本文描述了一种在成年小鼠中诱导急性骨骼肌再生的详细方案，以及对肌肉进行后续操作的方法，例如解剖、冷冻、切片、常规染色和肌纤维横截面积分析。
本文内容
摘要
摘要
骨骼肌再生是一种生理性过程，发生在成体骨骼肌受到损伤或疾病影响时。由急性损伤诱导的骨骼肌再生是一种广泛应用且强有力的研究模型系统，可用于研究参与肌肉再生的各种事件、机制及不同作用分子。事实上，深入了解这一过程对于更好地理解导致骨骼肌退变的病理状态至关重要，并有助于发现新的靶向治疗策略。本研究介绍了一种在小鼠中通过单次肌内注射心脏毒素（CTX）诱导急性骨骼肌再生的详细且可重复的实验方案。CTX属于蛇毒毒素家族，可引起肌纤维的肌溶解，从而最终触发再生过程。通过肌肉切片的组织学分析来评估骨骼肌再生的动态变化。该方案还详细说明了胫骨前肌的解剖、冷冻和切片等实验操作步骤，以及广泛用于后续形态学和形态计量学分析的常规苏木精与伊红染色（Hematoxylin & Eosin staining）方法。
引言
哺乳动物成体的骨骼肌由多核肌细胞（肌纤维）的束状结构（肌束）组成，这些细胞特化用于收缩功能。每条肌纤维均为细长的合胞体，外被肌膜（质膜），内部含有肌原纤维，而肌原纤维由规则且重复排列的收缩蛋白（肌动蛋白和肌球蛋白丝）构成。在成体生命阶段及静息状态下，骨骼肌的肌核更新率极低1；事实上，位于肌纤维周边、肌膜下方的肌核停滞于细胞周期的G0期，无法进行增殖1,2。
骨骼肌在受损后具有独特的再生能力，经过一系列紧密关联的组织重塑事件后可恢复稳态。在发生急性损伤或创伤后，首先出现变性过程，随后启动再生过程，该过程涉及多种细胞群体，包括位于肌肉组织中的固有细胞群体——卫星细胞（SCs）。事实上，在无任何外界环境刺激的情况下，卫星细胞处于静息状态，定位于肌膜与基底膜之间的特化微环境之中3,4。在损伤或疾病发生后，卫星细胞被激活，进而增殖、迁移至受损区域，并最终分化，形成新的肌纤维5。激活的卫星细胞与多种细胞群体建立相互作用，主要是与被募集至损伤部位的炎性细胞之间的交互作用6-8。这种细胞间的交互作用使细胞遵循一种受调控的模式，通过分子信号引导结构改变，最终实现组织稳态9。除卫星细胞外，炎性细胞、间质细胞、血管生成过程以及再神经化事件也共同参与修复过程，以协调一致的方式恢复这一高度有序且特化的组织结构。
人们对骨骼肌再生的不同方面具有浓厚的研究兴趣，不仅是为了理解肌肉的生理学特性，也是为了改进需要更深入了解整个再生过程的治疗策略。目前已有多种实验方法可用于研究不同细胞群体的身份与功能、信号通路以及参与其中的分子机制。急性损伤的小鼠模型是研究该过程多个方面的有力工具。多种常用的诱导急性肌肉损伤的技术使研究人员能够追踪再生过程。 体内从过程的最初阶段到最终分析。本方案详细描述了从注射蛇毒来源的心脏毒素（cardiotoxin, CTX）诱导肌细胞溶解并启动再生过程，到组织样本分析的全部步骤。在向小鼠注射CTX后，可根据实验需求在不同时间点处死动物，解剖分离骨骼肌组织并进行后续处理。最后，本文介绍了组织切片的染色方法，用于形态学观察和基础定量分析。该方案可用于急性骨骼肌再生的研究。 体内 以高度可重复的方式10.
