本文介绍了一种利用光亲和标记技术鉴定小分子结合蛋白的方法。该技术的优势在于，目标蛋白的结合及共价标记过程均在活细胞环境中进行，从而避免了细胞裂解可能对天然蛋白结构及结合条件造成的破坏。
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本文内容
摘要
摘要
鉴定小分子的分子靶点是理解其作用机制具有挑战性但必要的步骤。尽管已有多种靶点鉴定方法被开发并成功用于阐明多种小分子的结合蛋白，但这些技术存在局限性，使其不适用于检测某些类型的小分子-靶标相互作用。特别是那些依赖天然细胞环境的非共价相互作用，例如膜蛋白的相互作用，其结构可能在细胞裂解后发生改变，通常难以通过基于亲和力的靶点鉴定方法进行检测。本文展示了一种方法，该方法利用含有光解基团的探针，在活细胞环境中将小分子结合蛋白共价交联，从而可在无需维持细胞裂解后相互作用的情况下实现靶蛋白的检测与分离。该技术是研究机制未知且具有生物学意义的小分子的有力工具，无论是在基础生物学领域还是在药物发现中均具有重要应用价值。
引言
生物活性小分子主要通过与细胞内一种或多种"靶标"分子（最常见的是蛋白质）相互作用并改变其功能而发挥作用。在药物发现过程中，当通过表型筛选发现一种活性化合物后，鉴定该化合物的分子靶标至关重要；这不仅有助于理解化合物的作用机制及其潜在的副作用，还可能揭示疾病模型背后的新生物学机制，并为开发新型作用机制的治疗药物铺平道路1。尽管药物在临床应用中并不强制要求明确其靶标，但近年来人们日益认识到，若已知经过验证的靶标，新型药物候选物在临床试验中更有可能取得成功，从而带来更高的投资回报2。因此，针对小分子靶标蛋白的鉴定方法正受到越来越多的关注。
经典的靶点鉴定实验通常依赖亲和纯化技术，其中将感兴趣的小分子固定在树脂上，并与全细胞裂解液孵育，随后洗去未结合的蛋白质，洗脱并鉴定剩余的结合蛋白3。尽管该技术已被用于鉴定多种小分子的靶点4，但由于以下几个原因，它并不适合作为通用的靶点鉴定方法。首先，靶蛋白必须在细胞裂解后仍保持其天然构象，才能维持与小分子的结合能力。这对于膜蛋白尤为困难，因为膜蛋白在脱离其天然环境后常常发生构象改变，或直接聚集并从溶液中沉淀出来。其次，小分子必须经过化学修饰，使其能够固定在树脂上，同时仍保留与靶蛋白结合的能力。因此，当小分子被固定在树脂上后，其原本深入的结合口袋可能变得无法接近。第三，结合亲和力必须足够高，以确保在洗涤步骤中相互作用不被破坏，这使得低亲和力相互作用的鉴定变得困难。第四，pH、离子浓度或其他内源性分子的存在等环境条件在细胞内可能存在空间差异，有时是药物-靶点相互作用的前提条件。因此，在细胞外找到合适的条件以允许并维持结合，往往需要大量的试错过程。
光亲和标记通过在细胞的天然环境中实现小分子与其靶标的共价结合，从而克服了上述问题。该方法并不将小分子固定在体积较大的固相树脂上，而是通过化学修饰在分子上引入两个小型功能基团：一个光活化基团，可在特定波长的光照下与靶蛋白发生共价交联；另一个为报告基团，可用于检测并随后分离靶蛋白。将活细胞与光亲和探针共同孵育，探针结合其靶蛋白并发生共价交联，之后完整地分离探针-蛋白复合物。通过平行进行竞争实验，可验证探针结合的特异性，即加入过量的母体化合物以竞争性抑制探针与靶蛋白的结合。
光亲和探针的设计与合成因小分子的不同而有很大差异，本实验方案不涉及相关内容；但已有若干关于该主题的优秀论述发表5-9。主要考虑因素是探针应保留母体化合物的生物活性，从而能够结合相同靶标。必须开展构效关系（SAR）研究，以确定分子中哪些部分可被修饰而不影响其生物活性。多种不同的化学基团已被用作光活化交联剂，包括重氮甲烷（diazirine）、二苯甲酮（benzophenone）和芳基叠氮（aryl azide），它们各自具有优缺点10。同样，已有多种报告标签被用于分离探针结合蛋白。报告基团可自身具备功能，例如常用的生物素或荧光标签；也可为前体形式，在光交联步骤之后需要进一步功能化，这类基团的优势在于体积更小，因而更不易影响生物活性11。
