在小鼠犁鼻急性组织切片定义细胞群的深入生理学分析

摘要

在这里，我们描述了一种生理学方法，该方法允许使用全细胞膜片钳记录来识别和深入分析小鼠犁鼻器官急性冠状组织切片中确定的感觉神经元群。

摘要

在大多数哺乳动物中，犁鼻器官 （VNO） 是一种化学感应结构，可检测异种和同种社会线索。犁鼻感觉神经元 （VSN） 表达来自至少三个不同化学感受器基因家族的特定类型的 G 蛋白偶联受体 （GPCR），从而能够灵敏和特异性地检测化学感应线索。这些家族包括 V1r 和 V2r 基因家族以及假定的化学感受基因的甲酰肽受体 （FPR） 相关序列 （Fpr-rs） 家族。为了了解犁鼻受体-配体相互作用和下游信号传导的生理学，必须确定每类特定 VSN 固有的生物物理特性。

这里描述的生理学方法允许使用转基因小鼠系 （Fpr-rs3-i-Venus） 识别和深入分析确定的感觉神经元群。然而，该方案的使用并不局限于该特定品系，因此可以很容易地扩展到其他转基因品系或野生型动物。

引言

大多数动物在很大程度上依赖于它们的化学感官与周围环境相互作用。嗅觉效力于寻找和评估的食物，躲避捕食者和定位合适的交配伙伴的重要作用。在大多数哺乳动物，嗅觉系统包括至少四个解剖学和功能上不同的外周子系统组成:主嗅觉上皮^1,2，所述Grueneberg神经节^3,4，马塞拉^5,6的间隔器官和犁鼻器。该VNO包括配件嗅觉系统（AOS），它在检测传达的身份，性别，社会地位和性状态^7-10信息化学信号主要作用的外周感觉结构。所述VNO位于鼻中隔右腭以上的基。在小鼠实验中，它是一个双边盲结束管封闭在一个软骨胶囊^11-13。该机构由两部分组成的月牙形内侧感觉上皮的lium该怀有VSNS和侧面的非感觉部分。两个上皮之间在于，其经由窄犁鼻管¹⁴连接至鼻 ​​腔粘液填充管腔。在非感觉组织的有大的横向血管提供了一种血管泵送机构，以促进通过负压^15,16相对较大，大多非易失性分子如肽或小蛋白质到VNO管腔的进入。该VNO的结构部件是在出生和器官在青春期¹⁷前不久达到成人的大小。然而，啮齿动物AOS是否已在少年的功能仍然是受争论^18-20。

VSNS由其上皮地点和受体的表达，他们的类型都区分。 VSNS显示与无髓鞘的轴突和凸出朝向腔和在微绒毛树突旋钮结束单个顶端树突双极形态。 VSN斧附件束状形成犁鼻神经留下的后背成尾端软骨胶囊，沿隔上升，通过筛板和项目的嗅球^{（AOB）21,22。}犁鼻感觉上皮由两层组成:根尖层位于更靠近腔侧和港口都V1R-和所有，但一种类型的FPR-RS-表达神经元。这些神经元共表达的G蛋白α亚单位_ģαi2和项目的AOB ^23-25 ​​的前部。感觉神经元位于更基底层明示或V2Rs FPR-RS1一起摹_αo和发送它们的轴突的AOB ^26-28后区。

犁鼻神经元是由相当小的化学信息素^{29-33（V1Rs）}或蛋白质化合物^{34-38（V2Rs），}该被分泌到各种体液，如尿，唾液和泪液可能激活^37,39-41 原位实验已经表明VSNS也由甲酰化肽和各种抗微生物/炎症联化合物^25,42激活。此外，异源表达的FPR-RS蛋白与免疫系统中表达的FPR共享激动剂光谱，说明作为检测器，用于在同种或变质食品来源²⁵疾病中的潜在作用（见附图^43）。