方案
所有实验均严格遵循机构动物研究指南，并根据意大利卫生部公共卫生、动物健康、营养与食品安全部门依据动物实验相关法律批准的程序进行。 颈椎脱位操作可能因机构而异，具体取决于IACUC或其同等机构的要求。
1. 胫骨前肌注射心肌毒素
- 在开始实验前，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或水将心脏毒素（CTX）储备液稀释，配制成10 μM的工作溶液。
注意： CTX在水中的溶解度为1 mg/mL。配制70 μM的储备液，分装后于-20 °C保存。本实验方案所用心脏毒素为多种心脏毒素的混合物，其分子量约为7,000 Da。
警告： 建议佩戴双层手套、防护口罩和护目镜（或在通风橱内操作以替代护目镜），并格外小心，避免与溶液发生任何接触，即使已稀释。 - 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪（剂量分别为80 mg/kg和10 mg/kg体重）或其他经批准的麻醉剂对小鼠进行麻醉。
- 将小鼠仰面放置，用70%乙醇喷洒其后肢。为准确观察胫前肌（TA）的位置，借助解剖刀在膝关节下方小腿前部剃除毛发。
注意： 胫前肌起源于胫骨近端主体，沿骨外侧向下延伸至踝部。其长腱跨过踝关节延伸至足部（见图1A）。 - 缓慢回拉注射器活塞，吸取约100 μL溶液。
- 将注射器垂直持握（针头朝上）以排除气泡。轻轻下拉活塞，并轻敲注射器管壁，促使附着在管内壁的气泡上浮。缓慢推动活塞以排出大气泡，此时针头会排出数滴液体。由于心脏毒素具有毒性，此时应确保将液体重新吸入管内，避免飞溅。
- 继续吸取溶液至所需剂量。每侧胫前肌注射20 μL CTX溶液。
- 以胫骨位置为参考，从肌腱向膝关节方向，将针头插入胫前肌中央。由于胫前肌组织较薄，注射时不宜过深（针头插入深度为2/3 mm，角度约为10°至20°），避免穿透肌肉本身（图1A）。
- 注射后不要立即拔出针头，应停留2–3秒，以防止CTX溶液从肌肉中渗漏。
- 实验结束后，将小鼠置于加热板（37 °C）上的笼子中，直至其苏醒，因为所使用的麻醉剂和乙醇会导致体温下降。
2. 胫骨前肌分离
注意：可根据实验需求，在注射心脏毒素后的不同时间点分离肌肉组织。
- 通过颈椎脱位处死小鼠。
- 用70%乙醇喷洒后肢。在操作过程中，可将动物固定在支撑物上以保持其稳定。
- 在近端肌腱水平（足部上方）切开皮肤，将剪刀的一侧刀片插入皮肤下方，沿朝向膝盖的方向向上剪开皮肤。借助镊子提起皮肤，完全暴露肌肉。仔细去除目标区域的所有皮肤和毛发。
- 消除 筋膜 通过使用尖头镊子或精细显微解剖剪，在胫骨对侧肌肉最外周区域进行缓慢捏压或剪切图1B）。破裂后，轻柔地移除 筋膜 使用细头镊子操作；避免损伤下方肌肉。
注意： 与其他肌肉和器官一样，TA 也被覆盖 筋膜 （小腿深筋膜），一种位于皮肤深层的薄层结缔组织，需将其去除以方便分离其下方的肌肉。 - 观察足部上方的趾长伸肌腱和胫骨前肌（TA）肌腱，二者相邻。趾长伸肌（EDL）肌肉的肌腱位于TA肌腱稍下方。成年小鼠的肌腱肉眼可见。.
