本文描述了一种在成年小鼠中诱导急性骨骼肌再生的详细方案，以及对肌肉进行后续操作的方法，例如解剖、冷冻、切片、常规染色和肌纤维横截面积分析。
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本文内容
摘要
摘要
骨骼肌再生是一种生理性过程，发生在成体骨骼肌受到损伤或疾病影响时。由急性损伤诱导的骨骼肌再生是一种广泛应用且强有力的研究模型系统，可用于研究参与肌肉再生的各种事件、机制及不同作用分子。事实上，深入了解这一过程对于更好地理解导致骨骼肌退变的病理状态至关重要，并有助于发现新的靶向治疗策略。本研究介绍了一种在小鼠中通过单次肌内注射心脏毒素（CTX）诱导急性骨骼肌再生的详细且可重复的实验方案。CTX属于蛇毒毒素家族，可引起肌纤维的肌溶解，从而最终触发再生过程。通过肌肉切片的组织学分析来评估骨骼肌再生的动态变化。该方案还详细说明了胫骨前肌的解剖、冷冻和切片等实验操作步骤，以及广泛用于后续形态学和形态计量学分析的常规苏木精与伊红染色（Hematoxylin & Eosin staining）方法。
引言
哺乳动物成体的骨骼肌由多核肌细胞（肌纤维）的束状结构（肌束）组成，这些细胞特化用于收缩功能。每条肌纤维均为细长的合胞体，外被肌膜（质膜），内部含有肌原纤维，而肌原纤维由规则且重复排列的收缩蛋白（肌动蛋白和肌球蛋白丝）构成。在成体生命阶段及静息状态下，骨骼肌的肌核更新率极低1；事实上，位于肌纤维周边、肌膜下方的肌核停滞于细胞周期的G0期，无法进行增殖1,2。
骨骼肌在受损后具有独特的再生能力，经过一系列紧密关联的组织重塑事件后可恢复稳态。在发生急性损伤或创伤后，首先出现变性过程，随后启动再生过程，该过程涉及多种细胞群体，包括位于肌肉组织中的固有细胞群体——卫星细胞（SCs）。事实上，在无任何外界环境刺激的情况下，卫星细胞处于静息状态，定位于肌膜与基底膜之间的特化微环境之中3,4。在损伤或疾病发生后，卫星细胞被激活，进而增殖、迁移至受损区域，并最终分化，形成新的肌纤维5。激活的卫星细胞与多种细胞群体建立相互作用，主要是与被募集至损伤部位的炎性细胞之间的交互作用6-8。这种细胞间的交互作用使细胞遵循一种受调控的模式，通过分子信号引导结构改变，最终实现组织稳态9。除卫星细胞外，炎性细胞、间质细胞、血管生成过程以及再神经化事件也共同参与修复过程，以协调一致的方式恢复这一高度有序且特化的组织结构。
人们....
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方案
所有实验均严格遵循机构动物研究指南，并根据意大利卫生部公共卫生、动物健康、营养与食品安全部门依据动物实验相关法律批准的程序进行。 颈椎脱位操作可能因机构而异，具体取决于IACUC或其同等机构的要求。
1. 胫骨前肌注射心肌毒素
- 在开始实验前，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或水将心脏毒素（CTX）储备液稀释，配制成10 μM的工作溶液。
注意： CTX在水中的溶解度为1 mg/mL。配制70 μM的储备液，分装后于-20 °C保存。本实验方案所用心脏毒素为多种心脏毒素的混合物，其分子量约为7,000 Da。
警告： 建议佩戴双层手套、防护口罩和护目镜（或在通风橱内操作以替代护目镜），并格外小心，避免与溶液发生任何接触，即使已稀释。 - 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪（剂量分别为80 mg/kg和10 mg/kg体重）或其他经批准的麻醉剂对小鼠进行麻醉。
- 将小鼠仰面放置，用70%乙醇喷洒其后肢。为准确观察胫前肌（TA）的位置，借助解剖刀在膝关节下方小腿前部剃除毛发。
注意： 胫前肌起源于胫骨近端主体，沿骨外侧向下延伸至踝部。其长腱跨过踝关节延伸至足部（见图1A）。 - 缓慢回拉注射器活塞，吸取约100 μL溶液。
- 将注射器垂直持握（针头朝上）以排除....