在本实验方案中，我们使用了一种含有二氮杂环丙烯光交联基团以及末端炔基的光亲和探针，该炔基可通过一价铜催化的叠氮-炔基夏普莱斯-许斯根环加成（即“点击”）反应连接报告基团12-15。相关构效关系研究、探针的设计与合成以及这些研究的结果已在其他文献中发表16-18。
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方案
注意：本方案改编自 MacKinnon 和 Taunton10，适用于活细胞实验。
1. 培养细胞的制备
- 根据所需样本数量准备无菌的6 cm细胞培养皿（见下文）。
注意：每个处理条件使用一皿细胞，但如果需要更多蛋白，可为每个条件准备2至3皿细胞，并在紫外照射后合并。- 准备至少3个细胞培养皿：仅含DMSO的阴性对照组（D）、仅含探针处理组（P）、探针加竞争剂处理组（C）。
- 可选地，准备一个4th 将培养皿作为无紫外对照，用探针处理但不进行紫外光照。
注意：如果需要测试多种竞争分子，例如目标小分子的不同类似物，可根据需要准备额外的竞争分子板。
- 将HEK293T细胞以每皿350万个细胞的数量接种至培养皿中，每皿加入4 ml培养基。
注意：应针对每种细胞类型确定细胞数量，以确保实验开始时细胞融合度接近100%，从而获得最大蛋白产量。对于HUVEC细胞，每孔使用30万个细胞。此数量大致相当于一个融合的15 cm培养皿中细胞数的1/10。HEK293T细胞应在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养。 - 将细胞放回培养箱（37 °C，5% CO₂）中培养。2过夜。
2. 细胞处理与光交联
- 第二天，将以下药物预先分装至1.5 ml离心管中：
- 对于第一组处理，向2个管中各加入4 µl DMSO，向1个管中加入4 µl 10 mM的竞争剂（即未修饰的母体化合物）。
- 对于第二组处理，向1个管中加入16 µl DMSO，向2个管中各加入16 µl 50 µM光亲和探针。
注：最佳浓度可能因不同探针而异（见讨论部分），但200–500 nM是一个良好的起始范围（本实验使用200 nM）。竞争剂的浓度应至少比探针浓度高20倍（本实验使用10 µM）。所有孔板中DMSO的终浓度应保持一致，且不得超过0.5%（体积为20 µl）。
- 将细胞培养板移入细胞培养超净台，按以下方式加入步骤2.1.1中预分装的药物：吸出1 ml培养基，将预分装的药物溶解于该培养基中，再轻柔地逐滴加回培养板中。将DMSO分别加入DMSO（D）板和探针（P）板，将竞争剂加入竞争（C）板。将培养板放回培养箱孵育30分钟。
- 在细胞培养超净台内调暗灯光，按上述方法将步骤2.1.2中预分装的探针加入探针（P）板和竞争（C）板，将DMSO加入DMSO（D）板。将培养板放回培养箱孵育1小时。
- 在孵育期间，准备以下物品：一个可容纳所有培养板的冰盘；预冷的裂解缓冲液（PBS [pH 8.5] + 1×蛋白酶抑制剂混合物 [无EDTA型，Complete，用水将50×储存液稀释]；每孔200 µl）；在冰上准备分别标记为D、P或C的离心管，用于对应不同处理条件。
- 在1小时孵育结束前15分钟，于冷室中设置好紫外灯（365 nm），并开启以预热灯泡。
- 探针孵育1小时后，将培养皿置于冰上。用5 ml预冷的PBS（pH 7.4）轻轻洗涤细胞，以去除多余的探针。再用4 ml预冷的PBS覆盖细胞。
- 将细胞培养皿置于冰袋上，并使其位于紫外灯正下方3 cm处，以最大限度减少灯源产生的热量。照射3分钟。将培养皿移回冰盘，对所有样品重复此步骤。