- 采用以下两种技术之一去除趾长伸肌（TA肌）：
- 用精细的显微解剖剪剪断两条肌腱，并用镊子夹住肌腱向近端牵拉。将两条肌腱分开，轻轻向相反方向牵拉以分离肌肉。
- 借助细尖镊子，将镊尖从趾长伸肌腱下方穿过，分离远端趾长伸肌腱与趾长伸肌腱图1C，上图）。轻轻将镊子滑入TA下方，以分离其下方的肌肉（图1C，底部图片）。
- 用镊子托住肌肉下方使其略微抬起，切断胫骨前肌（TA）肌腱，并轻轻向上牵拉，直至仅膝关节下方区域仍与肌肉相连图1D，左图）。用剪刀沿肌肉边缘在膝关节下方切断胫前肌（TA）。图1D，右图）。
注意： 如果肌肉仍轻微附着在两侧，可使用精细的显微解剖剪帮助分离。
注意： 如果镊子不易置于趾长伸肌（TA）下方，则有可能 筋膜 尚未完全去除，可能仍可见于肌肉表面。此时，应彻底清除 筋膜 在继续之前。
3. 新鲜冷冻肌肉技术
- 放置少量黄蓍胶或类似的冷冻粘合剂（例如， 最佳切割温度（OCT）包埋剂置于软木切片上。如有需要，可在冷冻前于软木切片背面进行标记图2A).
- 为了获得肌肉的横切面，将TA肌肉的远端肌腱插入刺槐豆胶中并使其沉入，保留约3/4的肌肉露在外面，确保肌肉与软木塞呈垂直位置图2A).
- 将异戊烷注入铝罐（或金属杯、玻璃烧杯）中。将盛有异戊烷的容器悬置于装有液氮的杜瓦瓶内，注意避免液氮进入容器中。
注意： 异戊烷需要达到适当的温度（-150 至 -160 °C）才能实现组织的最佳冷冻。当容器底部出现一些白色固体颗粒且异戊烷变得略微黏稠时，即表示已达到正确温度。
注意： 在固体颗粒形成之前不要冷冻样品，以免产生冰冻伪影。另一方面，如果异戊烷完全凝固，请将其置于室温下直至融化，确保仍有部分白色颗粒存在。 - 使用 Mixter 镊子，迅速将带有肌肉的软木塞浸入异戊烷中，保持肌肉朝下，并确保软木塞完全浸没于液体时即松开镊子。如此操作后，当标本漂浮时，液体中仅应可见软木塞的背面。
- 将样品置于异戊烷中1分钟。
- 使用 Mixter 钳（或类似型号的钳子）夹取肌肉组织，浸入液氮中至少 2 min。
- 将样本分别用带标签的铝箔纸包裹，并立即置于干冰（-70 °C）中，或直接储存于 -80 °C 超低温冰箱中。
注意： 在整个操作过程中，从步骤 3.4 到 3.7，保持适当的温度并防止样本解冻至关重要（例如在转移至 -80 °C 冰箱过程中，温度升高会导致组织内存在的水微晶发生不受控的融化和再冻结，最终引起组织假象的形成或肌纤维的破坏（在组织切片上表现为肌纤维中央出现较大的白色空洞）。
4. 冷冻肌肉的冰冻切片
- 将冷冻切片机腔室温度设置为 -20 至 -22 °C。
- 将样品台、刀片和样品放入冷冻切片机腔室内，使其平衡至少30分钟。
- 放置少量冷冻剂（例如， 在标本台（OCT包埋剂）上滴加适量OCT包埋剂，于包埋剂凝固前将带有标本的软木塞浸入其中。同时，将刀片装入刀片架中。
- 使用提供的螺丝对齐样本和刀片，使样本架与刀片架方向一致图2B).
- 将切片厚度设为 10 μm，然后开始切片。每转动一次驱动轮，样品架即向刀片方向推进一段可控距离。
- 将切片置于偏振片上（每张载玻片放置8至10个切片）图 2C).
