斜向脊髓切片的制备用于腹根刺激

摘要

我们展示了如何制备幼鼠脊髓的斜切片。该制备方法可用于刺激腹根。

摘要

从脊髓切片进行电生理记录已被证明是一种研究从细胞到神经网络特性的宝贵技术。我们展示了如何制备出生后2至11天（P2–P11）幼鼠脊髓的可行斜切切片。在此制备过程中，运动神经元保持 其轴突从 腹侧根的 脊髓。刺激这些轴突可引发逆向传播的动作电位，侵入运动神经元 胞体并激活运动神经元 脊髓内的侧支。记录逆向动作电位是一种直接、明确且优雅的方法，可用于鉴定运动神经元的身份，其优势超过 其他鉴定方法。此外，刺激运动神经元的侧支是一种简单且可靠的方法，可用于激活脊髓内运动神经元侧支的靶细胞，例如其他运动神经元或闰绍细胞。在本方案中，我们展示了通过腹根刺激引发的运动神经元胞体的逆向传导记录以及闰绍细胞的兴奋。

引言

历史上，使用锐利电极进行的运动神经元记录是通过 体内 大型动物，例如 猫或大鼠¹ 或在离体的完整脊髓上 小鼠²20世纪80年代膜片钳记录技术的出现，要求直接接触运动神经元胞体，因为封接需在视觉引导下完成。因此，自20世纪90年代初以来，脊髓切片制备已得以顺利实现。³然而，早期的脑片制备通常无法实现对腹根的刺激。据我们所知，仅有两项研究报道了在横切脑片中成功刺激腹根，且均未使用小鼠获得^4,5.

本文介绍一种制备出生后小鼠（P2 - P11）具有活性的脊髓切片的技术，其中运动神经元 池 保留了 从腹根 发出的轴突。刺激腹根可引发逆行性动作电位，反向传入同一腹根发出的运动神经元 池 的胞体。此外，该刺激还可兴奋运动神经元的侧支靶点， 包括其他运动神经元^6-10以及Renshaw细胞^11-13。由于只有运动神经元 将轴突经由腹根传出，我们利用逆行性动作电位的记录作为生理学上简便且明确识别运动神经元的方法¹⁰。

除了使用可能缺乏包容性或具有误导性的电生理学和形态学方法外 确认运动神经元的标准 身份鉴定，近期关于脊髓运动神经元的研究也依赖于繁琐且....

方案

实验遵循欧洲指令（86/609/CEE 和 2010-63-UE）以及法国法律法规，并已获得巴黎笛卡尔大学伦理委员会的批准。

1. 脊髓切片制备

1. 每日或提前一天配制以下溶液。若需过夜保存，用95% O₂₂ 和5% CO₂ 并保存在密闭瓶中，冷藏。
   1. 制备低钠溶液 ⁺ 人工脑脊液（ACSF）： 3 mM KCl，1 mM NaH₂PO₄，230 mM 蔗糖，26 mM NaHCO₃₃，0.8 mM CaCl₂，8 mM MgCl₂，25 mM 葡萄糖，0.4 mM 抗坏血酸，1 mM Na-犬尿酸，2 mM Na-丙酮酸。用 95% O₂₂ 和5% CO₂ （pH 7.4）。由于Na-犬尿酸钠常难以溶解，务必购买材料表中列出的产品。
   2. 制备K-葡萄糖酸盐溶液： 130 mM K-葡萄糖酸盐，15 mM KCl，0.05 mM EGTA，20 mM HEPES，25 mM 葡萄糖，1 mM Na-犬尿酸盐，2 mM Na-丙酮酸盐，用KOH调节pH至7.4。
   3. 制备人工脑脊液（ACSF）：

结果

利用逆向动作电位确认运动神经元身份

细胞靶向

运动神经元位于腹角（在图2C中以红色显示）。从构成腹根的轴突束开始，向上追踪至轴突束完全散开，并开始出现较大的细胞（胞体长轴超过20 µm）。使用初始电阻为3至4 MΩ的电极，对形态圆润且健康的细胞进行全细胞记录。所用胞内液成分为：140 mM K-葡萄糖酸盐、6 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM EGTA、0.1 mM CaCl₂、4 mM Mg-ATP、0.3 mM Na₂GTP。用KOH将pH值调节至7.3，并通过添加蒸馏水将渗透压调整至285 - 295 mOsm。

讨论

脊髓的斜向切片非常重要，因为它能够在单个椎体节段上可靠且全面地实现对运动神经元池和闰绍细胞的单侧刺激。 且具有特异性的方式。此外，它还允许快速、优雅地 以及对记录到的运动神经元进行非模糊识别。接下来，我们将重点介绍 该方法的优势在于 与其他切片制备方法相比的技术优势，然后我们将重点强调 进行该操作时需避免的最常见错误。

大多数使用横切片的研究基于细胞的内在电学特性进行鉴定 ^3,14,15,29然而，这些特性在不同运动神经元池之间以及同一池内的不同运动神经元亚型（α、β和γ运动神经元）之间存在显著差异。³⁰）。因此，使用尺寸参数的研究很可能会排除较小的γ-运动神经元。另一方面，Cooper和Sherrington在1940年描述了一类存在于猴和猫腰段脊髓腹外侧灰质中的大型神经细胞，这类细胞具有交叉上行的轴突^31,32。此外，该结构还邻近运动神经元 胞体，他们注意到这些细胞在组织学上与运动神经元无异。最近一篇文章证实了这类细胞存在于小鼠中³³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Na-犬尿氨酸	ABCAM	ab120256	比其他品牌的溶解性更好
KCl	Sigma	P3911
NaH2PO4	Sigma	P5655
蔗糖	Sigma	S9378
NaHCO3	Sigma	S6014
CaCl2	G Biosciences	R040
MgCl2	Quality Biological	351-033-721
葡萄糖	Sigma	G5767
抗坏血酸	Sigma	A5960
Na-丙酮酸盐	Sigma	P2250
K-葡糖酸盐	Sigma	P1847
EGTA	Sigma	E3889
HEPES	Sigma	H4034
NaCl	Sigma	S9888
琼脂	Sigma	A9799
QX-314	Alomone	Q150
Mg-ATP	Sigma	A9187
CsOH	Sigma	232041
Na-GTP	Sigma	51120
葡糖酸	Sigma	G1951
氢氧化铯溶液	Sigma	232041
KOH	Sigma	P5958
万纳斯弹簧剪 - 2.5 mm	FST	15000-08	仅用于剪开硬脑膜，若用于剪骨可能造成损坏
刺激器	A-M Systems	Isolated Pulse Stimulator Model 2100
振动切片机	Campden	Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2