脑震荡是创伤性脑损伤中最常见的类型。因此，一种可重复的动物脑震荡模型，若能复制患者损伤的重要特征，则可能为以严谨、可控且高效的方式研究脑震荡提供有效手段。
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摘要
摘要
尽管脑震荡/轻度创伤性脑损伤（mTBI）是创伤性脑损伤中最常见的类型，但目前对其损伤机制及其影响仍缺乏充分认识。为了更深入地理解脑震荡，研究人员常使用动物模型，因为动物模型能够提供一种受控、严谨且高效的实验体系。已有研究通过调整损伤参数，对传统的动物模型进行改良，以模拟轻度损伤程度的mTBI。这些模型之所以被广泛采用，是因为它们能够产生在形态上与临床情况相似的脑损伤，并可呈现一系列不同程度的损伤表型。然而，这些模型在再现患者损伤特征方面仍存在局限性。利用传统的撞击系统，重复性脑震荡损伤（rCHI）模型可诱导出轻度至中度、类似于人类脑震荡的损伤。损伤程度可通过意识丧失（LOC）持续时间来判定，其典型标志之一为呼吸出现短暂终止。rCHI模型在评估mTBI的影响及潜在治疗方法方面具有准确性高、判定简便等优势，因此具有重要应用价值。
引言
脑震荡，也称为轻度创伤性脑损伤（mTBI），是创伤性脑损伤（TBI）中最常见的类型，影响着美国数百万人。脑震荡的诊断较为复杂，目前尚无针对脑震荡的特异性治疗方法。越来越多的认识和一些证据表明，由运动损伤、军事作战及其他身体活动引起的轻度机械性创伤可能具有累积性和慢性的神经学后果1,2。然而，关于脑震荡及其影响的知识仍然不足。由于临床上仅能依赖神经学评估和影像学检查进行诊断，现有方法限制了对病理机制和治疗手段在人类中的研究。动物模型提供了一种高效、严谨且可控的研究脑震荡的途径，有望进一步推动mTBI的诊断与治疗研究。
研究已对传统的创伤性脑损伤（TBI）模型进行了调整，例如通过改变损伤参数，将控制性皮质冲击（CCI）、液体冲击（FPI）、重物坠落损伤和爆炸损伤等模型用于实施轻度创伤性脑损伤（mTBI）并模拟较低的损伤严重程度。这些模型因其能够在形态学上复制与临床状况相似的脑损伤而具有应用优势；然而，它们也存在各自的局限性。由加速度损伤（重物坠落）引起的损伤严重程度通常变异较大。轻度CCI的两种结果——蛛网膜下腔出血和局灶性挫伤——与典型的人类脑震荡并不相符。CCI和FPI需要进行开颅手术，这在临床上并不具有相关性，而爆炸损伤模型则在暴露位置、峰值压力测量以及暴露过程中可变的继发性损伤方面存在更多争议3-6。 因此，研究中亟需一种更新的、可将临床前研究结果转化为临床应用的脑震荡动物模型。
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方案
所有操作均按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准的协议 #201207692 进行，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的规定。
1. 动物护理
- 使用3至4月龄的雄性C57BL/6J小鼠。提供垫料、筑巢材料、食物和水 随意摄取将小鼠饲养在温度控制在20 - 22 °C的环境中，保持12小时光照/12小时黑暗的恒定循环。
2. 撞击前准备
- 将自制的硅橡胶包被金属头端连接到电磁立体定位冲击装置上。确保头端的平坦底部与探针头端表面平行（图1A）。
- 使用4%异氟烷对小鼠进行诱导麻醉，随后以2.5%异氟烷维持麻醉。通过流量计检查麻醉气体流速。持续监测麻醉深度，直至小鼠失去足底回缩反射，达到外科手术麻醉水平。
- 将小鼠俯卧位放置于加热垫上。使用漏斗形鼻罩维持麻醉状态。使用剃毛器将头部毛发完全剃除。在小鼠眼睛上涂抹凡士林眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
3. 碰撞参数设置
注意：撞击系统包括一个用于设置撞击参数的控制箱、一个执行撞击的致动器，以及一个具有三个运动轴的数字立体定位架。
- 在控制箱上将冲击装置的....