- 切片后，将载玻片置于 -80 °C 保存。
注意： 样本若得到妥善处理和保存，可存放于-80 °C冰箱中，并可重复用于后续切片。
5. 常规组织学染色（苏木精） & 伊红染色)
注意：可根据分析需要对肌肉切片进行多种组织学染色。用于形态学和形态计量学分析的常规组织学染色为苏木精染色。 & 伊红（H&E) 双染色法。苏木精将细胞核染成深紫色。细胞核染色后用伊红（粉红色/红色）进行对比染色，伊红可染嗜酸性结构，例如细胞质中的肌纤维。
- 将带有切片的冷冻载玻片在室温下完全风干 10 - 15 分钟，将载玻片放入染色架中，并将染色架置于染色缸内。
- 用苏木精染色 1 分钟。
- 将染色缸置于较弱的自来水流下冲洗 10 分钟，以洗去苏木精。
- 如果将使用醇溶性伊红溶液，则将载玻片浸入 95% 乙醇中 5 分钟（若使用水溶性伊红溶液，则跳过此步骤）。
- 用伊红溶液复染 1 分钟。
- 用水冲洗以去除多余的伊红溶液。
注意：每次使用新的苏木精或伊红染液批次时，应优化染色时间。 - 将样本依次在梯度乙醇中脱水：50% 和 70% 乙醇（各数秒），迅速浸入 95% 乙醇，随后在 100% 乙醇中更换两次，每次 5 分钟。
- 在二甲苯中更换两次进行透明化处理，每次 5 分钟或更长时间。此步骤必须在通风橱中进行。
- 使用基于二甲苯的封片介质封片，将数滴封片介质滴加在载玻片上，然后盖上盖玻片。也可将封片介质滴加在盖玻片上，再将盖玻片覆盖于载玻片。
- 避免载玻片与盖玻片之间产生气泡。为消除气泡，封片后保持载玻片垂直，并用钝头镊子（或类似钝头工具）轻轻按压盖玻片，挤出多余的封片介质和气泡。
- 将载玻片置于通风橱中数小时或过夜，使二甲苯完全挥发后再进行分析。
- 对 H&E 染色的小鼠再生肌肉切片进行形态学和形态计量学分析，每只小鼠至少采集一个完整肌肉切片的非重叠连续图像。使用明场显微镜以 20 倍放大倍数采集图像。
注意：建议至少使用 5 只小鼠，以确保测量结果具有统计学意义。
注意：可使用图像分析软件进行分析，例如免费下载软件 ImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/）。
结果
H&E 染色可用于评估骨骼肌再生过程中特定时间点的组织形态学变化。图3展示了对野生型小鼠损伤胫前肌（TA）进行的时间进程分析。肌肉分别在注射 CTX 后第 3、7、15 和 30 天被分离，如图3A所示。H&E 染色的横切面代表性图像显示了骨骼肌修复随时间的动态变化过程（图3B-E）。损伤后第 3 天，肌肉的结构完全被破坏，退化的肌纤维（坏死区域）和单核细胞均清晰可见（图3B）。这一异质性细胞群体主要包括瞬时扩增的卫星细胞（成肌细胞）、从血液中募集的炎性细胞11，以及参与再生过程的间质细胞和内皮细胞，这些过程在损伤部位被激活。在此背景下，新生的再生肌纤维由成肌细胞融合并分化形成。再生区域的主要特征是出现具有中央细胞核和深染细胞质的小型嗜碱性肌纤维（图3C）。此阶段仍可见炎症反应，但其程度逐渐减弱。随着时间推移，再生肌纤维的尺寸逐渐增大，形成具有中央细胞核的嗜酸性再生肌纤维（图3D, E）。再生肌纤维在再生后期直至整个过程结束时均可观察到。健康的肌纤维结构高度有序，彼此紧密排列，胞质呈粉红色，细胞核位于肌纤维周边，紧贴肌膜下方。这些健康肌纤维通常位于远离 CTX 注射和损伤部位的区域，较少代表再生已完全完成的区域。事实上，再生肌纤维的特征是其细胞核位于中央，这些细胞核需在损伤后数月才会逐渐迁移至肌纤维周边。
通过添加比例尺以进行空间校准，获取染色肌肉切片的数字图像，这是通过勾画感兴趣区域的轮廓来准确测量其面积所必需的步骤。肌纤维横截面积（CSA）的测量是一种可靠的形态计量学分析方法，广泛用于量化不同小鼠组之间再生趋势的差异。该分析需要测量中央核化肌纤维的面积，每张切片至少测量500根，最多可达1000根纤维。再生与已再生肌纤维面积的平均值及其面积的高斯分布均可作为再生过程的指标。肌纤维CSA的增加通常与改善和/或加速的再生反应相关；相反，再生过程异常则表现为CSA减小。本文展示了在不同时间点的肌纤维CSA分析结果，以肌纤维CSA的平均值（图3F）和分布情况（图3G）表示。该分析凸显了肌纤维面积分布随时间的变化，以及随着再生过程的推进，CSA向更大尺寸纤维偏移的趋势。
