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方法文章

体内 模型用于检测缺氧对肿瘤转移的影响

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DOI：

10.3791/54532

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2016年12月9日

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1Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University Medical Center, 2Department of Nursing, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 3Department of Human Science, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 4School of Medicine, Georgetown University Medical Center, 5Department of Pathology and Neuropathology, Medical University of Gdańsk, 6Department of Oncology, Georgetown University Medical Center, 7Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种动物模型的建立，该模型可用于直接检验肿瘤缺氧对转移的影响，并解析其作用机制。尽管本文所述实验主要针对尤文肉瘤，但类似方法也可应用于其他类型的肿瘤。

摘要

缺氧通过临床观察已被认为与尤文肉瘤（Ewing sarcoma, ES）的转移有关 体外 数据，但其促进转移的直接证据仍然缺乏，且其作用的具体机制尚不明确。本文报道了一种动物模型，可用于直接检验肿瘤缺氧对尤文肉瘤（ES）播散的影响，并探究其潜在的作用通路。该方法结合了两种成熟的实验策略：尤文肉瘤细胞的原位异种移植和股动脉结扎（FAL），后者可诱导后肢缺血。将人源尤文肉瘤细胞注射至SCID/beige小鼠的腓肠肌中，让原发肿瘤生长至250 mm³大小3在此阶段，对肿瘤进行切除（对照组），或对动物实施 FAL 以诱导肿瘤缺氧，3 天后再行肿瘤切除。FAL 的有效性通过肿瘤组织中 hypoxyprobe-1 结合显著增加、严重的肿瘤坏死以及原发性肿瘤生长的完全抑制得以证实。重要的是，尽管缺血具有这些直接效应，仍观察到缺氧肿瘤中肿瘤细胞的播散增强。该实验策略可实现对大小相同但缺氧水平显著不同的原发性肿瘤转移特性的比较分析，同时也为深入评估缺氧诱导的转移性肿瘤进展过程中所发生改变的机制基础提供了新平台。 体内此外，尽管本模型是利用ES细胞建立的，但我们预计该实验策略还可用于检测低氧对其他肉瘤以及在具有明确血供通路的部位原位移植的肿瘤的影响。

引言

尤文肉瘤（Ewing sarcoma, ES）是一种影响儿童和青少年的高度恶性肿瘤。1 肿瘤可发生于软组织和骨骼，常见于四肢。尽管转移灶的存在是ES患者预后不良的最强预测因素，但其发生发展的机制仍不明确。2 肿瘤缺氧是目前已被发现参与ES进展的少数因素之一。在ES患者中，肿瘤组织内无灌注区域的存在与不良预后相关。3 体外研究表明，缺氧可增强ES细胞的侵袭能力，并诱导促转移基因的表达。4-6 然而，尽管有上述证据，目前仍缺乏缺氧直接导致ES进展和扩散的实验证据。此外，缺氧发挥这些作用的具体机制尚不清楚。因此，我们建立了一种体内模型，以填补现有体外研究数据与临床观察之间的空白。该模型系统能够在肿瘤自然生长环境中直接检测缺氧对其的影响，结合磁共振成像（MRI）进行体内肿瘤进展和转移的动态监测，并辅以离体病理学和分子分析（图1）。

由于目前尚无成熟的尤文肉瘤（ES）转基因模型，针对这些肿瘤转移特性的体内研究主要依赖于将人类细胞注射到免疫缺陷小鼠体内。尽管使用免疫功能受损的动物可能低估免疫系统对疾病进展的影响，但使用人类细胞的能力提高了此类研究的可转化性。在不同的异种移植模型中，尾静脉系统注射操作最为简便，但该方法跳过了肿瘤细胞侵入血管及从原发部位逃逸的初始步骤7-12。相比之下，原位异种移植（即将肿瘤细胞注射至骨骼（股骨、肋骨）或肌肉中）技术难度较高，但更符合人类癌症的生物学特性13-16。然而，过去由于原发肿瘤生长迅速，常导致动物在转移发生前即出现严重病况而需实施安乐死。在本研究中，我们采用了一种既往已建立的模型，即向腓肠肌注射细胞，随后切除所形成的原发肿瘤，并通过磁共振成像（MRI）对转移进展进行长期监测17,18。这种靠近胫骨的腓肠肌注射可使肿瘤在两种天然的尤文肉瘤微环境——肌肉和骨骼中生长，并导致向人体常见受累部位的远端转移18。因此，该模型能够准确再现尤文肉瘤患者在疾病进展过程中发生的转移过程。

