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方法文章

斜向脊髓切片的制备用于腹根刺激

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DOI：

10.3791/54525

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2016年10月13日

 , 
1Centre National de la Recherche Scientifique (UMR 8119), Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes

本文内容

摘要

我们展示了如何制备幼鼠脊髓的斜切片。该制备方法可用于刺激腹根。

摘要

从脊髓切片进行电生理记录已被证明是一种研究从细胞到神经网络特性的宝贵技术。我们展示了如何制备出生后2至11天（P2–P11）幼鼠脊髓的可行斜切切片。在此制备过程中，运动神经元保持 其轴突从 腹侧根的 脊髓。刺激这些轴突可引发逆向传播的动作电位，侵入运动神经元 胞体并激活运动神经元 脊髓内的侧支。记录逆向动作电位是一种直接、明确且优雅的方法，可用于鉴定运动神经元的身份，其优势超过 其他鉴定方法。此外，刺激运动神经元的侧支是一种简单且可靠的方法，可用于激活脊髓内运动神经元侧支的靶细胞，例如其他运动神经元或闰绍细胞。在本方案中，我们展示了通过腹根刺激引发的运动神经元胞体的逆向传导记录以及闰绍细胞的兴奋。

引言

历史上，使用锐利电极进行的运动神经元记录是通过 体内 大型动物，例如 猫或大鼠1 或在离体的完整脊髓上 小鼠220世纪80年代膜片钳记录技术的出现，要求直接接触运动神经元胞体，因为封接需在视觉引导下完成。因此，自20世纪90年代初以来，脊髓切片制备已得以顺利实现。3然而，早期的脑片制备通常无法实现对腹根的刺激。据我们所知，仅有两项研究报道了在横切脑片中成功刺激腹根，且均未使用小鼠获得4,5.

本文介绍一种制备出生后小鼠（P2 - P11）具有活性的脊髓切片的技术，其中运动神经元 池 保留了 从腹根 发出的轴突。刺激腹根可引发逆行性动作电位，反向传入同一腹根发出的运动神经元 池 的胞体。此外，该刺激还可兴奋运动神经元的侧支靶点， 包括其他运动神经元6-10以及Renshaw细胞11-13。由于只有运动神经元 将轴突经由腹根传出，我们利用逆行性动作电位的记录作为生理学上简便且明确识别运动神经元的方法10。

除了使用可能缺乏包容性或具有误导性的电生理学和形态学方法外 确认运动神经元的标准 身份鉴定，近期关于脊髓运动神经元的研究也依赖于繁琐且 耗时的 术后 临时的 染色16此类鉴定通常仅对记录的细胞样本进行。其他鉴定策略则依赖于 在运动神经元表达内源性荧光的转基因小鼠品系中17-19然而，在幼龄阶段，由于标记物的表达尚不稳定，或当研究本身已需使用转基因小鼠品系时，使用基因编码标记可能会存在困难。另一种方法是，从开始进行细胞记录时，即可对所有小鼠常规开展逆向传导的动作电位记录。自20世纪50年代以来，研究猫、大鼠和小鼠完整脊髓制备物的实验人员已可靠地应用了此类鉴定技术。1,2,20,21在理想条件下，我们能够从几乎所有记录到的运动神经元中诱发出逆行性动作电位。

此外，腹根刺激可可靠地兴奋其他运动神经元22,23 或其靶细胞，例如 Renshaw细胞10,24,25。本文展示了腹根刺激的应用，包括记录运动神经元胞体的逆向动作电位，以及兴奋Renshaw细胞。