图1. 胫骨前肌的肌内注射与分离。A. 在胫骨前肌内进行心肌毒素的肌内注射。B. 去除肌肉fascia。白色箭头指示尖头镊子，用于夹住肌肉以剥离fascia。C. 上图显示远端胫骨前肌（TA）肌腱的解剖位置。下图显示如何抬起TA肌肉并将其取出，同时避免肌肉损伤。D. 左图：通过向上牵拉远端肌腱来抬起TA肌肉。白色箭头指示远端趾长伸肌（EDL）肌腱。右图：用镊子夹住肌腱后，在膝关节下方切断TA肌肉的上缘。白色箭头指示切割位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 新鲜冰冻肌肉及冷冻切片机切片。A. 新鲜肌肉使用刺槐胶包埋的技术。胫骨前肌（TA）从肌腱端浸入刺槐胶中，约 3/4 部分露在胶外，并保持与软木塞垂直的位置。 B. 冷冻切片机切片操作的代表性图像。将软木塞置于样品台座上少量冷冻包埋剂中。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3. 骨骼肌再生的时间进程分析。A. 急性骨骼肌损伤的实验方案。B-E。在损伤后指定时间点，经心脏毒素（CTX）处理的肌肉经苏木精与伊红染色切片的代表性图像。B。图像左侧的黑色实线圈出一对坏死肌纤维，可能已被炎性细胞侵入；右侧的虚线标记了单核细胞浸润区域。C。黑色圆圈标示一个具有中央细胞核的单个未成熟肌纤维。D-E。黑色圆圈标示具有中央细胞核的大再生嗜酸性肌纤维。比例尺为 100 mm。F。胫前肌（TA）切片中中央核肌纤维大小的平均值。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示，每组 5 只小鼠。G。CTX 注射后第 6、15 和 30 天肌纤维横截面积（CSA）的分布情况。数据以均值 ± SEM 表示，每组 5 只小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
此处，我们介绍一种在骨骼肌中诱导急性损伤的实验方案即， 肌肉内注射CTX）。它被广泛用作研究骨骼肌再生动态的有力工具 体内CTX 注射可诱导肌纤维退化，这是由于肌膜去极化及纤维收缩所致。12，并触发一系列导致肌肉再生的事件。根据实验需求，在注射和损伤后的特定时间点解剖获取骨骼肌，用于后续组织学分析。解剖所得的肌肉组织可包埋于冷冻保护介质后冷冻保存，或进行石蜡包埋。然而，这些方法需经多聚甲醛预固定步骤，可能产生组织学伪影，进而影响后续分析结果。直接冷冻组织可避免此问题。值得注意的是，许多一抗仅在新鲜冷冻的肌肉切片上或在该条件下表现出更佳的免疫反应活性。13，这使得该实验方法更加可靠。形态计量分析通常在时间序列实验中进行，以便评估相同年龄、具有特定基因突变和/或接受药物处理的小鼠组间再生过程的差异。尽管CTX诱导损伤的实验方案本身具有高度可重复性，但其可能的局限性在于CTX注射操作依赖于操作者，存在操作者间变异。为克服这一局限性，建议整个时间序列实验由同一操作者完成。
肌肉再生的程度可以通过健康肌纤维、坏死区域和炎症区域、以及再生和已再生区域占总观察面积的百分比进行量化。然而，这种方法主要用于研究慢性损伤过程，例如在肌营养不良的mdx小鼠中，而非急性损伤模型。事实上，肌营养不良的肌肉表现为退变与再生的异步事件，而急性损伤后的病理过程则具有明确且连续的时序特征。这类分析的一个局限性在于，其依赖于对上述形态学特征的经验性识别，因此并非完全无偏倚。为了支持实验结论，形态学分析应始终结合其他分析方法，例如对特定分子标志物的免疫荧光分析，以增强结论的可靠性。因此，推荐采用平行分析方法以明确解读实验结果。例如，正在再生的肌纤维会特异性地表达胚胎型肌球蛋白重链（eMyHC），并对eMyHC呈阳性染色，该蛋白仅在新形成的肌纤维中表达。因此，可将eMyHC染色肌纤维的定量分析与形态学分析并行进行。
CSA分析是一种更可靠的定量方法，可在苏木精和伊红（H&E）染色切片或使用层粘连蛋白染色的肌肉切片上进行，后者可标记肌纤维的边缘；定量分析使用ImageJ的适当宏程序完成，具体方法如上所述。无论采用哪种方法，都必须首先评估切片的质量，并排除形态扭曲或卷曲的组织区域。
