通过活细胞光亲和标记在天然细胞环境中鉴定小分子结合蛋白

摘要

本文介绍了一种利用光亲和标记技术鉴定小分子结合蛋白的方法。该技术的优势在于，目标蛋白的结合及共价标记过程均在活细胞环境中进行，从而避免了细胞裂解可能对天然蛋白结构及结合条件造成的破坏。

摘要

鉴定小分子的分子靶点是理解其作用机制具有挑战性但必要的步骤。尽管已有多种靶点鉴定方法被开发并成功用于阐明多种小分子的结合蛋白，但这些技术存在局限性，使其不适用于检测某些类型的小分子-靶标相互作用。特别是那些依赖天然细胞环境的非共价相互作用，例如膜蛋白的相互作用，其结构可能在细胞裂解后发生改变，通常难以通过基于亲和力的靶点鉴定方法进行检测。本文展示了一种方法，该方法利用含有光解基团的探针，在活细胞环境中将小分子结合蛋白共价交联，从而可在无需维持细胞裂解后相互作用的情况下实现靶蛋白的检测与分离。该技术是研究机制未知且具有生物学意义的小分子的有力工具，无论是在基础生物学领域还是在药物发现中均具有重要应用价值。

引言

生物活性小分子主要通过与细胞内一种或多种"靶标"分子（最常见的是蛋白质）相互作用并改变其功能而发挥作用。在药物发现过程中，当通过表型筛选发现一种活性化合物后，鉴定该化合物的分子靶标至关重要；这不仅有助于理解化合物的作用机制及其潜在的副作用，还可能揭示疾病模型背后的新生物学机制，并为开发新型作用机制的治疗药物铺平道路¹。尽管药物在临床应用中并不强制要求明确其靶标，但近年来人们日益认识到，若已知经过验证的靶标，新型药物候选物在临床试验中更有可能取得成功，从而带来更高的投资回报²。因此，针对小分子靶标蛋白的鉴定方法正受到越来越多的关注。

经典的靶点鉴定实验通常依赖亲和纯化技术，其中将感兴趣的小分子固定在树脂上，并与全细胞裂解液孵育，随后洗去未结合的蛋白质，洗脱并鉴定剩余的结合蛋白³。尽管该技术已被用于鉴定多种小分子的靶点⁴，但由于以下几个原因，它并不适合作为通用的靶点鉴定方法。首先，靶蛋白必须在细胞裂解后仍保持其天然构象，才能维持与小分子的结合能力。这对于膜蛋白尤为困难，因为膜蛋白在脱离其天然环境后常常发生构象改变，或直接聚集并从溶液中沉淀出来。其次，小分子必须经过化学修饰，使其能够固定在树脂上，同时仍保留与靶蛋白结合的能力。因此，当小分子被固定在树脂上后，其原本深入的结合口袋可能变得无法接近。第三，结合亲和力必须足够高，以确保在洗涤步骤中相互作用不被破坏，这使得低亲和力相互作用....

方案

注意：本方案改编自 MacKinnon 和 Taunton¹⁰，适用于活细胞实验。

1. 培养细胞的制备

1. 根据所需样本数量准备无菌的6 cm细胞培养皿（见下文）。
   注意：每个处理条件使用一皿细胞，但如果需要更多蛋白，可为每个条件准备2至3皿细胞，并在紫外照射后合并。
   1. 准备至少3个细胞培养皿：仅含DMSO的阴性对照组（D）、仅含探针处理组（P）、探针加竞争剂处理组（C）。
   2. 可选地，准备一个4^th 将培养皿作为无紫外对照，用探针处理但不进行紫外光照。
      注意：如果需要测试多种竞争分子，例如目标小分子的不同类似物，可根据需要准备额外的竞争分子板。
2. 将HEK293T细胞以每皿350万个细胞的数量接种至培养皿中，每皿加入4 ml培养基。
   注意：应针对每种细胞类型确定细胞数量，以确保实验开始时细胞融合度接近100%，从而获得最大蛋白产量。对于HUVEC细胞，每孔使用30万个细胞。此数量大致相当于一个融合的15 cm培养皿中细胞数的1/10。HEK293T细胞应在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养。
3. 将细胞放回培养箱（37 °C，5% CO₂）中培养。₂过夜。

