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方法文章

小鼠重复性脑震荡损伤模型

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DOI：

10.3791/54530

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2016年10月12日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Program for Neurotrauma, Neuroproteomics & Biomarkers Research, University of Florida, 2Department of Psychiatry, University of Florida, 3Department of Neuroscience, University of Florida

本文内容

摘要

脑震荡是创伤性脑损伤中最常见的类型。因此，一种可重复的动物脑震荡模型，若能复制患者损伤的重要特征，则可能为以严谨、可控且高效的方式研究脑震荡提供有效手段。

摘要

尽管脑震荡/轻度创伤性脑损伤（mTBI）是创伤性脑损伤中最常见的类型，但目前对其损伤机制及其影响仍缺乏充分认识。为了更深入地理解脑震荡，研究人员常使用动物模型，因为动物模型能够提供一种受控、严谨且高效的实验体系。已有研究通过调整损伤参数，对传统的动物模型进行改良，以模拟轻度损伤程度的mTBI。这些模型之所以被广泛采用，是因为它们能够产生在形态上与临床情况相似的脑损伤，并可呈现一系列不同程度的损伤表型。然而，这些模型在再现患者损伤特征方面仍存在局限性。利用传统的撞击系统，重复性脑震荡损伤（rCHI）模型可诱导出轻度至中度、类似于人类脑震荡的损伤。损伤程度可通过意识丧失（LOC）持续时间来判定，其典型标志之一为呼吸出现短暂终止。rCHI模型在评估mTBI的影响及潜在治疗方法方面具有准确性高、判定简便等优势，因此具有重要应用价值。

引言

脑震荡，也称为轻度创伤性脑损伤（mTBI），是创伤性脑损伤（TBI）中最常见的类型，影响着美国数百万人。脑震荡的诊断较为复杂，目前尚无针对脑震荡的特异性治疗方法。越来越多的认识和一些证据表明，由运动损伤、军事作战及其他身体活动引起的轻度机械性创伤可能具有累积性和慢性的神经学后果1,2。然而，关于脑震荡及其影响的知识仍然不足。由于临床上仅能依赖神经学评估和影像学检查进行诊断，现有方法限制了对病理机制和治疗手段在人类中的研究。动物模型提供了一种高效、严谨且可控的研究脑震荡的途径，有望进一步推动mTBI的诊断与治疗研究。

研究已对传统的创伤性脑损伤（TBI）模型进行了调整，例如通过改变损伤参数，将控制性皮质冲击（CCI）、液体冲击（FPI）、重物坠落损伤和爆炸损伤等模型用于实施轻度创伤性脑损伤（mTBI）并模拟较低的损伤严重程度。这些模型因其能够在形态学上复制与临床状况相似的脑损伤而具有应用优势；然而，它们也存在各自的局限性。由加速度损伤（重物坠落）引起的损伤严重程度通常变异较大。轻度CCI的两种结果——蛛网膜下腔出血和局灶性挫伤——与典型的人类脑震荡并不相符。CCI和FPI需要进行开颅手术，这在临床上并不具有相关性，而爆炸损伤模型则在暴露位置、峰值压力测量以及暴露过程中可变的继发性损伤方面存在更多争议3-6。 因此，研究中亟需一种更新的、可将临床前研究结果转化为临床应用的脑震荡动物模型。

在建立轻度创伤性脑损伤（mTBI）模型时，关键问题在于定义实验性损伤程度，使其尽可能接近临床环境中的实际损伤。近年来，不同的研究团队开发了闭合性头部损伤或脑震荡性头部损伤（CHI）模型7-10。CHI 是颅脑撞击伤（CCI）的一种改良形式，无需进行开颅手术，但仍使用传统的电磁冲击系统来产生头部撞击。通过调节冲击参数，CHI 可诱导出从轻度到中度的脑震荡。撞击后可通过检测呼吸频率下降或呼吸短暂停止来立即观察意识丧失（LOC）。LOC 持续时间被用于判断损伤的严重程度。本文包含一种在小鼠中稍作改进和更新的重复性 CHI（rCHI）模型，以及详细的分步操作方案和代表性结果。rCHI 模型的研究策略有助于明确 mTBI 的影响及潜在治疗方法，尤其重要的是，目前尚无任何单一动物模型能够模拟脑震荡所引起的所有病理变化。

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方案

所有操作均按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准的协议 #201207692 进行，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的规定。

1. 动物护理

  1. 使用3至4月龄的雄性C57BL/6J小鼠。提供垫料、筑巢材料、食物和水 随意摄取将小鼠饲养在温度控制在20 - 22 °C的环境中，保持12小时光照/12小时黑暗的恒定循环。

