以下报告介绍了如何使用适当的染料、接触镜片和激光参数来复制非动脉炎性前部缺血性视神经病变（rNAION）的啮齿类动物模型。同时，我们还揭示了评估rNAION病灶的适当步骤 体内.
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摘要
摘要
非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）是一种局灶性视神经缺血性损伤，终生患病率为1/700。NAION可导致视神经水肿、视网膜神经节细胞（RGCs）的选择性丢失以及视神经萎缩。目前已建立一种表达大多数NAION特征及后遗症的啮齿类动物模型，适用于大鼠和小鼠。该模型采用波长为532 nm的局灶激光照射光敏染料玫瑰红（Rose Bengal, RB），在目标前部视神经（筛板区域）诱导毛细血管损伤和渗漏。在rNAION诱导后，早期出现视神经缺血、视神经水肿和神经内炎症，随后发生RGC的选择性丢失及轴突损伤。由于视神经属于中枢神经系统白质通路，因此rNAION模型适用于研究选择性白质缺血的机制，以及缺血条件下胶质细胞和神经元的短期与长期反应机制，同时也可用于神经保护作用的分析。
引言
非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）是视神经（ON）前段的局灶性缺血性损伤1。NAION 是50岁以上人群发生突发性视神经相关视力丧失的最常见原因2。其发病机制被认为是一种间隔综合征，导致神经内水肿，进而压迫为视神经内轴突供血的毛细血管3。
由于视神经实际上是一种中枢神经系统（CNS）传导束，啮齿类动物前部缺血性视神经病变（rNAION）模型可用于研究孤立性中枢神经系统白质卒中的机制及应答反应。因此，rNAION 模型可能有助于解析与白质卒中相关损伤的诸多问题，并可用于评估白质卒中中不同的神经保护策略和药物。
该模型最具吸引力的特点之一是其为无痛、非侵入性的操作过程。激光功率可调节，以产生不同程度的缺血性损伤。另一个特点是，该模型依赖激光诱导产生的超氧自由基来损伤毛细血管内皮细胞，从而导致进行性毛细血管功能障碍。这种功能障碍及随之而来的进行性水肿被认为与引起非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）的机制极为相似。研究表明，该模型不会引起毛细血管的直接血栓形成，而是通过至少两种机制发挥作用：一是超氧自由基诱导的细胞死亡以及部分毛细血管内皮细胞的剥脱4；二是残余内皮细胞中核因子κB（NFκB，即活化B细胞核因子轻链增强子）相关的炎症反应上调，导致跨细胞膜的液体转运增加，进入间质5。视神经毛细血管闭塞以及间质液体积聚所造成的压迫，最终导致视盘缺血。示意图见图2。rNAION模型可用于大鼠和小鼠两种物种6,7，且可根据需要调节损伤程度，从轻度病灶到完全但无痛的视神经和视网膜破坏，例如中央视网膜动脉阻塞（CRAO）。
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方案
本方案已获得美国马里兰州巴尔的摩市马里兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准
1. 实验设置
- 使用厚度为 3 mm、直径为 7 mm 的透明光学级有机玻璃（Plexiglas）制作定制设计的隐形眼镜。用台钻切割圆形镜片。使用标准钻头加工内表面曲率，最后使用超细研磨料（1000/3000）的隐形眼镜抛光机对内外曲面进行抛光。
- 提前配制 pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）中 2.5 mM 的玫瑰红 B（Rose Bengal, RB）溶液，用 0.45 微米注射器滤器过滤除菌，并将 1 ml 分装液储存于避光容器中，在 -20 °C 下可保存长达 6 个月。
注意：使用白化、远交系雄性动物（如 Sprague Dawley 大鼠）可最大限度减少品系间反应差异，便于诱导操作，并避免雌性动物动情周期带来的变异性。 - 设置倍频掺钕钇铝石榴石（Fd-YAG）眼科医用激光器，该设备可产生波长为 532 nm 的激光。使用标准眼科激光适配器将激光器安装在 Haag-Streit 眼科裂隙灯上。该商用设备可实现动物眼部的同步观察与激光光斑照射。该医用激光器还配备瞄准光束，用于准确聚焦和中心定位，其光斑大小与激光诱导时一致。激光参数如下：