下肢远端原发肿瘤的定位也有助于精确控制肿瘤组织的血液供应。股动脉结扎（FAL）是血管生成研究中一种成熟的技术，用于阻断腿部远端区域的血流，以研究组织在缺血条件下的血管化反应。19,20 重要的是，在股动脉结扎（FAL）后约3天，初始的血流下降随后会伴随侧支血管开放和组织再灌注。20 因此，在荷瘤肢体上进行该模型操作时，可重现快速生长的肿瘤中自然发生的缺氧/再灌注事件，并因恢复后肢远端灌注而促使转移性肿瘤细胞逃逸 通过 新开放的侧支血管21 重要的是，该操作必须在肿瘤体积足够小时进行，以防止对照组肿瘤出现过度缺氧（通常为荷瘤小腿体积150 - 250 mm时）3)，确保对照组与FAL处理组之间肿瘤缺氧水平存在显著差异。

除了纵向监测缺氧对ES潜伏期和转移频率的影响外，该模型还允许采集组织，并从原发肿瘤和转移灶中建立新的细胞系。重要的是，先前的研究已证实，来源于转移灶的细胞系在重新引入动物体内后表现出增强的转移潜能，表明肿瘤播散与肿瘤细胞表型的永久性改变相关，从而验证了利用这些细胞系解析转移过程的合理性18。综上所述，这些模型现在可用于识别缺氧诱导的转移通路所需的遗传学和分子分析。

由于缺氧是一种促进转移的因素，可增强多种肿瘤的恶性程度，因此我们的模型可作为研究缺氧在自然发生于肢体的其他肿瘤类型（如骨肉瘤和横纹肌肉瘤）中作用的平台21-23。此外，类似的方法也可应用于具有明确血供路径的其他解剖部位发生的恶性肿瘤。最终，该模型可根据具体研究需求进行修改，进一步拓展其应用价值。

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方案

所有实验程序均经乔治城大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 原位注射用细胞的制备

  1. 在标准条件下培养人胚胎干细胞。每注射5只小鼠，使用约一个15 cm的细胞培养皿，细胞融合度不超过70%。
    注：本研究中，SK-ES1细胞在McCoy's 5A培养基中培养，其中含15%胎牛血清（FBS），培养皿预先用胶原蛋白包被；TC71细胞则在RPMI培养基中培养，含10% FBS和1% 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）。两种培养基均添加抗生素——青霉素（100单位/ml）、链霉素（100 µg/ml）和两性霉素B（1 µg/ml）。
  2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤胚胎干细胞，并在细胞融合度达70%时，加入0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化5分钟。
  3. 用细胞培养基将胚胎干细胞从培养皿中收集，室温下以200 × g离心5分钟。用10 ml冷PBS重悬细胞，计数细胞数量。
  4. 将胚胎干细胞在室温下以200 × g离心5分钟，然后分别用冷PBS重悬为每毫升含2 × 107个（SK-ES1）或107个（TC71）细胞的悬液。注射过程中将最终细胞悬液置于冰上保存。

2. 将ES细胞原位注射至腓肠肌

  1. 使用 4 至 6 周龄的雌性 SCID/beige 小鼠。
  2. 注射 ES 细胞时，轻轻握住小鼠，将其左后肢固定于无名指与小指之间，暴露后肢下部内侧。
  3. 使用 28 G ½ 针头，将 0.1 ml 预先制备的细胞悬液（含 2 × 106 个 SK-ES1 细胞或 106 个 TC71 细胞）注射至腓肠肌中（图 2A）。 
    注意：尽管肌肉注射的最大体积通常为 0.05 ml，但本实验因注射细胞数量较多，需将体积增加至 0.1 ml。该操作已获乔治城大学机构动物护理与使用委员会批准。
    1. 将针头从前侧以约 30–45 度角插入腓肠肌，方向朝向胫骨粗隆/结节。
    2. 当针尖接触胫骨粗隆/结节后，稍向后退针，缓慢注入细胞悬液，并在注射过程中逐渐撤出针头以释放压力。
  4. 在接下来的 24 小时内密切观察注射后小鼠是否出现痛苦迹象。 
    注意：动物操作经验较少的研究人员可考虑在肿瘤细胞注射时对小鼠实施麻醉。部分机构出于安全考虑可能要求必须使用麻醉。

