到冰冷却的水（300-500毫升）以沉淀产物。通过过滤收集沉淀物。
2. 二环8字形聚（THF）中
   1. 离子交换
      1. 溶解在水（6毫克/毫升，50ml）中的苝酰亚胺四甲酸二钠盐。溶解双官能的聚（四氢呋喃）（0.5克）在30-50毫升丙酮。添加丙酮溶液滴加到在0℃下剧烈搅拌的水溶液。通过过滤收集形成的沉淀。
      2. 重复上述过程以将回收的沉淀物（2.2.1.1）。
   2. 共价固定
      1. 溶解在甲苯中所获得的沉淀物（0.05克/升）。回流4小时的溶液中。
      2. 在减压（ 约 100托）完全除去溶剂。添加甲苯，以部分溶解残留物。再沉淀成300-500毫升正己烷的。
      3. 通过硅胶用正己烷 /丙酮（2/1体积/体积）的插头过滤形成的沉淀。重新沉淀到300-500毫升的水。
      4. 纯化通过柱色谱法¹⁸使用聚苯乙烯凝胶所形成的沉淀物。用CHCl ₃洗脱剂，对物进一步纯化用制备凝胶渗透色谱（GPC）粗产物¹⁹OVE副产物通过监测折射率（RI）和UV检测器。

3.单分子荧光成像实验

1. 样品制备
   1. 显微镜盖玻片清洗
      1. 地方第1.5 24 x 24毫米显微镜盖玻片在染色缸。
      2. 添加1M的氢化钾溶液（100ml）中放入罐子和超声处理15分钟。倒出通过倾析的氢氧化钾溶液和冲洗用的超纯水的盖玻片数次。添加光谱级乙醇（100ml）插入罐子和超声处理15分钟。
      3. 倒出通过倾析乙醇和漂洗用超纯水的盖玻片数次。通过倾析倒出关闭超纯水之后，重复步骤3.1.1.2。
      4. 添加超纯水的罐子和超声处理15分钟。用超纯水多次盖玻片。用塑料镊子取出从罐子盖玻片，并且由干燥的空气或干燥的氮气干燥。
   2. 聚合物熔体样品^14,15的研制
      1. 在玻璃瓶中加入100μl非标记的线性聚（THF）中，并加热到使用吹风机的熔点（约25℃）以上的温度。
      2. 溶解荧光团并入聚合物（线性，4臂的星形的，环状的，或8字形二环在2.1和2.2合成）在氯仿（1毫升，10 ^-6 M）。加入1微升溶液到100微升的非标记的线性聚（THF）中的熔融的。
      3. 彻底将样品与一个枪头混合后，通过使用干燥机加热样品蒸发氯仿。
         注意:此提供含有荧光团引入聚合物的10 ^-8 M的非标记的线性聚（THF）中的熔体。
      4. 采取用微型移液器以及d样品的10微升ROP它在清洁的盖玻片。把在样品另一清洗盖玻片夹心两个盖玻片之间的样本。
      5. 轻轻按下用塑料镊子样品。
2. 宽视场荧光成像设置¹⁵
   1. 激励激光器（488纳米）的引入倒置显微镜的背面端口
      1. 插入一个励磁带通滤波器和起偏器进入光束路径。
      2. 由光束扩展器扩大光束的直径约1厘米。
      3. 插入一个四分之一波板进入光束路径。在45度的相对于该偏振片的设置波片的光轴。可替代地，插入Berek补偿，并设置光延迟λ/ 4。
      4. 插入在激励光束路径的膜片来调整光束的大小。
      5. 前引入的激光束进入倒置光学microsco的背面端口PE，插入一个聚焦透镜（平面凸透镜，焦距≈300毫米）在激光束出物镜的被准直的位置上。
   2. 反射用安装在过滤器立方体的分色镜的激光束后，通过高数值孔径（NA）的物镜引入的激光束到样品（ 例如，NA 1.3，放大100倍，浸油）。
   3. 附加一个目标加热器到物镜和设定温度至30℃。
   4. 安装样品在倒置显微镜的阶段
      1. 滴在物镜上浸油一滴和安装在显微镜状态的样品。
      2. 确保约10微米的样品的厚度是通过检查样品的底部和顶部表面的轴向位置得到的。
      3. 调整显微镜的焦点到样品的底面之上几微米。
      物镜下获得圆偏振光激发光
      1. 插入一个偏振器成准直的激光束出物镜。
      2. 记录由偏振后插入一个功率计透过偏振片传输的激光的强度。通过旋转偏振器记录在不同的偏振角的发射激光功率。
      3. 如果发射的激光功率是不是在所有的偏振角恒定，稍微旋转插在激发射束路径的四分之一波片或Berek补偿。
      4. 重复步骤3.2.5.2 3.2.5.3和直到恒发射激光功率在所有的极化角获得。确保该圆偏振光在样品中获得。
   5. 设置的EM（电子乘法） -电荷藕合器件（CCD）摄像机
      1. 在EM-CCD相机连接到显微镜的侧端口，并将其连接到t他的图像采集软件。
      2. 如果需要的话，通过发送由EM-CCD照相机的设备所产生的晶体管 - 晶体管逻辑（TTL）信号同步照相机暴露于机械快门或插在激发射束路径的声光可调滤波器。可替代地，通过发送由EM-CCD照相机的激光器产生的TTL信号同步照相机暴露于激光输出。
         注意:只有在一个固态激光器，其输出功率可以通过输入晶体管 - 晶体管逻辑来调制用于实验（TTL）信号后一种选择是适用的。
      3. 施加EM增益（通常为约300），以使用软件控制相机以获得单荧光团的高品质的荧光图像的CCD照相机。
      4. 设定感兴趣区域（ROI）的区域使用软件控制照相机（在视场的中心通常为128×128像素）。
         注意:这允许意马在帧传输模式，这是需要用于可视化熔融样品中的荧光团引入聚合物链的运动200赫 - 在100的帧速率纳克实验。
3. 运行试验
   1. 优化实验条件
      1. 利用插入在激励光束路径隔膜调整样本的照明区域到大约20微米的直径。
      2. 通过手动选择插入在激发束路径的适当的中性密度（ND）滤光器8毫瓦 - 在样品4中设置的激发激光功率。
         注:此为1的平均激光功率- 2千瓦厘米^-2的样本。
      3. 200赫兹 - 在100的帧速率的样本的记录荧光图像。如果从各荧光团并入聚合物中得到的荧光强度过低，使用第逐渐增加的激励功率ËND滤镜，直到样品达到约100毫瓦。
      4. 如果单分子荧光图像的质量仍不能令人满意，通过记录的非标记的聚（四氢呋喃）的纯熔体荧光图像检查样品中的荧光杂质。在高荧光背景观察的情况下，使用不同的非标记的聚（THF）中。
      5. 如果在熔体从荧光团并入聚合物中得到的荧光斑点的密度太高，以在空间上隔离它们（这将导致在扩散运动的分析错误），降低样品直至荧光团引入聚合物的浓度空间隔离的斑点观察。
      6. 如果在熔体从荧光团并入聚合物中得到的荧光斑点的密度太低（这会导致成像实验的低吞吐量），增加样品中的荧光团引入聚合物的浓度直到appropr到达荧光点的莱特密度。
      7. 如果从熔融物中的荧光团并入聚合物中得到的荧光图像被模糊，提高了成像采集的帧速率。
         注:这通常需要一个小的投资回报率，通常为64×64像素。
4. 图像采集
   1. 一旦实验条件进行了优化，离开显微镜舞台上所安装的样品为一个小时，使样品达到平衡的条件。
   2. 记录500 - 在熔融状态下的荧光团引入聚合物的1000荧光图像序列在100 - 200赫兹帧频。如果默认的文件格式不TIFF，所有的图像序列转换为TIFF格式。