- 大鼠 rNAION 诱导：使用 500 µm 光斑直径、50 mW 激光功率、持续时间 1,000 毫秒、间隔时间 1,000 毫秒。
- 小鼠 rNAION 诱导：因视盘较小，将光斑直径调整为 300 µm，其余参数与大鼠设置相同。
- 常规使用激光功率计检测激光输出功率，确保其准确性。
2. 实验步骤
- 打开激光电源并设置适当的激光参数。使用前需预热激光器至少五分钟。
- 称量动物体重，以确定氯胺酮/赛拉嗪和玫瑰红染料（RB染料）的合适剂量。通过腹腔注射给予每公斤体重1 ml的混合溶液（含80 mg/ml氯胺酮和4 mg/ml赛拉嗪）来麻醉动物。
- 将动物置于加热的笼子中，直至完全麻醉。通过尾部或脚趾夹捏测试确认其对有害刺激无反应。每10分钟检查一次动物的麻醉深度。
- 使用1%托吡卡胺滴眼液散大动物瞳孔，并用0.5%丙帕他卡因滴眼液表面麻醉角膜。若使用色素性动物（如Long Evans大鼠），可加用2.5%新福林滴眼液以增强瞳孔散大效果。
- 使用剪刀将待诱导侧面部的胡须贴近吻部剪短，以避免遮挡视野。
- 在自制的接触镜内侧滴加一滴1%甲基纤维素或其他眼科耦合液，然后将镜片置于大鼠眼球上。
- 将动物放置在调整至裂隙灯高度的平台上，使其头部呈45°角，确保眼睛与裂隙灯及激光束垂直。
- 通过眼科裂隙灯观察眼球。确保瞄准光斑大小合适，并准确聚焦且居中于所观察的视神经上。使用安装在裂隙灯目镜之一的数码相机（配备定制转接器，感光度ASA为1,200–2,000）拍摄眼底图像。
注：能够清晰观察到脉络膜血管表明视网膜具有良好的透明度。这是后续检测视网膜缺血的重要指标，若发生视网膜缺血将干扰实验结果判读。rNAION是视神经缺血，导致视网膜神经节细胞（RGC）选择性丢失；而视网膜缺血则会引起内层视网膜各细胞层的广泛损伤。 - 可选步骤：使用谱域光学相干断层扫描仪（SD-OCT8）进一步成像视网膜和视神经，以评估未诱导眼。进行en face扫描（图3B）以及7条穿过视网膜的横截面扫描（图3C）。SD-OCT成像使用与激光诱导相同的接触镜。
- 通过尾静脉注射每公斤体重1 ml的RB染料，等待30秒后启动激光。此时间间隔可使RB染料在循环系统中均匀分布。我们采用50 mW的激光脉冲，持续时间为1秒/脉冲。 更高的能量（≥60 mW）可能导致视网膜损伤或引发视网膜血管缺血。
注意： 所有人员必须佩戴合适阻断波长的激光防护眼镜，以防散射激光进入操作者眼睛。
注：由于RB染料在体内循环中迅速清除，因此必须在静脉注射RB后尽快实施激光照射。激光照射时间越长，视神经缺血程度越严重。通常动物接受7–12秒的连续快速脉冲照射。激光光与循环中的染料相互作用时，可在裂隙灯下观察到视神经血管呈现美丽的金黄色荧光（图4B），这证明染料已成功全身注射并分布至血流中。如果荧光微弱或完全缺失（图4A），说明染料未正确注入静脉。此时不应立即进行第二次注射，因为动物需要至少恢复两天后方可再次注射。 - 诱导完成后立即取下接触镜。双眼涂抹含地塞米松的眼科三联抗生素软膏（新霉素/多粘菌素B/杆菌肽），并将动物置于37 °C加热垫上的单独饲养笼内，密切观察直至完全苏醒。
- 用蒸馏水清洗接触镜，并用非研磨性清洁布擦干，以备后续使用。
- 诱导后两天，通过眼底彩色摄影和SD-OCT分析8评估视神经水肿情况。
注：比较视神经水肿的程度可估计视神经缺血的严重程度。在诱导后两天，与对侧（未诱导）眼相比，患眼视盘边缘模糊，视网膜静脉轻度扩张。在诱导后两周和四周分别进行视网膜电图（ERG）和闪光视觉诱发电位（VEP11）检测，用于电生理分析。
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结果
隐形眼镜可实现中央视网膜的可视化（图1）。聚焦激光点可照亮视网膜后部的视盘（图2）。正常未诱导的视网膜通过裂隙灯生物显微镜成像（图3A），以及通过谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）成像（图3B和3C）。在激光诱导过程中，当血液循环中无染料存在时，激光照射不会引起血管和视盘的荧光（图4A）。静脉注射RB后，激光照射视盘，可在视神经上观察到金黄色荧光（图4B）。诱导rNAION两天后，视神经出现肿胀（图5A）。En face 和横断面SD-OCT显示视盘肿胀（图5B）以及视神经扩张（图5C）。