结果

此处展示的结果是使用抗真菌药物伊曲康唑的光亲和探针获得的，该探针的使用方法此前已有发表¹⁶。这些结果证明了活细胞光亲和标记技术可用于成功鉴定出一种主要的伊曲康唑结合蛋白，即35 kDa膜蛋白电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）。

上述实验方案在 HEK293T 细胞中进行，使用伊曲康唑探针进行光标记，并以未修饰的伊曲康唑作为竞争分子。样品按所述方法制备后，通过 SDS-PAGE 按分子量分离蛋白质。左侧的分子量标记物单位为千道尔顿（kDa）。第一泳道为 DMSO 对照样品（D），第二泳道为探针样品（P），第三泳道为竞争样品（C）。仅在 DMSO 单独泳道中出现的条带被视为背景信号。分析这些数据时应注意，特异性结合蛋白应在 DMSO 对照样品中不存在，在探针样品中存在，并在竞争样品中减少。本实验中，仅在探针样品中检测到的主要蛋白条带约为 35 kDa（图 1 和 图 3

讨论

鉴定小分子靶点的不同方法大致可分为两类：自上而下法，即利用药物的细胞表型，结合已知功能信息缩小其潜在靶点范围；或自下而上法，即通过化学或遗传学手段直接鉴定靶点。³自上而下或表型研究可鉴定出受药物影响的特定细胞过程（例如转录/翻译/DNA合成，细胞周期阻滞，信号通路激活/抑制 等等。）可能是小分子最终表型的基础，从而有助于将潜在靶点缩小至参与这些过程的蛋白质。然而，自上而下方法的一个主要缺点是其依赖于对这些过程已有的认知，因此对于功能尚未被表征或此前未被描述为参与特定过程的靶点存在偏倚。

自下而上的方法通过无偏倚地直接鉴定靶标来规避这一问题。该方法可通过遗传学手段实现；例如，利用shRNA文库筛选对药物具有抗性或超敏性的基因敲低细胞系，或分离药物抗性细胞系并利用基因组测序确定哪些基因含有突变¹。此类实验可鉴定出与药物活性相关的关键蛋白或信号通路，但并不能直接证明药物与所鉴定蛋白之间的直接结合。化学方法则通常涉及使用化学探针直接结合靶蛋白，从而实现其分离与鉴定。设计能够保留与靶蛋白结合能力的探针，需要通过构.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三(2-羧乙基)膦 (TCEP)	Life Technologies	20490	现用现配。用含4当量NaOH的水溶液配制100 mM储存液。
三[(1-苄基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺 (TBTA)	AnaSpec	63360-50	用体积比4:1的叔丁醇与DMSO配制1.7 mM储存液，-20 °C保存。
硫酸铜 (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	用水配制50 mM储存液，室温保存。
生物素-叠氮化物	Click Chemistry Tools	AZ104-100	用DMSO配制10 mM储存液，-20 °C保存。
Alexa Fluor 647-叠氮化物	Life Technologies	A10277	用DMSO配制1 mM储存液，-20 °C保存。
365 nm紫外灯	Spectroline	FC100	操作时应佩戴防紫外线眼镜。
不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂	Roche Life Science	11873580001	用水配制50倍浓缩液，-20 °C保存。
超声破碎仪	Branson	Sonifier 250	设定输出功率为1，占空比30%。
荧光凝胶扫描仪	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	使用红色激光检测Alexa Fluor 647。
兼容去垢剂的DC蛋白检测试剂盒	Bio-Rad	5000112
高容量链霉亲和素琼脂糖微珠	Life Technologies	20359
杜尔贝科改良伊格尔培养基，低糖	ThermoFisher Scientific	11885092
优质胎牛血清	ThermoFisher Scientific	26140079
青霉素/链霉素溶液	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS上样缓冲液 (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676