4.扩散运动分析

1. 均方位移（MSD）分析
   1. 裁剪荧光图像序列以这样的方式每个图像序列包含单个和良好聚焦扩散荧光团结合使用的聚合物的图像处理软件，如ImageJ的。
   2. 当裁切后的图像序列包含超过10帧，分割图像序列成多个序列，每个序列包含10帧。
   3. 准确的图像的二维高斯拟合确定在每个图像序列的分子的位置。
   4. 确定使用方程式²⁰的扩散系数（D）的单个分子通过扩散轨迹（分子即时间依赖性的位置）的均方位移（MSD）分析
      
      其中，x _i和Y _I是在图像帧i的分子的位置，并且n在帧i表示与时间经过Δt的帧号。
   5. 情节扩散系数频率直方图。
      注:通常，直方图从超过100个分子构成。
2. 累积分布函数（CDF）的分析
   注:CDF，P（R ^2，IΔt）的对应于一定的时间差Iδ 吨后发现从原点的半径r内扩散分子的累积概率。
   1. 计算过程中出现的时间滞后1Δt，2Δt，····，iΔt为4.1.3中获得的所有扩散轨迹平方位移。
      注意:这些计算给总M _I平方位移的时间滞后iΔt的。
   2. 计算在不同R ²值比R ²小的总M _I数据集内平方位移（L _I）的数字（0 I VS R ²地块对应CDF，P（R ^{2，iΔt）。}
3. 两者结合起来分析具有鲜明的扩散模型
   注:获得CDF是由不同的扩散模型拟合;均匀扩散模型，其中对D分布通过高斯（单高斯模型）中所描述的多个扩散模式和多个扩散模式，其中对D分布由多个高斯（多高斯模型）中所述。
   1. 在均匀扩散模型，确定平均D将使用公式²¹拟合CDF
      
      注意:从等式任何偏差暗示该分子的异质扩散。
   2. 在单高斯模型，确定一高斯（F（D））中所述通过拟合使用¹⁵ CDF D的概率分布
      ON3"SRC ="/文件/ ftp_upload / 54503 / 54503equation3.jpg"/>
      