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讨论
尽管存在多种视神经损伤模型（视神经 crush 损伤12、视神经横断13 和 PION14），rNAION 模型具有人道性，且适用于大鼠和小鼠，更接近人类 NAION 的临床状况。该模型包括进行性前部视神经水肿、前部视神经间隔室综合征、局灶性轴突缺血、以及在较长时间内发生的视网膜神经节细胞轴突的孤立性损伤与丢失。本报告提供了诱导 rNAION 的适当步骤，讨论了诱导过程中可能出现的问题，并描述了诱导后早期可采用的分析方法，以便在纳入数据前评估所诱导病灶的质量。rNAION 模型的优点在于，经过练习后，可实现相对一致的损伤程度。通常，10–11 秒的照射可导致 40–65% 的视网膜神经节细胞（RGC）丢失。成功率因操作者而异，取决于经验与技术，但经验丰富的研究人员可实现接近 100% 的诱导成功率。
除了诱导简便外，病变的严重程度和病程进展也易于监测。在rNAION模型中，一个重要的早期质量控制步骤是诱导后的早期分析，这有助于提升模型的优势。我们通常在诱导后两天对动物进行评估，此时视神经水肿达到最显著程度。rNAIO...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢许多研究生和博士后为此模型的有效性改进及其机制研究做出的贡献。特别感谢马里兰大学巴尔的摩分校的 Mary Johnson 博士、以色列佩塔提克瓦施耐德儿童医院的 Nitza Goldenberg-Cohen 博士、纽约布朗克斯爱因斯坦医学院的 Charles Zhang 博士，以及法国巴黎萨尔佩特里埃医院的 Valerie Touitou 博士。本研究部分由资助编号 RO1 EY015304（资助人 SLB）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mW 532 nm 激光器 | Iridex | 标准眼科激光器 | |
| 0 - 100 mW 532 nm 激光器 | Laserglow technologies | 替代 Iridex 的激光器 | |
| 激光裂隙灯适配器 | Iridex | 用于激光输出的 SMA 耦合适配器 | |
| Coherent Fieldmate 激光功率计（带热电堆传感器） | Coherent | 其他型号亦可适用 | |
| 眼科检查用裂隙灯生物显微镜 | Various | Haag-Streit 性能最佳；亦可在 eBay 购买较便宜的版本 | |
| 玫瑰红染料（Rose Bengal） | Sigma | 330000-1G | 光敏诱导剂 |
| 眼底接触镜或玻璃盖玻片 | custom/Cantor and Nissel (UK) | 定制的平凸塑料透镜，用于眼部检查和诱导 | |
| 1% 托吡卡胺（Tropicamide 1%） | |||
| Tamiya 抛光剂 | Tamiya, INC | 87068 | 用于抛光接触镜 |
| 2.5% 羟丙基甲基纤维素（Goniovisc）/1% 甲基纤维素 | HUB Pharmaceuticals | 接触镜耦合剂 | |
| 2.5% 新福林（Neosynephrine）眼科滴眼液 | Alcon labs | 瞳孔扩张剂 | |
| 1% 托吡卡胺（Tropicamide 1%） | Alcon labs | 瞳孔扩张剂 | |
| 0.5% 丙帕卡因（Proparacaine） | Alcon labs | 局部麻醉剂 | |
| 30 G 熔融针头胰岛素注射器 | Various | Various | 用于静脉注射玫瑰红染料 |
| 含地塞米松的眼科抗生素软膏（三联抗生素软膏） | Various | Various | 诱导后使用，以减少角膜瘢痕形成 |
| Heidelberg Corporation 光谱域光学相干断层扫描仪 | Heidelberg Corporation | 用于诱导前基线及诱导后光学相干成像；非诱导必需设备 |
参考文献
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