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方法文章

小鼠犁鼻器急性组织切片中特定细胞群体的深入生理学分析

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DOI：

10.3791/54517

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2016年9月10日

 ,  , 
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II, RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

本文内容

摘要

本文介绍了一种生理学方法，该方法利用全细胞膜片钳记录技术，在小鼠犁鼻器急性冠状组织切片中对特定感觉神经元群体进行鉴定和深入分析。

摘要

在大多数哺乳动物中，犁鼻器（vomeronasal organ, VNO）是一种化学感受结构，能够检测种间和种内的社会信号。犁鼻感觉神经元（VSNs）表达一种特定类型的G蛋白偶联受体（GPCR），该受体来自至少三个不同的化学感受器基因家族，从而实现对化学信号的高灵敏度和特异性检测。这些家族包括V1r和V2r基因家族，以及甲酰肽受体（formyl peptide receptor, FPR）相关序列（Fpr-rs）这一假定的化学感受器基因家族。为了理解犁鼻受体与配体相互作用及其下游信号转导的生理机制，明确每类特定VSNs所固有的生物物理特性至关重要。

本文所述的生理学方法可利用转基因小鼠品系（Fpr-rs3-i-Venus）对特定的感觉神经元群体进行鉴定和深入分析。然而，该实验方案的应用并不局限于这一特定品系，因此可轻松拓展至其他基因修饰品系或野生型动物。

引言

大多数动物在与周围环境互动时，高度依赖其化学感觉。嗅觉在寻找和评估食物、躲避捕食者以及定位合适的交配对象方面发挥着至关重要的作用。在大多数哺乳动物中，嗅觉系统至少包含四个在解剖结构和功能上相互独立的外周亚系统：主嗅上皮1,2、格吕内贝格神经节3,4、马泽拉鼻中隔器官5,6以及副嗅器（犁鼻器）。副嗅器（VNO）构成了副嗅觉系统（AOS）的外周感觉结构，主要负责检测传递个体身份、性别、社会等级和性状态等信息的化学信号7-10。副嗅器位于鼻中隔基部，紧邻上颚上方。在小鼠中，它是一个被软骨囊包裹的双侧盲端管状结构11-13。该器官包括一个新月形的内侧感觉上皮，其中含有副嗅觉感觉神经元（VSNs），以及一个位于外侧的非感觉部分。两个上皮之间是一个充满黏液的腔隙，通过狭窄的犁鼻器管与鼻腔相连14。非感觉组织中的一条大型外侧血管提供了血管泵机制，通过负压促进相对较大的、主要为非挥发性分子（如肽类或小分子蛋白质）进入副嗅器腔15,16。副嗅器的结构成分在出生时即已存在，并在青春期前不久达到成体大小17。然而，啮齿类动物的副嗅觉系统在幼年期是否已具备功能，目前仍存在争议18-20。

犁鼻神经元（VSN）根据其上皮位置及其表达的受体类型而有所区分。VSN具有双极形态，包含一条无髓鞘的轴突和一条单一的顶端树突，该树突朝向管腔延伸，并以微绒毛状树突结节终止。VSN的轴突聚集成束形成犁鼻神经，从软骨囊的背尾端穿出，沿鼻中隔上行，穿过筛板，投射至副嗅球（AOB）21,22。犁鼻感觉上皮由两层组成：靠近管腔侧的顶端层含有表达V1R以及除一种以外所有类型FPR-rs的神经元。这些神经元共表达G蛋白α亚基Gαi2，并投射至AOB的前部23-25。位于更深层基底层的感觉神经元则表达V2R或FPR-rs1，并与Gαo共同表达，其轴突投射至AOB的后部区域26-28。

犁鼻器神经元可能被相对较小的化学信号分子激活29-33 （V1Rs）或蛋白质类化合物34-38 （V2Rs）会分泌到尿液、唾液和泪液等各种体液中37,39-41. 原位 实验表明，VSNs 也可被甲酰化肽以及多种与抗菌和炎症相关的化合物激活25,42此外，异源表达的FPR-rs蛋白与免疫系统中表达的FPRs具有相似的激动剂谱，表明其可能在识别同种个体的疾病状态或腐败食物来源中发挥检测作用。25 （参见参考文献）43).