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方案

实验遵循欧洲指令（86/609/CEE 和 2010-63-UE）以及法国法律法规，并已获得巴黎笛卡尔大学伦理委员会的批准。

1. 脊髓切片制备

  1. 每日或提前一天配制以下溶液。若需过夜保存，用95% O₂2 和5% CO2 并保存在密闭瓶中，冷藏。
    1. 制备低钠溶液 + 人工脑脊液（ACSF）： 3 mM KCl，1 mM NaH2PO4，230 mM 蔗糖，26 mM NaHCO₃3，0.8 mM CaCl2，8 mM MgCl2，25 mM 葡萄糖，0.4 mM 抗坏血酸，1 mM Na-犬尿酸，2 mM Na-丙酮酸。用 95% O₂2 和5% CO2 （pH 7.4）。由于Na-犬尿酸钠常难以溶解，务必购买材料表中列出的产品。
    2. 制备K-葡萄糖酸盐溶液： 130 mM K-葡萄糖酸盐，15 mM KCl，0.05 mM EGTA，20 mM HEPES，25 mM 葡萄糖，1 mM Na-犬尿酸盐，2 mM Na-丙酮酸盐，用KOH调节pH至7.4。
    3. 制备人工脑脊液（ACSF）： 130 mM NaCl，2.5 mM KCl，2 mM CaCl₂2，1 mM MgCl2，1 mM NaH2PO4，26 mM NaHCO₃3，25 mM 葡萄糖，0.4 mM 抗坏血酸，2 mM Na-丙酮酸盐。用 95% O₂2 和5% CO₂2 (pH 7.4)
    4. 在开始解剖之前，将2%琼脂溶解于80 ml K-葡萄糖酸盐溶液中，并保持温热 60 °C.
  2. 心脏内灌注
    1. 对出生后2至11天（P2至P11）的雌性和雄性小鼠进行此制备。
    2. 通过腹腔注射 0.1 ml 25 mM 戊巴比妥钠（50 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
    3. 使用针或胶带将小鼠仰卧固定在装有硅胶的大培养皿上。后续解剖操作均使用体视显微镜进行。
    4. 握住胸骨尖端，提起胸部，用精细剪刀剪断膈肌。随后剪开两侧肋骨，打开胸腔，以暴露心脏。
    5. 在用27G针头穿刺左心室之前，先剪开右心房。
    6. 用冰冻的低钠溶液灌注+ ACSF。30 秒后，低 Na+ 应观察到ACSF从心房流出。低钠含量可防止细胞产生动作电位，并减少解剖过程中的细胞死亡。
    7. 在解剖显微镜下持续将针头保留在心脏内，直至血液排尽后肝脏变为黄色。
  3. 脊髓解剖
    1. 将动物处死并取俯卧位。
    2. 快速去除背部的皮肤（图1A1）。在肩部做两个切口，并沿胸腔向下切开（图1A2然后尽可能在尾部区域的低位切断脊索，以将带有肋骨起始段的脊椎骨与动物下半部分分离。再次翻转动物体位，去除仍附着在肋骨上的内脏组织。
    3. 将脊柱转移至另一个较小的、盛有硅胶的培养皿中，并使用4枚昆虫针将脊柱固定为背侧朝上（图1A).
    4. 持续用通入碳合气的ACSF灌注动物（约 4 °C) 进行背侧椎板切除术时，从头端暴露脊髓（图1B）。操作时，将精细剪刀的尖端插入骨骼与脊髓之间，从头端开始逐段剪除骨骼，注意远离白质。使用镊子将已剪开的骨片向两侧交替拨开，以避免接触脊髓组织。图1B1).
    5. 使用最小的弹簧剪刀和镊子，提起硬脊膜，夹住硬脊膜的游离部分，在其两侧进行剪切，以避免剪刀损伤脊髓。沿头尾轴方向剪开。
      注意：硬脑膜是一种半透明的连续性膜；在此年龄段，软脑膜过于脆弱，在解剖和切片过程中易发生破损图1B2).
    6. 去除硬脑膜后，使用钝头的玻璃或塑料尖端轻轻将脊髓向左侧推动，使其位于半切脊柱所形成的沟槽左侧，然后从头侧开始，在背根和腹根进入脊髓处远端数毫米处（至少几毫米），切断右侧的腹根和背根， 图1B2).
    7. 在左侧重复上述操作，始终从头侧向尾侧进行。若为左利手，则先从左侧开始，再移至右侧。
  4. 琼脂包埋
    1. 将脊髓从脊柱中抽出。使用更细的昆虫针将脊髓固定，背面向上，并小心去除仍附着在其上的任何膜组织。图1C1).
    2. 清洁后，修剪两端（图1C2）。将一枚弯曲的昆虫针插入脊索的前部以操纵脊索，并记录其方向（图中箭头所示 图1C2然后将脊髓转移至冰浴的K-葡萄糖酸盐溶液中。 
      注意：该溶液模拟脑脊液的细胞内成分，可在运动神经元被切断后防止细胞因渗透压休克而死亡26.
    3. 当脊髓置于细胞内溶液中后，将装有琼脂的烧杯从干浴器中取出，并置于冰水混合物中冷却。
    4. 持续搅拌的同时测量温度。当温度达到 38 °C 将脊髓浸入，用昆虫针固定并使其头端朝下放置。确保脊髓尽可能保持平直，远离器壁，尾端略微向上。图1D1).
    5. 将烧杯放入冰水混合物中，以使琼脂尽快凝固。确保烧杯保持原位，且导线尽可能保持平直（图1D1).
  5. 切片
    1. 凝固后，以琼脂块底部与脊髓组织呈特定角度的方式切割含脊髓的琼脂块 35° 脊髓腰段的角度（箭头所示） 图1D2）。背侧应朝上，远离基部（图1D2).
      注意：此步骤是实验中的关键环节，用于维持运动神经元池与它们发出的腹根之间的连续性。
    2. 使用氰基丙烯酸酯胶水将组织块粘附于振动切片机的样品腔内。将其浸入K-葡萄糖酸盐溶液中，并加入冰冻的K-葡萄糖酸盐溶液冰浆以保持浴液低温（低于 2 °C).
    3. 切取 350 - 400 µm 腰段较厚的组织切片（可通过其弯曲度和较大直径识别）。在正确方向定位后（见1.4.1节），使用刀片从背侧向腹侧表面切割，并连续向头侧推进切片。通常可获得4–5个符合要求的切片，其腹根延伸长度达2 mm或以上。采用以下参数： 10° 角度、70 Hz 振动频率和 10 mm/min 切片速度。
  6. 孵育
    1. 将切片转移至ACSF中 34 °C约30分钟后，将切片冷却至室温，开始记录实验。