      其中A，W和D ₀是振幅，宽度和高斯的中心。
   3. 在双高斯模型，通过拟合使用¹⁴ CDF确定j ^个由高斯（F（D））中所描述的D分量的概率分布
      
      
      其中，A _j是每个扩散组分的分数，并且_{αJ，w j}的和D _{0 j}是幅度，宽度，和^第 j ^个高斯分量的中心。
4. 理论概率DISTRI计算扩散系数的bution
   注:D的发生是由于统计误差（P（D）D D）基于上不同的扩散模式的概率分布;均匀扩散模型，其中对D分布通过高斯（单高斯模型）中所描述的多个扩散模式和多个扩散模式，其中对D分布由多个高斯（多高斯模型）中所述。
   1. 在均质扩散模型，使用等式²²计算D的统计概率分布
      
      其中N是数据点的一个扩散的轨迹的数量（N = 10，见4.1.2）中，D ₀是平均扩散系数（由CDF分析确定，见4.2.3.1），D是实验获得的针对单独的轨迹扩散系数。
   2. 在里面单一高斯扩散模型，使用等式¹⁵计算D的统计概率分布
      
      其中f（D）表示由CDF分析测定的D概率分布（见4.2.3.2）和D ₀是平均扩散系数（由CDF分析确定，见4.2.3.2）。
   3. 在双高斯扩散模型，使用等式¹⁴计算D的统计概率分布
      
      其中f（D _j）表示^第 j ^个由CDF分析确定_D（D，J）的成分的概率分布（见4.2.3.3）和D _0J是^第 j ^个成分（由CDF测定的平均扩散系数分析见4.2.3.3）。

Results

苝二酰亚胺-掺入4臂的星形和8字形二环聚（四氢呋喃）■用的静电自组装和共价固定（ESA-CF）的过程（ 图1， 图2）合成的。测量时间推移单分子荧光图像为4武装（ 图3a）和8字形（ 图3b）的聚合物。时间推移荧光图像（ 图3）显示空间隔离的清晰明亮的斑点是由于高荧光苝酰亚胺荧光团²³的纳入链。计算的扩散系数的频率直方图为4武装（ 图4a）和8字形（ 图4b）由时间推移图象的均方位移（MSD）分析聚合物。 MSD地块和两者结合起来的计算是使用MATLAB写的程序进行。拟合从实验中获得的两者结合起来的是用数据处理软件，如原产地临进行。通过将MSD分析确定扩散系数的频率直方图显示广泛分布（ 图4）从两个扩散的分析和异质性的统计误差所得。频率直方图示出了从该均匀扩散模型清晰的偏差，这表明在...

Discussion

4武装和8字形聚合物进行经由ESA-CF协议（ 图1），它是用于合成的关键步骤制备^。12,24的单官能和双官能的线性聚（四氢呋喃）■用N- -phenylpiperidinium端基根据前述方法合成¹¹的离子交换是通过用三氟甲磺酸酯抗衡聚合物前体的丙酮溶液的再沉淀进行到含羧酸盐的过量的水溶液。

对于4臂的星形聚合物的离子交换产物的共价转化在甲苯（4.9克/升）回流4小时进行。如果转换不充分，延长反应时间。用硅胶柱色谱法用丙酮/ 正己烷和再沉淀于水中得到的共价键合产品。 4武装聚合物的¹ H NMR示于图2a。氏小号ESA-CF程序允许环状聚合物的有效合成。然而，该协议被限制为具有环状鎓末端基团的聚合物。

为8字形聚合物产物，该反应在甲苯中在回流下稀释（0.2克/升）中进行4小时，导致了不溶性级分的大部分的形成，这可能是由于分子间的反应产物。可溶性部分再沉淀在...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
材料
THF	Godo
Wakosil C-300	Wako Pure Chemical Industries
丙酮	Godo
甲苯	Godo
n-己烷	Godo
CHCl3	Kanto Chemical
Bio-Beads S-X1	Bio-Rad
甲基三氟甲磺酸酐	Nacalai Tesque
三氟酸酐	Nacalai Tesque
氢氧化钾	Wako Pure Chemical Industries
	Wako Pure Chemical Industries
Poly（四氢呋喃）	Aldrich
Chloroform	Wako Pure Chemical Industries
浸泡油	Cargille	37 型/A型
设备
2 口 100 ml 圆底烧瓶
烧
瓶烧杯
漏斗
滤纸	Whatman
回流冷凝器
注射器
水浴
磁力搅拌器
旋转蒸发仪
显微镜盖玻片 （24 x 24 mm， No. 1）	Matsunami Glass	CO22241
染色罐	AS ONE Corporation	1-7934-01
超声波清洗机	VWR International	142-0047
倒置显微镜	奥林巴斯	IX71
Ar-Kr 离子激光器	相干	Innova 70C
Berek 补偿器	Newport	5540
激发滤光片	Semrock	LL01-488-12.5
二氯镜	Omega 光学	500DRLP
发射滤光片	Semrock	BLP01-488R-25
镜头和镜子	Thorlabs
EM-CCD 相机	Andor Technology	iXon
物镜 （100X， N.A. = 1.3）	奥林巴斯	UPLFLN 100XOP
物镜加热器	Bioptechs
制备型 GPC	日本分析工业	LC-908