从根本上理解受体 - 配体的关系和下游信号通路在特定人群VSN是他们的基本生物物理特性在本地环境的详细评测。在过去，细胞信号的分析，大大从转基因动物，通过共表达的荧光标记蛋白^30,44-49标记定义的神经元群体中受益。在这个协议中，（FPR-RS3-I-金星）用来与一个荧光标记物一起表达FPR-RS3的转基因小鼠品系。这种方法举例说明如何使用这样的遗传修饰的小鼠品系进行急性冠状VNO组织切片使用单个神经元的膜片钳记录的光学可识别的细胞群的电生理分析。气压驱动的多管灌注系统的感官刺激和药物制剂可录制时快速，可逆和联络神经元的刺激或抑​​制作用。在片制剂全细胞记录允许固有特性，电压激活电导在细胞的天然环境中的详细分析，以及动作电位放电图形。

方案

所有的动物程序符合与用于实验目的动物保护（86/609 / EEC），并建议提出的欧洲实验动物科学协会联合会（FELASA）本地和欧盟的法规。既C57BL / 6小鼠和FPR-RS3-I-金星小鼠在室温下容纳在两种性别的群体与食物和水可随意获得一个12小时的光/暗周期。对于实验中使用两种性别的青少年（6-20周）。无明显的性别差异相关。

1.溶液的制备

1. 制备细胞外溶液S _1:4-（2-羟基-乙基）哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲的含有（以mM计）145 NaCl的，5氯化钾，1的CaCl _2，1 MgCl ₂的，10 HEPES胞外溶液; pH值= 7.3（用NaOH调节）;渗透压= 300毫渗量（以葡萄糖调整）。
2. 准备extracellu拉尔溶液S _2:卡波金含氧（95％O _2，5％的CO _2）含有（以mM计）125 NaCl的，25的NaHCO _3，5的KCl，1的CaCl _2，1用MgSO ₄细胞外溶液中，5 BES; pH值= 7.3;渗透压= 300毫渗量（以葡萄糖调整）。
3. 用于组织包埋制备4％低胶凝温度的琼脂糖溶液（S _3）:4％低胶凝温度的琼脂糖。溶解2克有磁力搅拌器琼脂糖低胶凝在50ml _S1的在一个100ml玻璃实验室瓶在一起。熔化琼脂糖，把瓶子在水浴（有盖未盖紧）在70℃下约20分钟或直至溶液变，同时搅拌透明。冷却并在42℃下保持熔融的琼脂糖在第二水浴中，直到进一步使用。
4. 制备细胞内溶液S _4:含有（以mM计）143的KCl，2 KOH，1 EGTA，0.3 _氯化钙 （游离Ca ²⁺ = 110纳米），10 HEPES，2 MgATP移液器溶液，1 NaGTP;pH值= 7.1（用KOH调整）;渗透压= 290毫渗量。
5. 修改/调整_S1的组合物，S ₂和S _4，根据各个实验设计（ 例如 ，药理学阻断剂以分离某些类型的电压激活电流的）。

2.准备工作区

1. 填充S ₂至少30分钟之前夹层，置于冰上的温度和pH值调节和连续含氧化合物溶液充氧片储存室。
2. 在录制与S ₂的设置填补切片灌流水库连续充氧。
3. 此前夹层，填充S ₂ vibratome室，安排室周围的碎冰块。或者，从充氧腔进入vibratome腔室转移备用冰冷的含氧的解决方案，并保持连续充氧。
4. 安排手术工具和消耗品。
5. 将冰凝胶包下解剖显微镜下，用纸巾盖住，以防止VNO组织冻结在盘子的底部。
6. 通过在70％乙醇和蒸馏水简要地漂洗和安装到vibratome干净的刀片。替换为每个切片会话。

