小分子结合蛋白的鉴定在天然细胞环境由活细胞光亲和标记

Summary

我们在这里描述了一种使用光亲和标记鉴定小分子结合蛋白的方法。该技术的优势在于靶蛋白的结合和共价标记发生在活细胞环境中，消除了细胞裂解时破坏天然蛋白质结构和结合条件的风险。

Abstract

鉴定小分子的分子靶标是了解其作用机制的一个具有挑战性但必要的步骤。虽然已经开发并使用了几种靶标鉴定方法来成功阐明各种小分子的结合蛋白，但这些技术存在缺点，使其不适合检测某些类型的小分子-靶标相互作用。特别是，依赖于天然细胞条件的非共价相互作用，例如其结构可能在细胞裂解时受到干扰的膜蛋白的相互作用，通常不适合基于亲和力的靶标鉴定方法。在这里，我们展示了一种方法，其中使用含有光不稳定基团的探针与活细胞环境中的小分子结合蛋白共价交联，从而可以检测和分离靶蛋白，而无需在细胞裂解后维持相互作用。该技术是研究生物学上具有未知机制的生物学有趣小分子的宝贵工具，无论是在基础生物学还是药物发现的背景下。

Introduction

生物活性的小分子基本上通过与相互作用并改变一个或多个"目标"的分子，最常见的蛋白质的功能，在小区工作。在药物发现中，当活性化合物是通过表型筛选发现，该化合物的分子靶（多个）的识别是关键的，不只是对于理解动作和化合物的潜在副作用的机制，但也潜在发现新的生物学基础的疾病模型，从而为新机制类治疗¹发展道路。虽然不要求目标识别的一种药物用于治疗，近年来出现了越来越认识到，新的候选药物更容易在临床试验中取得成功，并因此产生更好的投资回报，如果一个有效的目标是已知^2。因此，一直存在的方法用于鉴定小的兴趣日益增​​长分子靶蛋白。

一个经典的目标识别试验通常依赖于亲和纯化，其中感兴趣的小分子被固定在树脂并用全细胞裂解物，在这之后未结合的蛋白质被冲走，而其余的蛋白质被洗脱，并确定³温育。虽然这一技术已被用来鉴别许多小分子⁴的目标，它不适合作为用于几个原因的通用目标ID方法。首先，目标蛋白质必须保留在细胞裂解其天然构象，以保留其结合到小分子的能力。这可以是膜蛋白，其通常经历构象变化从它们的天然环境中取出后，或简单地聚合和溶液中沉淀出来尤其成问题。第二，小分子必须用化学方法以这样的方式，它可以固定到树脂改性，同时保持其与靶蛋白结合的能力。一旦被固定于树脂深结合口袋可能因此变得不可访问的小分子。第三，结合亲和力必须足够高，使得在洗涤步骤的相互作用被维持，使得低亲和力相互作用有挑战性的鉴定。如pH值，离子浓度，或其他内源性分子的存在第四，环境条件可在细胞内空间变化，并且有时会发生药物 - 靶相互作用的先决条件。因此，找到正确的条件，以允许和维持结合细胞外可能需要反复试验的一个显著量。

光亲和标记通过允许共价小分子和细胞的天然环境中的目标的结合规避这些问题。而不是固定的小分子要大笨重的树脂，在分子，而不是化学修饰安装两个小功能摹roups:一个光活化部分，其允许共价交联到靶蛋白时的光的特定波长照射，和一个报告基团，它允许待检测的靶蛋白，并随后分离。活细胞用的光亲和探针处理，探针结合和共价交联到靶蛋白，和探针 - 蛋白质复合物，然后分离完好。探针结合到靶的特异性由并联，其中过​​量的母体化合物的用于竞争远到靶蛋白的探针的结合进行竞争实验证明。

光亲和探针的设计和合成变化很大从一个小分子到另一个，并且不会在这个协议中支付;然而，关于这个问题的几个优秀的讨论已经发表^5-9。主要考虑的是，该探针保留母体化合物的生物活性，因此presumabLY结合相同靶（多个）。结构 - 活性关系（SAR）研究必须进行，以确定其中分子的部分可以在不活性的损失进行修改。多种不同化学基团的已被用作可光活化交联剂，包括diazirine，二苯甲酮和芳基叠氮化物，它们各自具有优点和缺点^10。同样地，也有已经用于分离探针结合蛋白多记者标记。报告基团可以是对自己的，功能如常用的生物素或荧光标记，或可能是需要的光交联步骤，其中有被小，因此不太可能损害生物活性¹¹的优点随后进一步官能的前体。