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结果
H&E 染色可用于评估骨骼肌再生过程中特定时间点的组织形态学变化。图3展示了对野生型小鼠损伤胫前肌（TA）进行的时间进程分析。肌肉分别在注射 CTX 后第 3、7、15 和 30 天被分离，如图3A所示。H&E 染色的横切面代表性图像显示了骨骼肌修复随时间的动态变化过程（图3B-E）。损伤后第 3 天，肌肉的结构完全被破坏，退化的肌纤维（坏死区域）和单核细胞均清晰可见（图3B）。这一异质性细胞群体主要包括瞬时扩增的卫星细胞（成肌细胞）、从血液中募集的炎性细胞11，以及参与再生过程的间质细胞和内皮细胞，这些过程在损伤部位被激活。在此背景下，新生的再生肌纤维由成肌细胞融合并分化形成。再生区域的主要特征是出现具有中央细胞核和深染细胞质的小型嗜碱性肌纤维（图3C）。此阶段仍可见炎症反应，但其程度逐渐减弱。随着时间推移，再生肌纤维的尺寸逐渐增大，形成具有中央细胞核的嗜酸性再生肌.......
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讨论
此处，我们介绍一种在骨骼肌中诱导急性损伤的实验方案即， 肌肉内注射CTX）。它被广泛用作研究骨骼肌再生动态的有力工具 体内CTX 注射可诱导肌纤维退化，这是由于肌膜去极化及纤维收缩所致。12，并触发一系列导致肌肉再生的事件。根据实验需求，在注射和损伤后的特定时间点解剖获取骨骼肌，用于后续组织学分析。解剖所得的肌肉组织可包埋于冷冻保护介质后冷冻保存，或进行石蜡包埋。然而，这些方法需经多聚甲醛预固定步骤，可能产生组织学伪影，进而影响后续分析结果。直接冷冻组织可避免此问题。值得注意的是，许多一抗仅在新鲜冷冻的肌肉切片上或在该条件下表现出更佳的免疫反应活性。13，这使得该实验方法更加可靠。形态计量分析通常在时间序列实验中进行，以便评估相同年龄、具有特定基因突变和/或接受药物处理的小鼠组间再生过程的差异。尽管CTX诱导损伤的实验方案本身具有高度可重复性，但其可能的局限性在于CTX注射操作依赖于操作者，存在操作者间变异。为克服这一局限性，建议整个时间序列实验由同一操作者完成。
肌肉再生的程度可以通过健康肌纤维、坏死.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢IGB-CNR动物房和综合显微镜设施。本工作受益于欧洲共同体第七框架计划项目ENDOSTEM（血管相关干细胞和肌肉干细胞的激活以实现肌肉组织的修复与维持，资助协议编号241440）、意大利教育大学研究部（MIUR-PRIN 2010-2011）对G.M.和S.B.的资助、PON IRMI集群项目对G.M.的资助，以及CARIPLO基金会对G.M.和S.B.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 来自 Naja mossambica mossambica的 心脏毒素 | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| BD Micro-Fine+ 胰岛素注射器，30 G × 8 mm 针头，0.3 mL | BD | 324826 | |
| 刺梧桐胶 | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-甲基丁烷（异戊烷） | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT 冰冻切片包埋剂（Killik 溶液） | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather 微切片刀 S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Superfrost Plus 玻片 | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 镜面抛光镊子 | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| 直型锐/锐手术剪 | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Noyes 直型手术剪 | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| 精细直型虹膜剪，锐/锐，10.5 cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt 封片剂 | Bio-optica | 09-00100 | |
| 盖玻片 | BIOSIGMA | VBS651 | |
| 二甲苯 | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| 乙醇 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| 苏木精 | J.T. BAKER | 3873 | |
| 伊红 | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| 冰冻切片机 | LEICA | CM3050 S |
参考文献
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (201....
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