3. VNO解剖和嵌入

1. 通过短暂暴露牺牲动物为CO ₂和使用锋利的手术剪刀杀头。注意:如从牺牲动物到把VNO胶囊在冰上时间是非常关键的，应尽量减少到小于2分钟。为了保持组织活力，在不到30分钟，同时嵌入完全剖分VNOS琼脂糖。
2. 除去大手术剪下颌。通过口腔进入并分别切断各边的下颌骨的骨骼和肌肉。
3. 放置头部的其余部分在大陪替氏培养皿倒置。
4. 拉远上颚和周围介质镊子鼻子获得对更好的访问的前端的皮肤门牙。
5. 使用骨剪刀剪去门牙的最大部分在延髓方向（ 图1A）一〜45°角。这将缓解去除鼻腔VNO胶囊。
   注意:不要切到牙根，以防止所述VNO胶囊的尖端损伤。
6. 抓住在其与介质钳子喙部刚性上腭和在一平面的角度（ 图1B）小心剥离背部在一块。
   注意:用冰冷的S ₂反复冲洗。
7. 使用微弹簧剪刀剪犁骨和下颚尖之间的骨性融合。插入有指向从所述VNO向外远离并小心切骨在左侧和右侧横向于VNO胶囊两个小步骤的前端的弯曲部的剪刀的提示。
8. 要删除VNO胶囊，使用微弹簧剪刀在尾椎部位通过犁骨切，小心地提起犁骨出了n个荒漠和半荒漠腔采用中等镊子。立即在其中夹层的其余步骤将执行一个冰凝胶袋所述VNO传送到一个​​小的培养皿立体显微镜下。
9. 冲洗所述VNO在冰冷的S ₂的少量，以防止组织干燥。
10. 分离，通过抓取犁骨的中等钳后面包含VNO软组织软骨胶囊。这样既VNOS之间的分裂变得可见（ 图1D _i）该胶囊为背视图的位置。
11. 使用细镊子的顶端，同时保持犁骨在后部部分牵制从中央骨分开两个软骨VNO胶囊。
    注:仅在软骨胶囊的边沿使用镊子，并非常小心，不要通过刺穿软骨的微妙感觉上皮很容易损坏。
12. 一旦两个VNOS分离，开始除去软骨包封冷杉ŤVNO。
13. 抓住一个细镊子胶囊的顶部边缘和分裂出来将先前连接到犁骨（内侧）的软骨墙。
14. 以除去剩余软骨转动VNO其弯曲侧侧到培养皿的底部，并安全地使用镊子牵制软骨一侧。小心移动从背面侧的第二细镊子在软骨和VNO之间一个非常平坦角度松开组织和软骨之间的连接。
15. 通过举办它在它的尾部尖，以避免损坏感觉上皮慢慢剥离VNO由软骨了。
16. 一旦VNO从胶囊杠杆，确保消除所有剩余的小部分软骨软骨的任何剩余部分将在切片过程琼脂糖周围分离组织。
17. 将冰冷的S ₂上的第一剖分VNO小降，以防止组织损伤。在侧面WIL大血管升可见这表明机构仍然完好无损，并解剖（ 图2A _II）的过程中未严重受损。在情况下，血管损坏了，但它仍然是值得与只要整体形态不明确受损切片VNO进行。
18. 立即解剖第二VNO。
19. 要嵌入VNOS，请在两个小培养皿融化的第₃轮辋（42℃储存在水浴见1.3）。
20. 慢着用细镊子更广泛的尾端的VNO以避免感官上皮损伤。
21. 沉浸所述VNO在琼脂糖和它水平地来回移动数次以除去细胞外溶液的膜，以及从它的表面上的任何气泡。
22. 在VNO与尾椎尖端对着盘底部垂直位置。而是直接镊子捏VNO的，通过移动紧密proximi镊子尖调整方向TY到VNO。
    注:嵌入在导向是至关重要的，因为它在实验过程中决定切面和获取的感觉神经元。
23. 放置在凝胶冰包菜肴，等到琼脂糖凝固。
    注意:不要更改VNO方向一旦琼脂糖已经开始凝固，因为这会从周围的琼脂糖分离组织。

4.冠状VNO组织切片

1. 用小铲从小碟成一个大培养皿的盖子去掉琼脂糖块，翻转琼脂糖倒挂离开VNO的朝上的尾尖端。
2. 切割块到使用外科手术刀（3-4毫米在尖端，在底部8-10毫米）一个金字塔形。注意不要损坏包埋组织。
3. 使用超级胶水金字塔形块固定到vibratome样品板的中心，并且等待约1分钟为胶完全干燥。
4. 检体板传送到切片Çhamber并准备第二VNO，因此。保持板与第二样本在4℃下直到使用。
5. 使用振动切片机具有以下设置:厚度:150-200微米;速度:3.5金= 0.15毫米/秒;频率:7.5 AU = 75赫兹。转移切片补氧室，直到使用后解剖显微镜下检查短暂形态切片。片可以保持几个小时。