在这个协议中，我们已经使用含有diazirine光致团的光亲探针，以及用于报告基团的通过的Cu（Ⅰ）的附接末端炔-catalyzED叠氮炔夏普勒斯-胡伊斯根环（或点击）反应^12-15。特区研究，探针的设计和合成，以及这些研究的结果已被别处^16-18出版。

Protocol

注:此协议是改编自麦金农和汤顿¹⁰在活细胞中的使用。

1.培养细胞的制备

1. 制备无菌6厘米细胞培养皿为所需的样本数（见下文）。
   注:细胞的一个培养皿每个处理条件下使用，但如果需要更多的蛋白2或3菜肴每种条件进行制备和UV照射后组合。
   1. 制备的细胞中的至少3菜肴;阴性对照与DMSO只（D）中，只有探头治疗（P）和探头+竞争对手（C）。
   2. 任选地，准备4 ^个菜作为无紫外线控制，与探针进行处理，但不进行UV光。
      注意:如果多个竞争者分子进行测试，如感兴趣的小分子的不同的类似物，制备额外竞争者板是必要的。
2. HEK293T细胞添加到培养皿在4毫升培养基中。使用350万Ç每盘厄尔。
   注:应确定细胞的数目对于每个细胞类型，使得细胞在实验开始时几乎100％汇合，以达到最大的蛋白质产量。对于HUVEC，用每盘30万细胞。一个好的近似是一个融合的15厘米菜细胞的1/10。 HEK293T细胞应该在被培养的Dulbecco氏改良的Eagles培养基补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素。
3. 返回细胞培养培养箱中（37℃，5％CO _2）过夜。

2.细胞和光交联处理

1. 第二天，预等分下列药物入1.5ml微量管:
   1. 对于第一次治疗，加入4微升DMSO中至2管和4微升10毫竞争者（即未改性的母体化合物）的1管。
   2. 用于第二处理中，添加16微升的DMSO以1管和16微升的50＃181，M光亲探至2管。
      注:最佳浓度可能是不同的探针（见讨论）不同，但在200-500纳米之间，是一个很好的起点（这里我们使用200纳米）。竞争者的浓度应超过使探针至少20倍（这里我们使用10μM）的。 DMSO的终浓度应在所有平板相等，并应不超过0.5％（20微升体积）。
2. 使细胞板到细胞培养罩并且从步骤2.1.1添加预先等分的药物如下:吸1毫升培养基，再悬浮预等分药物在媒体上，并轻轻地加入它回到板降明智的。二甲基亚砜加入到二甲基亚砜（D）的板和探针（P）的板，和竞争添加到竞争（C）的板。返回所述板的培养孵化30分钟。
3. 在调暗培养罩灯，从步骤2.1.2添加-等分预探针来探测（P）和竞争（C）的板，并添加DMSO中的二甲基亚砜（D）的板，如上述。返回所述板的培养孵化1小时。
4. 在培育期间，请准备以下物品;冰托盘可以容纳所有的板块;冰冷的裂解缓冲液（PBS [pH为8.5] + 1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒[完整无EDTA，根据水中的50倍原液稀释]; 200微升/板）;离心管标记为D，P或C的每个的不同的处理条件下，在冰上。
5. 1小时培养结束前15分钟，成立了紫外灯（365纳米），在寒冷的房间，并打开它热身灯泡。
6. 与探针孵育1小时后，放置碗碟冰上。清洗细胞轻轻用5ml冰冷的PBS（pH 7.4）中以除去过量的探针。再覆盖用4ml冰冷的PBS中的细胞。
7. 将集中在冰袋上方的紫外灯在3厘米至最小化从灯加热单元的菜。照射3分钟。取下菜冰托盘并重复所有样品。
8. 一个压脚提升照射，从细胞吸出PBS并添加冰冷的PBS（pH为8.5）与蛋白酶抑制剂对各板的200微升。从使用橡胶刮刀，并转移到冰上预标记的微量离心管板分离细胞。
9. 加入SDS至0.4％的终浓度（10微升10％SDS的入250微升样品的）。
   注意:SDS粉是危险的。避免穿了鼻子和嘴口罩吸入SDS粉末。
10. 裂解的细胞通过超声处理该悬浮液为10个脉冲（输出1，占空比30％）和第二轮10的脉冲之前在冰上孵育1分钟。
11. 如果需要的话，除去2微升悬浮液并在光学显微镜下检查，以确保完全细胞裂解。
12. 沸腾的热板上设置为95℃5分钟，以完成细胞裂解和变性的所有蛋白质的样品。
13. 使用分光光度洗涤剂相容蛋白测定中，如第测定各样品中的蛋白质浓度ÈDC蛋白测定^19，根据制造商的说明，用设定在750纳米测量吸光度分光光度计。
14. 通过根据需要加入的PBS pH值8.5±0.4％SDS的正常化蛋白质浓度2.5毫克/毫升（或如果浓度低于2.5毫克/毫升，正常化到具有最低蛋白质浓度样品）（例如，如果样品是5在250微升毫克/毫升，加入250微升的PBS pH 8.5的0.4％的SDS，得到2.5毫克/毫升终浓度）。