要理解特定VSN群体中受体-配体关系及其下游信号级联反应，关键在于对其在天然环境中的基本生物物理特性进行详细评估。过去，细胞信号传导的研究极大地受益于基因修饰动物，这类动物通过共表达荧光标记蛋白来标记特定的神经元群体30,44-49。在本实验方案中，使用了一种转基因小鼠品系，该品系共同表达FPR-rs3和一种荧光标记蛋白（Fpr-rs3-i-Venus）。该方法展示了如何利用此类基因修饰小鼠品系，在急性冠状面VNO组织切片中，通过单细胞膜片钳记录技术对光学可识别的细胞群体进行电生理分析。采用气压驱动的多通道灌流系统递送感觉刺激物和药理学试剂，可在记录过程中实现快速、可逆且局部的神经元刺激或抑制。脑片制备中的全细胞记录技术使得能够在细胞的天然环境中对其内在特性、电压激活的电导以及动作电位发放模式进行细致分析。

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方案

所有动物实验均符合欧盟关于实验用途动物保护的法律法规（指令 86/609/EEC）以及欧洲实验动物科学联合会（FELASA）提出的相关建议。C57BL/6 小鼠与 Fpr-rs3-i-Venus 小鼠均按性别分组饲养，环境温度为室温，光照周期为 12 小时明/12 小时暗，自由供应食物和水 随意摄取实验中使用了任一性别的年轻成年个体（6-20周龄），未观察到明显的性别依赖性差异。

1. 溶液配制

  1. 配制细胞外液 S1：含有（单位：mM）145 NaCl、5 KCl、1 CaCl₂ 的4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲细胞外液2，1 MgCl2，10 HEPES；pH = 7.3（用NaOH调节）；渗透压 = 300 mOsm（用葡萄糖调节）。
  2. 配制细胞外液 S2：碳合气-氧合（95% O₂，5% CO₂）2，5% CO₂2) 细胞外液含有（单位：mM）125 NaCl、25 NaHCO₃3，5 KCl，1 CaCl2，1 MgSO₄4，5 mM BES；pH = 7.3；渗透压 = 300 mOsm（用葡萄糖调节）。
  3. 制备4%低熔点琼脂糖溶液（S3用于组织包埋的试剂：4% 低凝胶温度琼脂糖。将 2 g 低凝胶温度琼脂糖溶解于 50 ml S 中1 在100 ml玻璃实验瓶中加入磁力搅拌子。将瓶子置于70 °C水浴中（瓶盖不要完全封闭），搅拌约20分钟，直至琼脂糖完全溶解，溶液变为透明。随后冷却，并将熔化的琼脂糖置于42 °C的另一水浴中保温，待后续使用。
  4. 配制细胞内液 S4：移液管溶液（单位：mM）包含 143 KCl、2 KOH、1 EGTA、0.3 CaCl₂，用 HCl 调节 pH 至 7.2，并用蔗糖将渗透压调节至约 290 mOsm。2 （游离 Ca2+ = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP；pH = 7.1（用KOH调节）；渗透压 = 290 mOsm。
  5. 调整 S 的组成1，S2 和 S4 根据个体实验设计（例如药理学阻断剂以分离特定类型的电压激活电流）。

2. 实验室工作区准备

  1. 在解剖前至少30分钟，用S2填充供氧的切片储存室，并将其置于冰上以调节温度和pH值，同时持续供氧。
  2. 在记录装置中，用S2填充切片灌流的储液槽，并持续供氧。
  3. 解剖前，用S2填充振动切片机腔室，并在腔室周围放置碎冰。或者，将供氧腔室中备用的冰冻且已供氧的溶液转移至振动切片机腔室，并持续供氧。
  4. 准备手术器械和耗材。
  5. 将冰袋置于解剖显微镜下方，并用纸巾覆盖，以防止犁鼻器组织冻结在培养皿底部。
  6. 用70%乙醇和蒸馏水短暂冲洗剃刀刀片进行清洁，然后安装至振动切片机上。每次切片均需更换新刀片。