除了对组织进行形态学分析外，苏木精-伊红（H&E）染色切片还可用于识别其他特定特征，例如纤维化和/或脂肪组织的存在。实际上，纤维化源于细胞外基质的过度积聚，这种情况可能发生在再生受损或慢性疾病过程中14。在H&E组织学染色中，细胞外基质的积聚表现为再生肌纤维之间沉积的浅染物质。通过多轮CTx注射可模拟慢性疾病状态，其中肌纤维经历反复的变性与再生过程，并异常积聚瘢痕组织。然而，目前已有更为可靠的方案可用于诱导肌肉纤维化15，并可通过特定的组织学染色方法（如Masson三色染色或天狼星红染色）来识别和定量这些结构。脂肪组织的形成在H&E染色切片中表现为肌纤维之间圆形的白色结构，清晰可见，提示脂肪组织的存在，其定量可通过油红O染色实现。最后，按照本方案获得的骨骼肌切片还可用于开展免疫荧光分析，结合特异性抗体和相应实验流程进行检测。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢IGB-CNR动物房和综合显微镜设施。本工作受益于欧洲共同体第七框架计划项目ENDOSTEM（血管相关干细胞和肌肉干细胞的激活以实现肌肉组织的修复与维持，资助协议编号241440）、意大利教育大学研究部（MIUR-PRIN 2010-2011）对G.M.和S.B.的资助、PON IRMI集群项目对G.M.的资助，以及CARIPLO基金会对G.M.和S.B.的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 来自 Naja mossambica mossambica的 心脏毒素 | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| BD Micro-Fine+ 胰岛素注射器，30 G × 8 mm 针头，0.3 mL | BD | 324826 | |
| 刺梧桐胶 | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-甲基丁烷（异戊烷） | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT 冰冻切片包埋剂（Killik 溶液） | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather 微切片刀 S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Superfrost Plus 玻片 | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 镜面抛光镊子 | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| 直型锐/锐手术剪 | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Noyes 直型手术剪 | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| 精细直型虹膜剪，锐/锐，10.5 cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt 封片剂 | Bio-optica | 09-00100 | |
| 盖玻片 | BIOSIGMA | VBS651 | |
| 二甲苯 | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| 乙醇 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| 苏木精 | J.T. BAKER | 3873 | |
| 伊红 | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| 冰冻切片机 | LEICA | CM3050 S |
参考文献
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