2. 撞击前准备

  1. 将自制的硅橡胶包被金属头端连接到电磁立体定位冲击装置上。确保头端的平坦底部与探针头端表面平行（图1A）。
  2. 使用4%异氟烷对小鼠进行诱导麻醉，随后以2.5%异氟烷维持麻醉。通过流量计检查麻醉气体流速。持续监测麻醉深度，直至小鼠失去足底回缩反射，达到外科手术麻醉水平。
  3. 将小鼠俯卧位放置于加热垫上。使用漏斗形鼻罩维持麻醉状态。使用剃毛器将头部毛发完全剃除。在小鼠眼睛上涂抹凡士林眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。

3. 碰撞参数设置

注意：撞击系统包括一个用于设置撞击参数的控制箱、一个执行撞击的致动器，以及一个具有三个运动轴的数字立体定位架。

  1. 在控制箱上将冲击装置的速度预设为 4 m/sec，停留时间预设为 240 msec。

4. 定位冲击中心

  1. 在动物身体下方放置一个柔软的加热垫，以维持其体温接近 39 °C。将小鼠以俯卧位固定在立体定位仪上，使用钝端耳杆。
  2. 通过调节 Z 轴驱动器将撞击头降至靠近小鼠头部的位置。通过调节 X 轴和 Y 轴驱动器，将平头撞击器（直径 9 mm）移至矢状缝上方目标坐标的中间位置。
  3. 确保撞击头的一侧边缘与两耳之间假想的水平线垂直平行（图 1C）。撞击中心对应于冠状缝与人字缝之间矢状缝的中点位置（耳间 9 mm 至耳间 0 mm，外侧 4.5 mm）。

5. 冲击深度设置

  1. 为准确设置撞击深度，需使用额外的探针头替换绝缘硅橡胶涂层的撞击头。
  2. 为确保更换探针头后撞击中心位置不发生偏移，在更换探针头前，应先将数字立体定位控制面板上的 X 和 Y 通道设置为零。
  3. 通过手动移动 X 和 Y 驱动装置，将探针头移至撞击区域的中心。
  4. 将接触传感器夹在小鼠尾巴上。
  5. 向下移动撞击器（Z 驱动）直至探针头接触撞击部位表面。
  6. 将立体定位控制面板上的 Z 通道设置为零。
  7. 通过手动调节 X 和 Y 驱动装置（不得使用数字立体定位控制面板上的归零按钮），将撞击头重新移回撞击区域，直至 X 和 Y 驱动装置显示为零（即此前撞击头所在位置）。
  8. 通过移动控制盒上的回缩开关使执行器回缩。手动向下移动撞击器（Z 驱动）4 mm。

6. 影响

  1. 通过点击控制箱上的冲击开关来触发冲击，并实现4 mm的变形深度。

7. 冲击后处理

  1. 使用计时器测量从撞击到小鼠第一次呼吸之间的时间。
  2. 将动物从仪器上移开，并置于保温垫上以维持其体温。在动物恢复足够的意识、能够维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
  3. 待动物完全恢复后，再将其放回清洁的笼盒中。在动物完全恢复前，不得将其与其他动物放在一起。
  4. 每天观察并称量小鼠体重。若小鼠出现疼痛迹象，应以每12至24小时1–2 mg/kg的剂量经腹腔注射美洛昔康。

8. 重复冲击

  1. 在初次损伤后的第4天、第7天和第10天，对小鼠施加额外的损伤（每次冲击之间间隔72小时）。

9. 免疫组织化学（IHC）

  1. 经心灌注
    1. 通过腹腔注射戊巴比妥（200 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
    2. 通过夹趾法评估并确认小鼠处于手术麻醉深度。将小鼠仰卧位固定，用胶带轻轻固定其前肢和后肢于化学通风橱内的泡沫板工作面上。
    3. 沿胸骨正中线从剑突下方至锁骨处切开皮肤。在剑突处另作两个皮肤切口，并沿腹侧肋骨基底部向两侧延伸。
    4. 剪开胸肌和肋骨，打开胸腔，暴露心脏。
    5. 用钝头镊子固定跳动的心脏，并在左心室做1–2 mm的切口。
    6. 立即将蝴蝶针插入右心房，缓慢推动注射器，开始灌注20 ml生理盐水。
    7. 将灌注液由生理盐水更换为4%多聚甲醛，继续灌注20 ml多聚甲醛。
    8. 断头处死小鼠，用剪刀去除头部皮肤，使用骨剪从颅骨中分离出脑组织。
  2. 冷冻切片
    1. 将脑组织包埋于最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂中，在-80 °C条件下冷冻。将脑组织置于冷冻切片机中，调整为矢状位，切取厚度为5 µm的脑切片。
  3. 染色
    1. 将冷冻切片在室温下干燥1小时。
    2. 在切片上加入100 μl含2%山羊血清和0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS），室温孵育1小时。
    3. 用300 μl PBS洗涤切片3次，然后分别加入抗GFAP抗体（1:200）或抗铁蛋白抗体（1:200），4 °C过夜孵育。
    4. 用300 μl PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入生物素标记的二抗，孵育2小时。
    5. 用300 μl PBS洗涤切片3次，然后在室温下加入亲和素-生物素复合物（ABC）溶液（1:50），孵育30分钟。
    6. 用300 μl PBS洗涤切片3次，然后加入3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物溶液（50 ml PBS，10 µl H2O2，10 mg DAB片剂，使用前过滤），孵育5–8分钟。在显微镜下观察切片，直至阳性细胞显现。
    7. 用缓慢流动的自来水冲洗切片5分钟，用实验室擦拭纸清洁切片，然后用封片剂封片并加盖盖玻片。