5.单细胞的电生理记录

1. 对录音，使用配有浸水的目标，Dodt或红外线微分干涉对比（IR-DIC），和落射荧光以及一个冷却的CCD相机直立固定阶段显微镜。对于数据采集，利用膜片钳放大器，头部阶段，AD / DA接口板和PC（包括录音软件）。
2. 准备10-20补丁移液器（4-7MΩ）股票。从硼硅玻璃毛细管拉吸管（1.50 mm外径/0.86毫米ID）全光照GA微量拉马和火抛光用microforge。
   注:修补相当小VSNS时火焰抛光的枪头是至关重要的。这将有助于防止在为了得到高电阻密封施加负压时破裂细胞膜。抛光移液器开场后应为约1微米。
3. 保持移液器在吸存储罐，以防止损坏和灰尘堆积，直到使用。
4. 通过填充液水库，并根据实验设计油管准备灌注系统。
   注意:从管完全，因为它们会强烈地电生理记录干扰除去气泡。
5. 调整压力达到〜3个毫升/分钟流动。
   注意:高的压力将导致电生理记录的组织切片的运动，以及终止。
6. 转移VNO切片成像室，并使用0.1毫米厚的SYNT有线不锈钢锚固定切片位置hetic纤维（ 图2B - C）。
   注意:不要用合成纤维的一个线程，而是周围的切片琼脂糖覆盖组织切片。
7. 转移成像室通过一个浴应用在室温下记录的设置和不断superfuse片含氧S _2。
8. 调节吸入毛细管到溶液的表面上创造的浴溶液恒定交换缓慢吸入。调整8合1多管"灌注铅笔"上方，靠近到包含血管（ 图^2C，3A）50所述VNO切片的非感觉的一部分。这将是有益的安排灌注铅笔和记录吸管是从面向相反方向的切片。
9. 连接参考电极，并使用L形琼脂桥（填充用150mM KCl）中浴溶液。
10. 装满吸液S ₄补丁吸管。
11. 安装在连接到头部阶段氯化银涂覆膜片电极移液器没有刮掉涂层和附加牢固。
12. 应用微正压（约1ml在10毫升的塑料注射器），以补丁吸管再入浴。
13. 降低吸移管成使用微操纵器足够远的浴，以便能够浸入目标没有击中它（ 图2D）。
14. 监视使用连接到头部阶段电软件吸管电阻（R _点子 ，4-7兆欧之间）。
    注:若R是_PIP <4MΩ玻璃针尖断裂。若R _点子 > 10兆欧，尖端是最有可能堵塞和吸移管必须更换。
15. 可视化VNO切片用红外线优化微分干涉对比（DIC）的CCD摄像头，并使用荧光照明识别FPR-RS3-I-金星表达细胞（或类似标记的神经元）和适当的过滤立方体。
16. 聚焦和取决于实验设计目标的荧光或非荧光的细胞。
17. 接近细胞体，使用最高灵敏度手轮。由于正压，一旦枪头非常接近在细胞胞体膜的小凹痕变得可见。
18. 释放正压和施加轻微的负压力在细胞膜吸，以获得一个高电阻密封（1-20GΩ）。应用短期和温和的吸力破坏细胞膜，并建立全细胞配置。
19. 实验过程中监控接入阻力不断。
    注意:只有包括神经元表现出小而稳定的接入电阻（R _输入 ≤3％;变化<在实验过程中20％）为分析。

结果

深入了解所定义的细胞群的生物物理和生理性能，我们执行鼠标VNO（ 图1 - 2）的急性冠状组织切片。解剖后，切片可为几个小时保持在冰冷的含氧胞外溶液（S _2）。在录音设置，用新鲜的氧合液不断地交流（ 图2D），确保整个实验过程中组织活力。我们在这里使用的转基因小鼠模型（FPR-RS3-I-金星）。 VSNS在该菌株共表达的荧光标记蛋白与FPR-RS3，所述FPR-RS基因家族（ 图3）使一个限定的感觉神经元的人口的光学识别的原型成员。电生理学记录提供装置，用于在单细胞水平的深入分析。例如，在电压钳进行电压 - 门控电流分析模式（ 图4A - B）。分离出特定类型的离子电流，切片灌流具有药理剂如TTX以抑制电压门控Na ⁺电流（ 图4A）或硝苯地平阻断电压门控L-型Ca