3. 监测原发性肿瘤生长

  1. 每日监测原位肿瘤的生长情况，直至肿瘤体积达到预期大小。
    注：在本研究中，以小腿体积达到 250 mm3 作为实验的起始点（图 2B）。通常情况下，肿瘤生长至该体积需要约 1 - 2 周时间。
    1. 使用数显卡尺每日测量小腿的内外径（medial-lateral）和前后径（anterior-posterior）长度。
    2. 根据公式 (D × d2/6) × 3.14 计算小腿体积，其中 D 为较长直径，d 为较短直径，对应荷瘤后肢下段的尺寸。
      注：正常成年小鼠小腿体积约为 40 - 50 mm3。随着肿瘤生长，小腿体积将逐渐增大，在后期阶段主要由肿瘤组织构成。

4. 通过股动脉结扎（FAL）诱导荷瘤后肢缺氧

  1. 准备本手术所需的外科器械：弯头或尖头精细镊子、尖头镊子、手术剪和持针器。使用高压灭菌器或热珠灭菌器在手术前对这些器械进行灭菌。此外，准备好精细的棉签用于本手术。
    注意：建议在手术过程中根据需要对器械尖端进行重复灭菌。
  2. 皮下注射镇痛剂（卡洛芬，5 mg/kg）（SQ）。为检测并确认缺氧状态，注射缺氧探针-1（匹莫尼唑，60 mg/kg）。
    注意：该剂量相当于每只小鼠1.5 mg，通过腹腔注射（IP）0.1 ml浓度为15 mg/ml的缺氧探针PBS溶液实现。随后可通过免疫组织化学方法在动物组织死后检测到缺氧探针。
  3. 将小鼠置于麻醉诱导室中，以1 L/min的流速通入含3–5%异氟烷的100%氧气。
  4. 将小鼠留在诱导室内直至对外界刺激无反应。然后将动物从诱导室中取出，仰卧位放置于手术台面上的保温垫上的无菌铺巾上。使用鼻罩将其连接至持续气流，气流为1–3%异氟烷的100%氧气，流速为0.8 L/min。
    1. 在每只眼睛上涂抹无药性无菌眼膏，以防止角膜干燥。为彻底脱毛手术区域，涂抹脱毛膏，接触皮肤时间不超过10秒。然后使用乙醇预擦垫擦去脱毛膏。
  5. 用胶带将后肢固定，使其与小鼠中线呈约45度角。后肢固定后，用10%聚维酮/碘伏棉签或溶液擦拭暴露的皮肤，随后用乙醇擦拭，每种各重复三次。在后续手术过程中，使用体视显微镜以获得后肢区域的放大视野。
  6. 使用尖头镊子和手术剪从大腿中部向腹股沟区域做长约1 cm的皮肤切口。使用生理盐水湿润的精细棉签轻轻刷除大腿肌肉周围皮下脂肪组织。
  7. 通过钝性分离皮下脂肪组织，小心暴露下方的股动脉。稳定伤口和手术区域，以充分显露内收肌中上部的血管结构。
  8. 使用精细镊子轻轻穿破膜性股鞘，暴露神经血管束。使用一套洁净的精细镊子，在靠近腹股沟、腹股沟韧带远端的位置，将股动脉从股静脉和神经中分离解剖出来。操作时需谨慎，避免刺破股静脉壁。
  9. 解剖完成后，在股动脉下方、旋股外侧动脉（LCFA）分支远端处穿入一根6-0丝线缝线。使用双结结扎法闭塞股动脉（图3）。
  10. 使用6-0聚丙烯缝线关闭切口。缝合切口后，皮下注射0.5 ml温热生理盐水以维持液体平衡治疗。将动物置于恢复笼内覆盖保温垫上，并持续监测直至苏醒。
  11. 术后最初6小时内密切观察动物状态，并连续3天每日皮下注射镇痛剂（卡洛芬，5 mg/kg，SQ）。术后10天使用无菌剪刀拆除缝线。

