本文介绍了一种生理学方法，该方法利用全细胞膜片钳记录技术，在小鼠犁鼻器急性冠状组织切片中对特定感觉神经元群体进行鉴定和深入分析。
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本文内容
摘要
摘要
在大多数哺乳动物中，犁鼻器（vomeronasal organ, VNO）是一种化学感受结构，能够检测种间和种内的社会信号。犁鼻感觉神经元（VSNs）表达一种特定类型的G蛋白偶联受体（GPCR），该受体来自至少三个不同的化学感受器基因家族，从而实现对化学信号的高灵敏度和特异性检测。这些家族包括V1r和V2r基因家族，以及甲酰肽受体（formyl peptide receptor, FPR）相关序列（Fpr-rs）这一假定的化学感受器基因家族。为了理解犁鼻受体与配体相互作用及其下游信号转导的生理机制，明确每类特定VSNs所固有的生物物理特性至关重要。
本文所述的生理学方法可利用转基因小鼠品系（Fpr-rs3-i-Venus）对特定的感觉神经元群体进行鉴定和深入分析。然而，该实验方案的应用并不局限于这一特定品系，因此可轻松拓展至其他基因修饰品系或野生型动物。
引言
大多数动物在与周围环境互动时，高度依赖其化学感觉。嗅觉在寻找和评估食物、躲避捕食者以及定位合适的交配对象方面发挥着至关重要的作用。在大多数哺乳动物中，嗅觉系统至少包含四个在解剖结构和功能上相互独立的外周亚系统：主嗅上皮1,2、格吕内贝格神经节3,4、马泽拉鼻中隔器官5,6以及副嗅器（犁鼻器）。副嗅器（VNO）构成了副嗅觉系统（AOS）的外周感觉结构，主要负责检测传递个体身份、性别、社会等级和性状态等信息的化学信号7-10。副嗅器位于鼻中隔基部，紧邻上颚上方。在小鼠中，它是一个被软骨囊包裹的双侧盲端管状结构11-13。该器官包括一个新月形的内侧感觉上皮，其中含有副嗅觉感觉神经元（VSNs），以及一个位于外侧的非感觉部分。两个上皮之间是一个充满黏液的腔隙，通过狭窄的犁鼻器管与鼻腔相连14。非感觉组织中的一条大型外侧血管提供了血管泵机制，通过负压促进相对较大的、主要为非挥发性分子（如肽类或小分子蛋白质）进入副嗅器腔15,16。副嗅器的结构成分在出生时即已存在，并在青春期前不久达到成体大小17。然而，啮齿类动物的副嗅觉系统在幼年期是否已具备功能，目前仍存在争议18-20。
犁鼻神经元（VSN）根据其上皮位置及其表达的受体类型而有所区分。VSN具有双极形态，包含一条无髓鞘的轴突和一条单一的顶....
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方案
所有动物实验均符合欧盟关于实验用途动物保护的法律法规（指令 86/609/EEC）以及欧洲实验动物科学联合会（FELASA）提出的相关建议。C57BL/6 小鼠与 Fpr-rs3-i-Venus 小鼠均按性别分组饲养，环境温度为室温，光照周期为 12 小时明/12 小时暗，自由供应食物和水 随意摄取实验中使用了任一性别的年轻成年个体（6-20周龄），未观察到明显的性别依赖性差异。
1. 溶液配制
- 配制细胞外液 S1：含有（单位：mM）145 NaCl、5 KCl、1 CaCl₂ 的4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲细胞外液2，1 MgCl2，10 HEPES；pH = 7.3（用NaOH调节）；渗透压 = 300 mOsm（用葡萄糖调节）。
- 配制细胞外液 S2：碳合气-氧合（95% O₂，5% CO₂）2，5% CO₂2) 细胞外液含有（单位：mM）125 NaCl、25 NaHCO₃3，5 KCl，1 CaCl2，1 MgSO₄4，5 mM BES；pH = 7.3；渗透压 = 300 mOsm（用葡萄糖调节）。
- 制备4%低熔点琼脂糖溶液（S3用于组织包埋的试....
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结果
为了深入了解特定细胞群体的生物物理与生理特性，我们对小鼠VNO进行急性冠状组织切片图1-2）。解剖后，脑片可保存在冰冻的含氧细胞外溶液（S2) 数小时。在记录装置中，持续更换新鲜的含氧溶液（图 2D) 确保整个实验过程中组织的活性。我们在此采用一种转基因小鼠模型（FPR-rs3-i-Venus）。该品系中的VSN同时表达一种荧光标记蛋白和FPR-rs3，后者是 FPR-rs 基因家族图3）从而实现对特定感觉神经元群体的光学鉴定。电生理记录为单细胞水平的深入分析提供了手段。例如，电压门控电流的分析是在电压钳模式下进行的（图4A-B）。为了分离特定类型的离子电流，切片用河豚毒素（TTX）等药理学试剂进行灌流，以抑制电压门控性Na⁺通道+ 电流（图 4A）或硝苯地平以阻断电压门控L型.......