- 照射结束后，吸去细胞中的PBS，每孔加入200 µl含蛋白酶抑制剂的预冷PBS（pH 8.5）。用橡胶刮棒将细胞从培养板上刮下，并转移至预先标记的冰上离心管中。
- 加入SDS至终浓度为0.4%（向250 µl样品中加入10 µl 10% SDS）。
注意：SDS粉末具有危害性。操作时应佩戴口鼻口罩，避免吸入SDS粉末。 - 通过超声处理裂解细胞：悬浮液超声10次脉冲（输出功率1，占空比30%），然后在冰上孵育1分钟，再进行第二轮10次脉冲。
- 如有需要，取2 µl悬浮液在光学显微镜下检查，确认细胞已完全裂解。
- 将样品置于95 °C加热板上煮沸5分钟，以完成细胞裂解并使所有蛋白质变性。
- 使用分光光度法兼容去垢剂的蛋白定量试剂盒（如Dc蛋白测定法19），按照制造商说明，在分光光度计上于750 nm波长处测定各样品的蛋白浓度。
- 根据需要加入PBS（pH 8.5）+ 0.4% SDS，将蛋白浓度归一化至2.5 mg/ml（若样品浓度低于2.5 mg/ml，则归一化至蛋白浓度最低的样品）（例如，若样品为250 µl中含5 mg/ml蛋白，则加入250 µl PBS pH 8.5 + 0.4% SDS，使终浓度为2.5 mg/ml）。
3. 通过点击化学连接荧光标记以实现标记蛋白的可视化
- 移取40 µl细胞裂解液，转移至新的微量离心管中。保留剩余裂解液用于与生物素叠氮化物反应（步骤4）。
- 依次加入以下试剂：0.2 µl 氟化叠氮（DMSO 中 1 mM 储备液）、0.58 µl TCEP（水中 100 mM 储备液，加入 4 当量 NaOH，现配现用）和 3.38 µl TBTA（t-丁醇与 DMSO 按 4:1 配制的溶液中 1.7 mM 储备液）。涡旋混匀。
- 加入 1.14 µl CuSO₄4-5H2O（水中50 mM）以启动反应。短暂涡旋，避光室温孵育30分钟。
- 加入50 µl 2x SDS上样缓冲液以终止反应。此时可直接将样品上样至SDS-PAGE凝胶进行电泳。20 为获得最佳效果，或必要时在 -20 °C 下保存过夜。
- 若需冻存样品，上样前于95 °C重新加热5分钟。
注意：由于在此阶段通常未知目标蛋白的分子量，建议使用两种不同丙烯酰胺浓度的凝胶分别电泳即，8% 和 15%）或宽分子量范围梯度凝胶（即， 4%–15%，以确保完全覆盖分子量范围。 - 当染料前沿到达凝胶末端时，继续电泳运行5分钟，以确保所有未反应的过量氟-叠氮化物完全移出凝胶。
- 将凝胶转移至含有ddH₂O的容器中2O，并轻轻振荡孵育10分钟，以洗去所有过量的氟叠化物。
- 将凝胶置于玻璃板上，按照制造商说明使用Typhoon荧光凝胶扫描仪扫描凝胶。
4. 通过点击化学连接生物素标签以亲和纯化标记蛋白
- 从步骤3.1中剩余的裂解液中，在进行蛋白浓度归一化后，使用最大可能的体积，确保所有样品体积相同（例如，若归一化至2.5 mg/ml后各样品体积分别为500、550和600 µl，则每种样品均取500 µl）。
- 将裂解液加入50 µl高容量链霉亲和素琼脂糖微珠中进行预清除，微珠需预先用PBS（pH 7.4）洗涤2次。4 °C旋转孵育1小时。
- 在4 °C下以1,000 × g离心3分钟使微珠沉淀。将上清液转移至新的预冷微量离心管中，弃去微珠。
- 取DMSO样品的1–2%转移至新管，标记为"input"。加入等体积的2× SDS上样缓冲液，并于-20 °C保存。
- 每500 µl裂解液中加入以下试剂：1.38 µl生物素叠氮化物（10 mM DMSO母液）、5.5 µl TCEP和32.5 µl TBTA。涡旋混匀。
- 每500 µl裂解液中加入11 µl CuSO4-5H2O，短暂涡旋。室温孵育30分钟。
- 加入4倍体积预冷至−20 °C的丙酮。涡旋混匀后于−80 °C过夜孵育，以充分沉淀蛋白并去除未反应的生物素叠氮化物。
- 在4 °C下以17,000 × g离心15分钟，使沉淀的蛋白形成沉淀。