3. VNO 的分离与包埋

  1. 通过短暂暴露于 CO2 处死动物，随后使用锋利的手术剪进行断头。注意：从处死动物到将犁鼻器（VNO）囊泡置于冰上之间的时间至关重要，应尽量缩短至 2 分钟以内。为保持组织活性，需在 30 分钟内完成两侧完整解剖的 VNO 并包埋于琼脂糖中。
  2. 使用大型手术剪移除下颌。从口腔腔内进入，分别剪断两侧的下颌骨及肌肉。
  3. 将头部剩余部分倒置放入大培养皿中。
  4. 用中号镊子轻轻牵拉上颌及鼻尖周围的皮肤，以更好地暴露门齿区域。
  5. 使用骨剪以约 45° 角度向吻侧方向剪除门齿的大部分（图 1A）。此举有助于从鼻腔中取出 VNO 囊泡。
    注意：避免剪至牙齿根部，以防损伤 VNO 囊泡尖端。
  6. 用中号镊子夹住上腭的吻侧坚硬部分，以平缓角度小心地整体剥离（图 1B）。
    注意：反复用冰冻的 S2 冲洗。
  7. 使用微型弹簧剪剪断犁骨尖端与颌骨之间的骨性融合部分。将剪刀尖端插入，使其弯曲部分朝外远离 VNO，沿 VNO 囊泡左右两侧的小步进方式小心剪断骨组织。
  8. 为取出 VNO 囊泡，使用微型弹簧剪在尾侧部位剪断犁骨，并用中号镊子小心将犁骨从鼻腔中提起。立即将 VNO 转移至置于冰袋上的立体显微镜下的小培养皿中，后续解剖步骤将在该处完成。
  9. 用少量冰冻的 S2 冲洗 VNO，防止组织干燥。
  10. 用中号镊子夹住犁骨后部，分离包含 VNO 软组织的软骨囊。将囊泡调整为背侧朝上，使两侧 VNO 之间的分界清晰可见（图 1Di）。
  11. 用精细镊子的尖端将两侧软骨性 VNO 囊泡从中央骨组织上分离，同时用镊子固定犁骨后部使其保持固定。
    注意：仅在软骨囊边缘使用镊子，务必小心避免刺穿软骨，因敏感的感觉上皮极易受损。
  12. 当两侧 VNO 完全分离后，开始去除包裹第一个 VNO 的软骨。
  13. 用一把精细镊子夹住囊泡顶部边缘，剥离先前附着于犁骨（内侧）的软骨壁。
  14. 为去除残留软骨，将 VNO 弯曲的外侧朝下放置于培养皿底部，并用镊子牢固固定一侧软骨。将第二把精细镊子从后方以极平缓的角度插入软骨与 VNO 之间，小心松解组织与软骨的连接。
  15. 握住 VNO 的尾端，缓慢将其从软骨中剥离，避免损伤感觉上皮。
  16. 一旦 VNO 从囊中分离，务必清除所有残留的小块软骨，因任何残留软骨碎片均可能导致切片过程中组织从周围琼脂糖中脱落。
  17. 在第一个已解剖的 VNO 上滴加少量冰冻的 S2，以防止组织损伤。此时可见外侧一条较大的血管，表明器官仍保持完整，解剖过程中未发生明显损伤（图 2Aii）。若血管受损，只要整体形态未明显破坏，仍可继续进行 VNO 切片。
  18. 立即开始解剖第二个 VNO。
  19. 为包埋 VNO，将两个小培养皿均注满熔化的 S3 （置于 42 °C 水浴中保存；见 1.3）。
  20. 用精细镊子夹住 VNO 较宽的尾端，避免损伤感觉上皮。
  21. 将 VNO 浸入琼脂糖中，并水平前后移动数次，以去除其表面的细胞外液薄膜及任何气泡。
  22. 将 VNO 以尾端朝下垂直放置于培养皿底部。调整方向时，避免直接夹持 VNO，而应通过将镊子尖端靠近 VNO 来微调其位置。
    注意：包埋时的方向至关重要，因其决定了切片平面以及实验过程中对感觉神经元的可及性。
  23. 将培养皿置于冰袋上，静置直至琼脂糖完全凝固。
    注意：一旦琼脂糖开始凝固，切勿再调整 VNO 方向，否则会导致组织与周围琼脂糖分离。

4. 犁鼻器冠状组织切片

  1. 用小刮勺将琼脂糖块从小培养皿转移至大培养皿盖中，翻转琼脂糖块使其倒置，确保犁鼻器的尾端朝上。
  2. 使用外科手术刀片将琼脂糖块切成锥体形（顶端 3–4 mm，底部 8–10 mm），注意避免损伤包埋的组织。
  3. 用超级胶水将锥形琼脂糖块固定在振动切片机样品板的中央，静置约 1 分钟，待胶水完全干燥。
  4. 将样品板转移至切片室，并按相同步骤准备第二个犁鼻器样品；将含第二个样品的样品板置于 4 °C 保存，直至使用。
  5. 使用振动切片机进行切片，设置参数如下：切片厚度：150–200 µm；速度：3.5 a.u. = 0.15 mm/sec；频率：7.5 a.u. = 75 Hz。切片后，在解剖显微镜下快速检查切片形态，随后将切片转移至通氧孵育 chamber 中备用。切片可在数小时内使用。