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结果
在此模型中（图1 A-C），小鼠出现短暂的喘息和浅呼吸。意识丧失（无意识）定义为呼吸频率下降或在恢复正常呼吸前出现短暂的呼吸终止。对头部中央的冲击导致短暂意识丧失（每次冲击后分别为 7.5 ± 4.7、7.8 ± 5.5、10.2 ± 8.8、9.5 ± 8.0 秒，图1D）。通过H&E组织学染色观察，小鼠脑组织呈现正常形态，表明冲击未引起明显的结构病变或组织损伤（图2A）。在创伤性脑损伤（TBI）发生后，星形胶质细胞已知会发生一系列变化，包括活化、增殖或反应性胶质化11,12。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞数量增加，且细胞体增大、突起增粗，提示星形胶质细胞被激活。在最后一次冲击后7天，反复轻度脑外伤（rCHI）小鼠脑中的胼胝体显示出明显的星形胶质细胞活化迹象（图2B）。
组织中的微.......
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讨论
为了在形态上模拟与临床状况相似的脑损伤，预期会出现脑震荡后症状。脑震荡后症状通常包括头痛、头晕、眩晕、疲劳、记忆和睡眠障碍、注意力难以集中，以及焦虑和情绪低落。由于躯体症状在动物模型中可能尚无法测量，因此常以运动功能、认知功能和情绪行为的改变作为合理评估动物模型脑震荡的指标。在先前报道的一项研究中，已证明重复性闭合性脑损伤（rCHI）小鼠模型可导致空间学习、记忆和焦虑方面的缺陷8。更重要的是，本方案中使用的rCHI模型能够模拟临床情况，且不造成侵入性脑损伤或脑结构骨折，从而避免了出血、出血性损伤、水肿或急性细胞死亡/组织丢失等并发症。
使用电子磁力冲击系统成功建立稳定的一致性脑震荡/轻度创伤性脑损伤模型的关键提示如下：
在首次脑损伤后应避免发生二次脑损伤，这种损伤可能由冲击过程中的运动引起。小鼠头部在冲击过程中可能会轻微下移。为防止因快速撞击硬质地面或头部过度拉伸而导致脑挫伤，必须在小鼠身体下方放置柔软的加热垫。同时，必须保持小鼠头部和身体处于水平位置。此外，应使用钝端耳杆将小鼠头部固定在立体定位仪上，切.......
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披露
作者无任何财务利益需要披露。
致谢
本研究得到了佛罗里达州卫生署资助（脑与脊髓损伤研究基金）（KKW）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉机 | Eagle Eye Anesthesia, Inc | Model 150 | 麻醉 |
| 电磁撞击器 | LeicaBiosystems | Impact One Stereotaxic Impactor | 执行撞击操作 |
| 数字立体定位仪 | LeicaBiosystems | 39462501 | 固定小鼠并定位探针尖端 |
| 硅胶涂层金属撞击头 | Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL | 定制 | 撞击头 |
| 锂离子一体式剃毛器 | WAHL Home Products | 9854-600 | 剃除小鼠体毛 |
| 回形针 | 定制 | 探针头 | |
| 棉签 | MEDLINE | MDS202055 | 用生理盐水清洁头部 |
| Tissue Tek O.C.T. 包埋剂 | ASKURA FINETEK USA INC | 4583 | 组织包埋 |
| 抗 GFAP 抗体 | Dako | CA93013 | 免疫组化一抗 |
| 抗铁蛋白抗体 | Sigma | F6136 | 免疫组化一抗 |
| VECTASTAIN Elite ABC 试剂盒 | Vector laboratories | PK-6100 | 免疫组化检测系统 |
| Permount 封片介质 | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Aperio XT ScanScope 扫描仪 | Leica Microsystems Inc, | 玻片扫描 | |
| Leica AutoStainer XL 自动染色机 | Leica the pathology Company | ST2010 | H&E 染色 |
| DAB | sigma | D3939 | 免疫组化检测系统 |
参考文献
- Baugh, C. M., et al. Chronic traumatic encephalopathy: neurodegeneration following repetitive concussive and subconcussive brain trauma. Brain Imaging Behav. 6 (2), 244-254 (2012).
- McKee, A. C., et al.
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