解剖过程与组织制备，一系列实验图像，生物学研究。
图1. 解剖过程
A1：去除背部皮肤以暴露脊柱。 A2：切断肩部和肋骨以分离脊柱。 B1：将脊柱固定在盛有硅胶的培养皿中（背侧朝上，尾侧朝左）。 B2：脊髓暴露并完成解剖后的状态。 C1：脊髓已分离（头侧朝左）。 C2：脊髓准备包埋（腹侧朝上，头侧朝左）。注意头侧使用了较细的昆虫针。 D1：脊髓置于琼脂烧杯中（头侧朝下，腹侧朝向底部）。 D2：含有包埋脊髓的琼脂块切面。注意脊髓与块基底部形成约35°角，以及腰膨大部位（箭头所示）。比例尺为1 cm。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 将切片放入孵育腔

注意：腹根的大小存在可变性。

  1. 预先准备一盒不同规格的移液管，其尖端直径范围为 40 至 170 µm。为制备吸附电极移液管，需准备多根具有长锥度的移液管。使用金刚石刀在不同位置进行切割，然后在解剖显微镜下用镊子轻敲尖端使其断裂。
  2. 将记录用的灌流室从记录显微镜上取下，并置于解剖显微镜下。
  3. 选择一个包含足够长度（2 mm 或更长）腹根的脑片，以便将其安装在吸附刺激电极上。将脑片调整至适当方向，使腹根朝上（图 2A），然后精细地切除腹根周围的琼脂，同时保留脑片其余部分周围的琼脂（图 2B）。
    注意：由于琼脂比脑片组织更坚硬，这样可使脑片固定线的线丝落在琼脂上而非脑片本身，从而避免固定装置损伤组织。确保脑片固定线的线丝位于运动神经元群上方（如 图 2C 中红色所示）。
  4. 将灌流室重新安装到显微镜上，并以 1 - 2 ml/min 的流速在室温（RT）下持续用人工脑脊液（ACSF）灌流记录室。使用一支充满 ACSF 并连接注射器的玻璃移液管，吸附其中一根腹根（图 2C 中箭头所示）。为了实现对腹根的有效刺激，移液管尖端必须与腹根紧密贴合。刺激电极的一极应置于刺激电极内，另一极则置于浴液中（或连接至膜片钳电极的参比电极）。
  5. 对目标细胞类型进行膜片钳记录，并按照先前所述方法记录腹根刺激所产生的效应10。
    1. 此处使用放大器进行数据采集。全细胞记录信号在 3 kHz 条件下滤波，以 10 kHz 进行数字化采样，并在电流钳模式下补偿桥式电阻。