- 完全吸弃上清液，通过在150 µl PBS（pH 7.4）+ 1% SDS中进行超声处理使蛋白重新溶解。
- 加入600 µl PBS（pH 7.4），将SDS浓度稀释至0.2%。
- 将样品加入30 µl预洗的高容量链霉亲和素琼脂糖微珠中，4 °C旋转孵育1小时。
- 在4 °C下以1,000 × g离心3分钟使微珠沉淀。吸弃含有未结合蛋白的上清液并丢弃。
- 向微珠中加入1 ml洗涤缓冲液（400 mM NaCl，50 mM Tris，0.2% SDS，pH 7.4），室温旋转孵育5分钟。
- 重复步骤4.12和4.13共3次。
- 彻底吸弃微珠中的洗涤缓冲液，加入30 µl 2× SDS上样缓冲液。
- 在95 °C金属浴中孵育5分钟，以使蛋白从微珠上释放。
- 在室温下以13,000 × g离心1分钟。
注意：此时样品可于-20 °C保存，待进行SDS-PAGE时使用。若样品冷冻保存，使用前需在95 °C重新加热5分钟。 - 小心吸取含有蛋白的上样缓冲液，加载至SDS-PAGE20胶中（见下文重要注意事项）。如有需要，微珠可保留用于后续再次煮沸回收蛋白。
注意：若采用银染法检测蛋白，使用1 mm厚的凝胶可获得更佳结果。若需从银染胶中切取条带进行质谱（MS）分析，所有试剂应使用无菌溶液新鲜配制，并在胶上各样品之间留出空泳道。每从探针泳道切下一胶条，应在DMSO对照泳道中取平行胶条，以便扣除背景蛋白信号。若通过Western blot验证蛋白身份，在进行SDS-PAGE时必须同时上样步骤4.4中的input样品。 - 按照标准流程进行银染21或Western blot22，以检测目标蛋白。
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结果
此处展示的结果是使用抗真菌药物伊曲康唑的光亲和探针获得的，该探针的使用方法此前已有发表16。这些结果证明了活细胞光亲和标记技术可用于成功鉴定出一种主要的伊曲康唑结合蛋白，即35 kDa膜蛋白电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）。
上述实验方案在 HEK293T 细胞中进行，使用伊曲康唑探针进行光标记，并以未修饰的伊曲康唑作为竞争分子。样品按所述方法制备后，通过 SDS-PAGE 按分子量分离蛋白质。左侧的分子量标记物单位为千道尔顿（kDa）。第一泳道为 DMSO 对照样品（D），第二泳道为探针样品（P），第三泳道为竞争样品（C）。仅在 DMSO 单独泳道中出现的条带被视为背景信号。分析这些数据时应注意，特异性结合蛋白应在 DMSO 对照样品中不存在，在探针样品中存在，并在竞争样品中减少。本实验中，仅在探针样品中检测到的主要蛋白条带约为 35 kDa（图 1 和 图 3
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讨论
鉴定小分子靶点的不同方法大致可分为两类：自上而下法，即利用药物的细胞表型，结合已知功能信息缩小其潜在靶点范围；或自下而上法，即通过化学或遗传学手段直接鉴定靶点。3自上而下或表型研究可鉴定出受药物影响的特定细胞过程（例如转录/翻译/DNA合成，细胞周期阻滞，信号通路激活/抑制 等等。）可能是小分子最终表型的基础，从而有助于将潜在靶点缩小至参与这些过程的蛋白质。然而，自上而下方法的一个主要缺点是其依赖于对这些过程已有的认知，因此对于功能尚未被表征或此前未被描述为参与特定过程的靶点存在偏倚。