3.附件荧光标签通过点击化学的标记蛋白的可视化

1. 除去将40μl细胞裂解物并转移到一个新的离心管中。保持其余裂解物与生物素 - 叠氮化物（步骤4）的反应。
2. 添加下列试剂依次是:0.2微升氟叠氮（1毫米原液在DMSO），0.58微升TCEP（100毫米股票在水中4当量的NaOH加入，新鲜制备）和3.38微升TBTA（1。在4 7毫米股票:叔丁醇到DMSO 1的比例）。旋涡混合。
3. 添加1.14微升的CuSO ₄ -5H ₂ O（50毫在水中）以开始反应。短暂涡旋并孵育在室温下在黑暗中30分钟。
4. 加入50μl2×SDS样品缓冲液以终止反应。此时，直接在SDS-PAGE凝胶上²⁰运行样品最好的结果，或在-20℃过夜如果需要存储。
5. 如果冷冻样品装载到凝胶之前，在95℃再加热5分钟。
   注:由于目标蛋白质的分子量通常在此阶段不公知的，最好是运行2凝胶具有不同的丙烯酰胺浓度（ 即 ，8％和15％），或宽分子量范围的梯度凝胶（即 4-15％），以确保完全分子量覆盖。
6. 当染料前沿到达凝胶的末端，继续运行凝胶额外5分钟，以确保所有的过量unreacte的ð氟叠氮化合物已经完全退出了凝胶。
7. 与DDH ₂ O的取出凝胶的容器和孵育10分钟，轻轻摇动，洗去所有多余的氟，叠氮化物。
8. 将凝胶在玻璃板上，并使用根据制造商的说明一台风荧光凝胶扫描仪扫描凝胶。

4.附生物素标记的通过点击化学的标记蛋白的亲和纯化

1. 从步骤3.1剩余裂解物，使用的最大量的蛋白质归一化之后，使得所有的样品是相同的体积（例如，如果标准化后到2.5毫克/毫升所得的样品体积是500，550，和600微升，使用500每微升）。
2. 通过加入50微升的高容量链霉琼脂糖珠，预洗涤2次，用PBS（pH 7.4）中预清除裂解物。孵育1小时在4℃轮换。
3. 沉淀通过离心珠在1000 xg离心3分钟。除去叔他上清液在冰上一个新的离心管并弃去珠。
4. 除去DMSO样品1-2％到标有"输入"的新管中。添加2×SDS样品缓冲液并储存的等效体积在-20℃。
5. 每500微升裂解液，添加下列试剂:1.38微升生物素 - 叠氮化物（10毫米股票DMSO），5.5微升TCEP，和32.5微升TBTA。旋涡混合。
6. 加入11微升_硫酸铜每500微升裂解液和旋涡简要-5H ₂ O。在室温下孵育30分钟。
7. 加冷却到-20℃的丙酮4样品体积。涡旋样品，并在-80℃孵育过夜以完全沉淀的蛋白质和除去未反应的生物素 - 叠氮化物。
8. 离心机在17000×g离心15分钟，在4℃下将样品以沉淀沉淀的蛋白质。
9. 完全吸出上清液，并在150μl的PBS（pH为7.4）+ 1％SDS通过超声处理resolubilize的蛋白质。
10. 添加600μl的PBS（pH 7.4）中，以SDS浓度稀释至0.2％。
11. 样品添加到30微升洗涤的预高容量链霉琼脂糖珠，并在4℃下孵育1小时以转动。
12. 沉淀通过离心珠在1000 xg离心3分钟。吸出含有未结合的蛋白，弃上清。
13. 1毫升洗涤缓冲液（400毫摩尔NaCl，50毫摩尔Tris，0.2％SDS，pH7.4）中添加到珠子和孵化在室温下用旋转5分钟。
14. 重复步骤4.12和4.13的3倍。
15. 从珠粒完全吸出洗涤缓冲液，并加入30微升2×SDS样品缓冲液中。
16. 孵育5分钟95℃的加热块上，以从珠释放的蛋白质。
17. 离心1分钟的珠粒在室温下以13000 xg离心。
    注意:在这一点上，可将样品储存在-20℃，直至准备好运行的SDS-PAGE。如果冷冻样品，在使用前在95℃下再加热5分钟。
18. 小心吸取了含有的蛋白质珠样品缓冲液，并加载到SDS-PAGE ^20（见下文重要的考虑因素）。珠可以保存如有必要，以后再沸腾。
    注:对于由银染色蛋白质检测，使用1mm厚的凝胶，得到更好的结果。如果频带要被切出质谱（MS）分析的银染凝胶，制备从无菌溶液新鲜的所有试剂，并在凝胶上采样之间留下一个空孔。为从探头车道切割每个频带，一个平行切片应从二甲基亚砜车道可采取使背景蛋白可以减去。对于通过蛋白质印迹蛋白的ID验证，这是至关重要的运行SDS-PAGE凝胶时也从步骤4.4加载的输入采样。
19. 遵循两种银染²¹或印迹²²检测靶蛋白（S）的标准协议。