组织学染料渗透，显示染色技术的组织横截面显微图像。
图 2. 腹根制备
A：腰段脊髓切片包埋于琼脂中，腹根朝上。B：腰段脊髓切片，腹根已从琼脂中游离出来。C：腰段脊髓切片，刺激电极紧密地放置在腹根周围（箭头所示）。注意在chrna2-Cre小鼠28与报告基因小鼠R26Tom 17杂交后代中表达红色荧光的Renshaw细胞的位置。比例尺为1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

利用逆向动作电位确认运动神经元身份

细胞靶向

运动神经元位于腹角（在图2C中以红色显示）。从构成腹根的轴突束开始，向上追踪至轴突束完全散开，并开始出现较大的细胞（胞体长轴超过20 µm）。使用初始电阻为3至4 MΩ的电极，对形态圆润且健康的细胞进行全细胞记录。所用胞内液成分为：140 mM K-葡萄糖酸盐、6 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM EGTA、0.1 mM CaCl2、4 mM Mg-ATP、0.3 mM Na2GTP。用KOH将pH值调节至7.3，并通过添加蒸馏水将渗透压调整至285 - 295 mOsm。

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讨论

脊髓的斜向切片非常重要，因为它能够在单个椎体节段上可靠且全面地实现对运动神经元池和闰绍细胞的单侧刺激。 且具有特异性的方式。此外，它还允许快速、优雅地 以及对记录到的运动神经元进行非模糊识别。接下来，我们将重点介绍 该方法的优势在于 与其他切片制备方法相比的技术优势，然后我们将重点强调 进行该操作时需避免的最常见错误。

大多数使用横切片的研究基于细胞的内在电学特性进行鉴定 3,14,15,29然而，这些特性在不同运动神经元池之间以及同一池内的不同运动神经元亚型（α、β和γ运动神经元）之间存在显著差异。30）。因此，使用尺寸参数的研究很可能会排除较小的γ-运动神经元。另一方面，Cooper和Sherrington在1940年描述了一类存在于猴和猫腰段脊髓腹外侧灰质中的大型神经细胞，这类细胞具有交叉上行的轴突31,32。此外，该结构还邻近运动神经元 胞体，他们注意到这些细胞在组织学上与运动神经元无异。最近一篇文章证实了这类细胞存在于小鼠中33

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Marin Manuel和Olivia Goldman-Szwajkajzer在拍摄照片过程中提供的帮助。作者还感谢Arjun Masukar和Tobias Bock对稿件的校对。本研究获得以下机构的经费支持：法国国家科研署（HYPER-MND，ANR-2010-BLAN-1429-01）、美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS，R01NS077863）、Thierry Latran基金会（OHEX项目）、法国肌病协会（资助编号16026）以及Target ALS，特此致谢。Felix Leroy曾获得 "合同制博士生" 来自巴黎高等师范学校（Cachan）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Na-犬尿氨酸ABCAMab120256比其他品牌的溶解性更好
KClSigmaP3911
NaH2PO4SigmaP5655
蔗糖 SigmaS9378
NaHCO3 SigmaS6014
CaCl2 G BiosciencesR040
MgCl2 Quality Biological351-033-721
葡萄糖 SigmaG5767
抗坏血酸 SigmaA5960
Na-丙酮酸盐 SigmaP2250
K-葡糖酸盐 SigmaP1847
EGTA SigmaE3889
HEPES SigmaH4034
NaClSigmaS9888
琼脂SigmaA9799
QX-314AlomoneQ150
Mg-ATPSigmaA9187
CsOHSigma232041
Na-GTPSigma51120
葡糖酸SigmaG1951
氢氧化铯溶液Sigma232041
KOHSigmaP5958
万纳斯弹簧剪 - 2.5 mm FST15000-08仅用于剪开硬脑膜，若用于剪骨可能造成损坏
刺激器A-M SystemsIsolated Pulse Stimulator Model 2100
振动切片机CampdenVibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2

参考文献

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