讨论

该VNO是化学感受结构检测信息素。迄今为止，大多数犁鼻受体保持为仅少数受体 - 配体对已确定要deorphanized。其中，V1rb2被描述由男性泌尿信息素的2-庚酮³⁰可以具体地激活，V2rp5于由男性具体信息素ESP1 ⁵⁷以及V2r1b和V2rf2由MHC肽激活SYFPEITHI激活⁴⁸和SEIDLILGY ⁵⁸分别。理解受体 - 配体的关系及信号转导的先决条件是在天然环境中定义VSN种群的生物物理特性的知识。无源和有源膜性能，电压门控离子电导和动作电位放电模式定义的手段和程度受体神经元响应化学感受刺激。在急性组织切片电生理记录，特别是，谁勒细胞的膜片钳记录提供一种优良的方法非常详细分析这些特性。

在组织切片成功的，可靠的生理录音中关键的一步是准备本身。为了最大限度地提高时间跨度进行实验，组织必须切片和解剖后立即转移到冰冷的含氧的解决方案。随后，切片可以保持每个实验日细胞的大量的几个小时，允许分析。这需要一些实践以减少时间解剖，在不到30分钟嵌入一个动物的两个VNOS。在这之后，一个有经...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>化学品
琼脂糖（低胶凝温度）	PeqLab	35-2030
ATP （Mg-ATP）	Sigma-Aldrich	A9187
双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸 （BES）	Sigma-Aldrich	B9879
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016
乙二醇四乙酸 （EGTA）	Sigma-Aldrich	E3889
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
GTP （Na-GTP）	Sigma-Aldrich	51120
（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES）	Sigma-Aldrich	H3375
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	03564
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045
名称	公司	目录号	评论
手术工具和耗材
大培养皿，90 mm	VWR		斩首，VNO 胶囊解剖
培养皿，	VWR		盖，用于包埋琼脂糖的培养皿
锋利的大手术剪刀	精细科学工具		斩首，去除下颌
强壮的骨剪刀	精细科学工具		切割门牙
中等镊子，杜蒙镊子 #2	精细科学工具		去除皮肤和上颚
微型弹簧剪刀，8.5 厘米，弯曲，7 毫米刀片	精细科学工具		切割 VNO
两对细镊子，杜蒙镊子 #5	精细科学工具		用于从软骨胶囊中解剖 VNO
不锈钢刮刀	精细科学工具		，用于处理琼脂糖块和组织切片
手术刀将			琼脂糖块切割成金字塔形状
名称	Company	目录号	注释
设备
放大器	HEKA Elektronik	EPC-10
硅酸盐玻璃毛细管（外径1.50 mm/内径0.86 mm）	科学 产品
CCD相机	徕卡显微系统	DFC360FX
滤光片立方体，激发：BP 450-490，抑制：LP 515	徕卡显微系统	I3
荧光灯	徕卡显微系统	EL6000
热板磁力搅拌器	Snijders	34532
Microforge	Narishige	MF-830
显微作器设备	路易格斯 &Neumann	SM-5
微量移液器拉拔器，立式两步法	Narishige	PC-10
显微镜	徕卡显微系统	CSM DM 6000 SP5
噪声消除器 50/60 赫兹 （HumBug）	探索科学
目标	徕卡显微系统	HCX APO L20x/1.00 W
示波器	Tektronik	TDS 1001B
渗透压计	Gonotec	Osmomat 030
灌注系统 8 合 1	AutoMate Scientific
pH 计 5 个简单的	梅特勒托利多
移液器储存罐	World Precision Instruments	e212
记录室	路易格斯 &Neumann	Slice 迷你腔
室 剃须刀片	Wilkinson Sword GmbH	Wilkinson Sword Classic
氧化切片储存室;替代商业腔室是： 例如 、BSK1 脑切片保持器 （Digitimer） 或预室 （BSC-PC;Warner Instruments）	定制
体视显微镜	Leica Microsystems	S4E
触发接口	HEKA Elektronik	TIB-14 S
振动切片机	徕卡显微系统	VT 1000 S
水浴	梅默特	WNB 45