自下而上的方法通过无偏倚地直接鉴定靶标来规避这一问题。该方法可通过遗传学手段实现；例如，利用shRNA文库筛选对药物具有抗性或超敏性的基因敲低细胞系，或分离药物抗性细胞系并利用基因组测序确定哪些基因含有突变1。此类实验可鉴定出与药物活性相关的关键蛋白或信号通路，但并不能直接证明药物与所鉴定蛋白之间的直接结合。化学方法则通常涉及使用化学探针直接结合靶蛋白，从而实现其分离与鉴定。设计能够保留与靶蛋白结合能力的探针，需要通过构...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Ben Nacev 博士在光亲和标记实验方案设计方面提供的建议，感谢 Wei Shi 博士合成了伊曲康唑光亲和探针，感谢 Yongjun Dang 博士在亲和纯化实验方面的指导，以及 J.O.L. 实验室其他成员提供的有益评论与支持。本研究部分得到了药物研究与制造商协会（PhRMA）基金会药理学/毒理学博士后奖学金（授予 S.A.H.）、美国国家癌症研究所资助项目 R01CA184103、飞行员工会医学研究基金会、前列腺癌基金会（J.O.L.）以及约翰斯·霍普金斯临床与转化研究所的支持，后者部分由美国国家转化科学促进中心（NCATS）资助项目 UL1 TR 001079 提供经费。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三(2-羧乙基)膦 (TCEP) | Life Technologies | 20490 | 现用现配。用含4当量NaOH的水溶液配制100 mM储存液。 |
| 三[(1-苄基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺 (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | 用体积比4:1的叔丁醇与DMSO配制1.7 mM储存液，-20 °C保存。 |
| 硫酸铜 (CuSO4•5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | 用水配制50 mM储存液，室温保存。 |
| 生物素-叠氮化物 | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | 用DMSO配制10 mM储存液，-20 °C保存。 |
| Alexa Fluor 647-叠氮化物 | Life Technologies | A10277 | 用DMSO配制1 mM储存液，-20 °C保存。 |
| 365 nm紫外灯 | Spectroline | FC100 | 操作时应佩戴防紫外线眼镜。 |
| 不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂 | Roche Life Science | 11873580001 | 用水配制50倍浓缩液，-20 °C保存。 |
| 超声破碎仪 | Branson | Sonifier 250 | 设定输出功率为1，占空比30%。 |
| 荧光凝胶扫描仪 | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | 使用红色激光检测Alexa Fluor 647。 |
| 兼容去垢剂的DC蛋白检测试剂盒 | Bio-Rad | 5000112 | |
| 高容量链霉亲和素琼脂糖微珠 | Life Technologies | 20359 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基，低糖 | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| 优质胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS上样缓冲液 (2x) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
参考文献
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