5. 通过截肢术切除原发性肿瘤

注意：当对照组小腿体积达到 250 mm3 时，或缺氧组在股动脉结扎（FAL）后 3 天，截除带瘤的下后肢。

  1. 使用毛发剪刀轻轻握住动物，从胫骨远端至骨盆区域剃除荷瘤肢体的毛发。在操作前注射镇痛剂（卡洛芬 5 mg/kg，皮下注射）。
  2. 将小鼠放入麻醉诱导舱中，以1 L/min的流速通入含3 - 5%异氟烷的100%氧气。待小鼠对外界刺激无反应后，将其从诱导舱中取出。
  3. 将动物置于手术台面上预热垫上铺设的无菌布巾上，保持右侧卧位。通过鼻罩连接持续气流，以0.8 L/min的流速供给含1 - 3%异氟烷的100%氧气。向每只眼睛涂抹无菌非药物性眼膏，以防止角膜干燥。
  4. 使用10%聚维酮/碘伏棉签或溶液对术区进行消毒，随后用乙醇擦拭，重复3次。在小鼠体表覆盖无菌纱布（例如，手术巾），建立无菌手术区域。
  5. 在股骨中段做环形皮肤切口，随后钝性分离并近端牵拉皮肤。暴露腿部内侧的股部内侧神经血管蒂，并在靠近腹股沟韧带处使用4-0涂层（聚乳酸-羟基乙酸共聚物910）可吸收缝线进行结扎。
  6. 用剪刀横断股骨中段的肌肉群，随后钝性分离软组织至髋股关节。使用骨剪进行股骨中段截骨。用无菌细棉签或可吸收明胶海绵轻压截骨部位，以减少并防止出血。
  7. 使用外科伤口夹闭合表层皮肤，并皮下注射0.5 ml温生理盐水以维持液体平衡。将动物置于恢复笼内覆盖有布巾的温热垫上，持续监测直至清醒。
  8. 术后立即采集原发肿瘤组织样本用于RNA、DNA或蛋白质提取，液氮速冻后于-80 ˚C保存。如需进行原代细胞培养，应在本步骤采集组织样本，具体方法见下文第9节。将剩余的肢体组织置于10%中性缓冲福尔马林中固定，用于组织学和免疫组化分析，包括缺氧探针-1（hypoxyprobe-1）检测。
  9. 术后最初6小时内持续监测动物的运动能力、疼痛表现及进食情况，之后每日监测3天。连续3天每日皮下注射镇痛剂（卡洛芬 5 mg/kg）。 截肢术后10天使用伤口夹去除器拆除伤口夹。

6. 监测小鼠是否存在转移灶

  1. 每天观察小鼠，并至少每周两次评估其转移的临床体征。
    1. 观察动物是否存在表现为肿块的肉眼可见转移灶，这些肿块通常出现在肩部、对侧腿部和下颌等不同部位。为此，应仔细触诊头部、颈部、腋窝区域以及对侧后肢。通过腹部膨隆情况结合磁共振成像（MRI）扫描检查内脏器官是否发生转移。
    2. 用食指按压剑突（胸骨下端）以检查是否存在肺转移。24
      注意：该操作会降低膈肌呼吸能力。患有晚期肺转移的小鼠会出现呼吸困难的迹象，表现为费力呼吸。
    3. 观察动物是否出现神经系统症状，例如腿部瘫痪和共济失调，提示中枢神经系统转移。
    4. 至少每周监测一次小鼠体重变化，作为潜在疾病进展的指标。当体重下降超过术前体重的15%时，应视为人道终点。 

7. 磁共振成像（MRI）在检测转移灶中的应用

  1. 在预定时间点进行 MRI 以检测转移灶。18
    注意：在本研究中，使用了 7 特斯拉水平谱仪。对于 SK-ES1 细胞，在截肢后第 15 天和第 35 天进行 MRI 检测；对于 TC71 细胞，在截肢后第 15 天进行 MRI 检测。
  2. 将小鼠放入麻醉诱导室，室内通入含 1 - 3% 异氟烷的混合气体（30% 氧气和 70% 一氧化二氮）。
  3. 让小鼠留在诱导室内，直至对外界刺激无反应，然后将动物从诱导室中取出。
  4. 将麻醉后的小鼠转移至带有呼吸和体温监测装置的立体定位仪上，并持续给予 1.5% 异氟烷和 30% 一氧化二氮。向每只眼睛涂抹无菌非药物性眼膏，以防止角膜干燥。使用 Bruker 40 mm 或 23 mm 小鼠体线圈分别对动物进行全身或脑部成像。
  5. 采用二维 T2 加权 RARE 序列：TR = 3,000 毫秒，TE = 24 毫秒，矩阵 = 256，视野（FOV）= 4.35 x 3.0 cm，层厚 = 0.5 mm，RARE 因子 = 4，平均次数 = 4。18
  6. 将动物置于温暖的恢复笼中，并持续监测直至清醒。
    注意：由于使用的是浅麻醉，小鼠将迅速恢复。
  7. 在成像后的最初 6 小时内持续监测动物，以确保麻醉未产生任何不良影响。