5. 单细胞电生理记录

  1. 进行记录时，使用配备水浸物镜、Dodt梯度对比或红外微分干涉对比（IR-DIC）、落射荧光以及冷却CCD相机的直立固定式显微镜。数据采集需使用膜片钳放大器、前置放大头段、AD/DA接口板和一台PC（含记录软件）。
  2. 准备10–20根膜片钳移液管（4–7 MΩ）作为储备。使用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.50 mm，内径0.86 mm）中拉制移液管，并用微熔炉进行火焰抛光。
    注意：在对体积较小的VSNs进行膜片钳操作时，移液管尖端的火焰抛光至关重要。这有助于在施加负压以形成高阻封接时防止细胞膜破裂。抛光后移液管开口直径应约为1 µm。
  3. 将移液管存放于移液管储存罐中，以防损坏和积尘，直至使用。
  4. 根据实验设计，通过向溶液储液罐和管路中填充液体来准备灌流系统。
    注意：必须彻底清除管路中的气泡，因为气泡会严重干扰电生理记录。
  5. 调节压力以实现约3 ml/min的流速。
    注意：过高的压力会导致脑片移动并中断电生理记录。
  6. 将VNO脑片转移至成像室，并使用带有0.1 mm粗合成纤维丝的不锈钢锚固定脑片位置（图2B–C）。
    注意：合成纤维丝不应覆盖在脑片组织上，而应覆盖在脑片周围的琼脂糖上。
  7. 将成像室转移至记录装置，并通过浴式灌流在室温下持续用充氧的S2溶液灌流脑片。
  8. 调节吸液毛细管至液面处，以产生缓慢吸力，实现灌流液的持续交换。将8通道“灌流笔”（"perfusion pencil"）置于VNO脑片非感觉区域（含血管部分）上方并靠近该区域（图2C、3A）50。建议将灌流笔与记录移液管从相对方向对准脑片，以获得更佳效果。
  9. 使用L形琼脂桥（内含150 mM KCl）连接参考电极与浴液。
  10. 用移液管内液S4填充膜片钳移液管。
  11. 将移液管安装至连接前置放大头段的镀氯化银膜片电极上，注意避免刮损镀层，并牢固固定。
  12. 在移液管进入浴液前，施加轻微正压（约相当于10 ml塑料注射器上1 ml的推力）。
  13. 使用显微操作器将移液管降入浴液中，下降深度应足以使物镜浸入而不发生碰撞（图2D）。
  14. 通过连接至前置放大头段的电生理软件监测移液管电阻（Rpip，应在4–7 MΩ之间）。
    注意：若Rpip <4 MΩ，则玻璃尖端已断裂；若Rpip >10 MΩ，则尖端很可能堵塞，需更换移液管。
  15. 使用优化的红外微分干涉对比（DIC）和CCD相机观察VNO脑片，并通过荧光照明及合适的滤光立方体识别表达FPR-rs3-i-Venus的细胞（或类似标记的神经元）。
  16. 根据实验设计，聚焦并靶向荧光或非荧光细胞。
  17. 接近细胞体时，使用手轮以获得最大灵敏度。由于施加了正压，当移液管尖端接近细胞体时，可在细胞膜表面观察到微小凹陷。
  18. 释放正压并施加轻微负压，以吸入细胞膜，形成高阻封接（1–20 GΩ）。施加短暂而轻柔的吸力以破裂细胞膜，建立全细胞记录模式。
  19. 实验过程中持续监测接入电阻。
    注意：仅将表现出小且稳定的接入电阻（≤Rinput的3%；实验过程中变化 <20%）的神经元纳入分析。

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结果

为了深入了解特定细胞群体的生物物理与生理特性，我们对小鼠VNO进行急性冠状组织切片图1-2）。解剖后，脑片可保存在冰冻的含氧细胞外溶液（S2) 数小时。在记录装置中，持续更换新鲜的含氧溶液（图 2D) 确保整个实验过程中组织的活性。我们在此采用一种转基因小鼠模型（FPR-rs3-i-Venus）。该品系中的VSN同时表达一种荧光标记蛋白和FPR-rs3，后者是 FPR-rs 基因家族图3）从而实现对特定感觉神经元群体的光学鉴定。电生理记录为单细胞水平的深入分析提供了手段。例如，电压门控电流的分析是在电压钳模式下进行的（图4A-B）。为了分离特定类型的离子电流，切片用河豚毒素（TTX）等药理学试剂进行灌流，以抑制电压门控性Na⁺通道+ 电流（图 4A）或硝苯地平以阻断电压门控L型...