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结果

在此模型中（图1 A-C），小鼠出现短暂的喘息和浅呼吸。意识丧失（无意识）定义为呼吸频率下降或在恢复正常呼吸前出现短暂的呼吸终止。对头部中央的冲击导致短暂意识丧失（每次冲击后分别为 7.5 ± 4.7、7.8 ± 5.5、10.2 ± 8.8、9.5 ± 8.0 秒，图1D）。通过H&E组织学染色观察，小鼠脑组织呈现正常形态，表明冲击未引起明显的结构病变或组织损伤（图2A）。在创伤性脑损伤（TBI）发生后，星形胶质细胞已知会发生一系列变化，包括活化、增殖或反应性胶质化11,12。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞数量增加，且细胞体增大、突起增粗，提示星形胶质细胞被激活。在最后一次冲击后7天，反复轻度脑外伤（rCHI）小鼠脑中的胼胝体显示出明显的星形胶质细胞活化迹象（图2B）。

组织中的微...

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讨论

为了在形态上模拟与临床状况相似的脑损伤，预期会出现脑震荡后症状。脑震荡后症状通常包括头痛、头晕、眩晕、疲劳、记忆和睡眠障碍、注意力难以集中，以及焦虑和情绪低落。由于躯体症状在动物模型中可能尚无法测量，因此常以运动功能、认知功能和情绪行为的改变作为合理评估动物模型脑震荡的指标。在先前报道的一项研究中，已证明重复性闭合性脑损伤（rCHI）小鼠模型可导致空间学习、记忆和焦虑方面的缺陷8。更重要的是，本方案中使用的rCHI模型能够模拟临床情况，且不造成侵入性脑损伤或脑结构骨折，从而避免了出血、出血性损伤、水肿或急性细胞死亡/组织丢失等并发症。

使用电子磁力冲击系统成功建立稳定的一致性脑震荡/轻度创伤性脑损伤模型的关键提示如下：

在首次脑损伤后应避免发生二次脑损伤，这种损伤可能由冲击过程中的运动引起。小鼠头部在冲击过程中可能会轻微下移。为防止因快速撞击硬质地面或头部过度拉伸而导致脑挫伤，必须在小鼠身体下方放置柔软的加热垫。同时，必须保持小鼠头部和身体处于水平位置。此外，应使用钝端耳杆将小鼠头部固定在立体定位仪上，切...

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披露

作者无任何财务利益需要披露。

致谢

本研究得到了佛罗里达州卫生署资助（脑与脊髓损伤研究基金）（KKW）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉机Eagle Eye Anesthesia, IncModel 150 麻醉
电磁撞击器LeicaBiosystemsImpact One Stereotaxic Impactor执行撞击操作
数字立体定位仪LeicaBiosystems39462501固定小鼠并定位探针尖端
硅胶涂层金属撞击头Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL定制撞击头
锂离子一体式剃毛器WAHL Home Products9854-600剃除小鼠体毛
回形针定制探针头
棉签MEDLINEMDS202055用生理盐水清洁头部
Tissue Tek O.C.T. 包埋剂ASKURA FINETEK USA INC4583组织包埋
抗 GFAP 抗体DakoCA93013免疫组化一抗
抗铁蛋白抗体SigmaF6136免疫组化一抗
VECTASTAIN Elite ABC 试剂盒Vector laboratoriesPK-6100免疫组化检测系统
Permount 封片介质Fisher ScientificSP15-100
Aperio XT ScanScope 扫描仪Leica Microsystems Inc,玻片扫描
Leica AutoStainer XL 自动染色机Leica the pathology CompanyST2010H&E 染色
DAB sigmaD3939免疫组化检测系统

参考文献

  1. Baugh, C. M., et al. Chronic traumatic encephalopathy: neurodegeneration following repetitive concussive and subconcussive brain trauma. Brain Imaging Behav. 6 (2), 244-254 (2012).
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