Results

这里示出的结果与抗真菌药伊曲康唑，它的使用，已经出版¹⁶的光亲和性探针获得。这些结果表明使用活细胞光亲和标记技术在成功地识别的主要依他康唑结合蛋白作为35kDa的膜蛋白电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）。

上述方案是使用用于photolabeling和未修饰的伊曲康唑作为竞争分子的依他康唑的探针在HEK293T细胞中进行。如所述制备的样品后，他们为了通过分子量来分离蛋白进行SDS-PAGE。左侧分子量标记的单位是千道尔顿（kDa）的。第一线是DMSO对照样品（D）中，第二车道是探针的样品（P）和第三线是竞争样品（C）。区间p在DMSO专用线反感被认为是背景。在分析这些数据，请注意，特异性结合蛋白质应该是DMSO对照样品中不存在，本探针样品中和的竞争样品中降低。在这种情况下，主要的蛋白质带仅检测在探针样品的约35 kDa的带（ 图1和3），其通过质谱如VDAC1鉴...

Discussion

不同的方法来鉴定小分子的目标，大致可分为两类:自上而下，其中药物的细胞表型被用于基于其已知功能来缩小其潜在的目标，或自下而上，其中目标通过化学或遗传方法³直接识别。自上而下或表型的研究可以识别受药物的某些细胞过程（ 例如 ，转录/翻译/ DNA合成，细胞周期阻滞，信号通路的激活/禁止等 ）可能背后的小分子的最终表型，这帮助的潜在目标的列表缩小到参与这些过程的蛋白。然而，自上而下的方法的一个主要缺点是，它依赖于什么已经知道关于这些方法中，并且因此被偏压针对其功能尚未表征或未被先前描述参与目标在给定的过程。

自下而上的方法，通过直接识别目标以公正的方式规避了这一问题。这可通过遗传方法来完成;例如，通过筛选一个shRNA文库为，或通过分离耐药细胞系和使用基因组测序，以确定哪些基因含有突变¹赋予对药物的抗性或过敏击倒细胞系。这些类型的实验可以识别相关的药物的活性关键的蛋白质或通路，但不一定证明直接结合到所识别的蛋白质。化学方法，在另一方面，典型地涉及使用化学探针的直接结合靶蛋白，并允许其分离和鉴定。设计一个保留...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
三（2-羧乙基）膦 （TCEP）	Life Technologies	20490	让使用日焕然一新。在含 4 eq NaOH 的水中制备 100 mM 储备液。
三[（1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基] 胺 （TBTA）	AnaSpec	63360-50	以 4：1 的叔丁醇与 DMSO 比例制备 1.7 mM 原液，储存在 -20 °C.
硫酸铜 （CuSO4•5H2O）	LabChem， Inc.	LC13440-1	在水中制备 50 mM 储备液，在室温下储存。
生物素-叠氮化物	点击化学工具	AZ104-100	在 DMSO 中制备 10 mM 储备液，储存在 -20 °C.
Alexa Fluor 647-叠氮化物	Life Technologies	A10277	在 DMSO 中制备 1 mM 原液，储存在 -20 °C.
365 nm 紫外灯	Spectroline	FC100	紫外线阻挡眼镜在作时应佩戴。
蛋白酶抑制剂片剂，不含 EDTA	的 Roche Life Science	11873580001	在水中制备 50x 溶液并储存在 -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	设置为输出 1，占空比 30%。
荧光凝胶扫描仪	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	使用红色激光检测 Alexa-fluor 647。
去污剂兼容的 Dc 蛋白检测试剂盒	Bio-Rad	5000112
高容量链霉亲和素琼脂糖微珠	Life Technologies	20359
Dulbecco's 改良 Eagles 培养基，低葡萄糖	ThermoFisher Scientific	11885092
牛血清，合格的	ThermoFisher Scientific	26140079
青霉素/链霉素溶液	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS 样品缓冲液 （2x）	ThermoFisher Scientific	LC2676