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讨论

副嗅器（VNO）是一种能够检测化学信号分子的化学感受结构。迄今为止，大多数犁鼻器受体仍为“孤儿受体”，因为已明确的受体-配体配对数量极少。在已知的配对中，V1rb2被报道可特异性地被雄性尿液信息素2-庚酮30激活，V2rp5可被雄性特异性信息素ESP157激活，而V2r1b和V2rf2则分别被主要组织相容性复合体（MHC）肽段SYFPEITHI48和SEIDLILGY58激活。要理解受体与配体之间的关系以及信号转导机制，必须首先了解在天然环境中特定犁鼻感觉神经元（VSN）群体的生物物理特性。被动和主动膜特性、电压门控离子电导以及动作电位发放模式，决定了感受器神经元对化学感觉刺激的响应方式和响应程度。在急性组织切片中进行的电生理记录，尤其是全细胞膜片钳记录，是深入分析这些特性的优良方法。

在组织切片中成功且可靠地进行生理记录，其关键步骤在于切片制备本身。为了最大限度延长实验操作的时间，组织在分离后必须立即切成薄片，并迅速转移至冰浴的含氧溶液中。此后，切片可保存数小时，从而允许在每个实验日分析大量细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Ivan Rodriguez 和 Benoit von der Weid 构建了 FPR-rs3-i-venus 小鼠品系，并感谢他们富有建设性的批评和富有成效的讨论。本工作由大众基金会（I/83533）、德国研究基金会（SP724/6-1）以及德国联邦和州政府卓越计划资助。MS 是大众基金会的 Lichtenberg 讲席教授。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
琼脂糖（低凝胶温度）PeqLab35-2030
ATP（Mg-ATP）Sigma-AldrichA9187
双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸（BES）Sigma-AldrichB9879
氯化钙Sigma-AldrichC1016
乙二醇四乙酸（EGTA）Sigma-AldrichE3889
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
GTP（Na-GTP）Sigma-Aldrich51120
(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）Sigma-AldrichH3375
氯化镁Sigma-AldrichM8266
氯化钾Sigma-AldrichP9333
氢氧化钾Sigma-Aldrich03564
氯化钠Sigma-AldrichS7653
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
氢氧化钠Sigma-AldrichS8045
名称公司货号备注
手术器械与耗材
大培养皿，90 mmVWR用于断头及犁鼻器囊膜解剖
小培养皿，35 mmVWR用作犁鼻器解剖时的盖子，以及琼脂糖包埋用培养皿
大型锋利手术剪Fine Science Tools用于断头及下颌骨去除
强力骨剪Fine Science Tools用于剪切门齿
中号镊子，Dumont #2 镊子Fine Science Tools用于去除皮肤和腭部组织
微型弹簧剪，8.5 cm，弯曲，7 mm 刀片 Fine Science Tools用于切除犁鼻器 
两对精细镊子，Dumont #5 镊子Fine Science Tools用于从软骨囊中剥离犁鼻器
小型不锈钢刮刀Fine Science Tools用于操作琼脂糖块和组织切片
外科手术刀用于将琼脂糖块切割成金字塔形状
名称公司货号备注
设备
放大器HEKA ElektronikEPC-10
硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.50 mm / 内径 0.86 mm）Science Products
CCD 相机Leica MicrosystemsDFC360FX
滤光立方体，激发：BP 450-490，截止：LP 515Leica MicrosystemsI3
荧光灯Leica MicrosystemsEL6000
磁力搅拌加热板Snijders34532
微电极拉制仪 NarishigeMF-830
显微操作装置 Luigs & NeumannSM-5
垂直双步式微电极拉制仪NarishigePC-10 
显微镜Leica MicrosystemsCSM DM 6000 SP5
50/60 Hz 噪声消除器（HumBug）Quest Scientific
物镜 Leica MicrosystemsHCX APO L20x/1.00 W
示波器TektronikTDS 1001B
渗透压仪 GonotecOsmomat 030
8通道灌流系统AutoMate Scientific
pH 计 five easyMettler Toledo
移液器储存罐World Precision Instrumentse212
记录用灌流槽 Luigs & NeumannSlice mini chamber
刀片Wilkinson Sword GmbHWilkinson Sword Classic
切片供氧储存槽；其他商用替代设备包括：例如，Digitimer 的 BSK1 Brain Slice Keeper 或 Warner Instruments 的 Pre-chamber (BSC-PC)定制
体视显微镜Leica MicrosystemsS4E
触发接口 HEKA ElektronikTIB-14 S
振动切片机 Leica MicrosystemsVT 1000 S
水浴锅 MemmertWNB 45

参考文献

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