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讨论
副嗅器（VNO）是一种能够检测化学信号分子的化学感受结构。迄今为止，大多数犁鼻器受体仍为“孤儿受体”，因为已明确的受体-配体配对数量极少。在已知的配对中，V1rb2被报道可特异性地被雄性尿液信息素2-庚酮30激活，V2rp5可被雄性特异性信息素ESP157激活，而V2r1b和V2rf2则分别被主要组织相容性复合体（MHC）肽段SYFPEITHI48和SEIDLILGY58激活。要理解受体与配体之间的关系以及信号转导机制，必须首先了解在天然环境中特定犁鼻感觉神经元（VSN）群体的生物物理特性。被动和主动膜特性、电压门控离子电导以及动作电位发放模式，决定了感受器神经元对化学感觉刺激的响应方式和响应程度。在急性组织切片中进行的电生理记录，尤其是全细胞膜片钳记录，是深入分析这些特性的优良方法。
在组织切片中成功且可靠地进行生理记录，其关键步骤在于切片制备本身。为了最大限度延长实验操作的时间，组织在分离后必须立即切成薄片，并迅速转移至冰浴的含氧溶液中。此后，切片可保存数小时，从而允许在每个实验日分析大量细.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Ivan Rodriguez 和 Benoit von der Weid 构建了 FPR-rs3-i-venus 小鼠品系，并感谢他们富有建设性的批评和富有成效的讨论。本工作由大众基金会（I/83533）、德国研究基金会（SP724/6-1）以及德国联邦和州政府卓越计划资助。MS 是大众基金会的 Lichtenberg 讲席教授。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂 | |||
| 琼脂糖（低凝胶温度） | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP（Mg-ATP） | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| 双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸（BES） | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 乙二醇四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP（Na-GTP） | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES） | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| 氢氧化钾 | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 手术器械与耗材 | |||
| 大培养皿，90 mm | VWR | 用于断头及犁鼻器囊膜解剖 | |
| 小培养皿，35 mm | VWR | 用作犁鼻器解剖时的盖子，以及琼脂糖包埋用培养皿 | |
| 大型锋利手术剪 | Fine Science Tools | 用于断头及下颌骨去除 | |
| 强力骨剪 | Fine Science Tools | 用于剪切门齿 | |
| 中号镊子，Dumont #2 镊子 | Fine Science Tools | 用于去除皮肤和腭部组织 | |
| 微型弹簧剪，8.5 cm，弯曲，7 mm 刀片 | Fine Science Tools | 用于切除犁鼻器 | |
| 两对精细镊子，Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 用于从软骨囊中剥离犁鼻器 | |
| 小型不锈钢刮刀 | Fine Science Tools | 用于操作琼脂糖块和组织切片 | |
| 外科手术刀 | 用于将琼脂糖块切割成金字塔形状 | ||
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 设备 | |||
| 放大器 | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.50 mm / 内径 0.86 mm） | Science Products | ||
| CCD 相机 | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| 滤光立方体，激发：BP 450-490，截止：LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| 荧光灯 | Leica Microsystems | EL6000 | |
| 磁力搅拌加热板 | Snijders | 34532 | |
| 微电极拉制仪 | Narishige | MF-830 | |
| 显微操作装置 | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| 垂直双步式微电极拉制仪 | Narishige | PC-10 | |
| 显微镜 | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| 50/60 Hz 噪声消除器（HumBug） | Quest Scientific | ||
| 物镜 | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| 示波器 | Tektronik | TDS 1001B | |
| 渗透压仪 | Gonotec | Osmomat 030 | |
| 8通道灌流系统 | AutoMate Scientific | ||
| pH 计 five easy | Mettler Toledo | ||
| 移液器储存罐 | World Precision Instruments | e212 | |
| 记录用灌流槽 | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| 刀片 | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| 切片供氧储存槽；其他商用替代设备包括：例如，Digitimer 的 BSK1 Brain Slice Keeper 或 Warner Instruments 的 Pre-chamber (BSC-PC) | 定制 | ||
| 体视显微镜 | Leica Microsystems | S4E | |
| 触发接口 | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| 振动切片机 | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| 水浴锅 | Memmert | WNB 45 |
参考文献
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P.
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重印与许可