8. 安乐死与尸体解剖

  1. 当动物通过 MRI 检测到转移灶和/或出现疾病进展的临床症状时，实施安乐死。
    注：在本研究中，携带 SK-ES1 和 TC71 异种移植瘤的小鼠分别在截肢后第 50 天和第 25 天被处死。在某些情况下，由于转移负担较重，需更早实施安乐死。
  2. 以每分钟 1.5 L 的流速通入 CO2（CO2 流量为安乐死舱室容积的 10 - 30% 每分钟）对小鼠实施安乐死。为确保动物死亡，在 CO2 暴露后进行颈椎脱位。
  3. 用 70% 乙醇喷洒整只小鼠，并将其置于超净工作台中。使用 25 G ½ 规格针头连接 1 ml 注射器经心脏穿刺采集血液，转移至含有 2 mg EDTA 的采血管中。
  4. 采集以下组织：脾脏、肾上腺、卵巢、肾脏、肝脏、肺脏、脑组织、右后肢、双侧肱骨及脊柱的骨髓，以及其他部位可见的肉眼转移灶。25,26
  5. 将每种组织的一半置于 10% 中性缓冲福尔马林中固定，用于组织学和免疫组化分析，包括缺氧探针-1（hypoxyprobe-1）检测；另一半组织迅速投入液氮中冷冻，随后于 -80 ˚C 保存，用于 RNA、DNA 或蛋白质提取。25,26 如需进行原代细胞培养，请参照下文第 9 节所述方法采集组织样本。

9. 原代细胞培养

  1. 在无菌条件下，于超净工作台中解剖截肢组织（见上述第5节）或尸检过程中获取的组织（见上述第8节），以进行原代细胞培养。
  2. 准备适用于原位注射所用细胞系的细胞培养基，添加青霉素（200 单位/毫升）、链霉素（200 µg/毫升）、制霉菌素（1 µg/毫升）以及 0.2% 支原体预防性抗生素。将 2.5 毫升基础培养基加入 6 厘米细胞培养皿中。
  3. 从原发肿瘤或转移灶中选取可存活的肿瘤组织区域，然后使用无菌剪刀截取2-3个长度为2-3 mm的组织片段。
    注意：有活力的肿瘤组织通常位于肿瘤边缘，可通过其粉红色或略带红色、明显的光泽及整体湿润的外观与坏死组织相区分。相比之下，坏死组织多见于肿瘤中央，呈灰白/乳白色团块状，外观 dull，呈奶酪样。27
  4. 将分离的组织片段转移至含有第9.2步所述原代培养基的6 cm细胞培养皿中。
  5. 在标准条件下培养细胞，具体方法见第1节（注意）和9.2节。18,28 检查组织块是否有细胞从其周围生长出来，通常在数天内应可观察到。待细胞达到汇合状态后，用胰蛋白酶消化并按照标准细胞培养技术进行传代扩增。
    注意：原代细胞培养物可进一步用于评估来自对照组和低氧肿瘤的细胞的生长和转移特性及其分子特征，方法如前所述。18

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结果

将ES细胞注射至腓肠肌后，允许原发肿瘤生长至小腿体积达250 mm3 (图1，2）。TC71异种移植瘤长至该体积通常需要10至15天，而SK-ES1异种移植瘤则通常需要20至25天。当肿瘤体积达到250 mm³时3 基于Hypoxyprobe-1（pimonidazole）染色，表现出较低水平的内源性缺氧（约肿瘤组织的3%）图 4A、C重要的是，在这些对照肿瘤中，Hypoxyprobe-1 的阳性染色仅出现在生理性缺氧区域。 即，位于远离血管的肿瘤细胞中，这些细胞开始发生细胞死亡（图 4A）。这种染色呈现出特征性的“喷雾状”模式，而大部分健康的肿瘤组织对hypoxyprobe-1呈阴性。6 相比之下，在此阶段进行的FAL会导致严重的缺氧，这由FAL术后4小时绝大多数肿瘤细胞中检测到的缺氧探针-1阳性染色所证实图4B值得注意的是，在FAL处理的肿瘤中，Hyp...

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讨论

本模型涉及两个实验组之间转移情况的比较：对照组中，肿瘤在后肢自然生长，当小腿体积达到 250 mm3 时进行截肢；缺氧暴露组中，当肿瘤承载后肢达到相同体积时实施股动脉结扎（FAL），并在 3 天后进行截肢。尽管在这些实验中，FAL 处理的肿瘤相比对照组肿瘤截肢时间略有延迟，但在结扎至截肢的 3 天期间，其肿瘤体积并未增加。因此，该方法能够对大小相近但缺氧水平显著不同的肿瘤之间的转移潜能进行比较。相比之下，若采用假手术（sham surgery）作为外科干预常用的对照方式，并在术后继续让肿瘤生长 3 天，则会导致实验组间肿瘤体积出现显著差异，且假手术组的原发肿瘤本身已存在较高水平的内源性缺氧。根据预实验结果，假手术对肿瘤生长及其缺氧水平均无显著影响，因此可从实验设计中省略。相反，比较大小相似而缺氧程度不同的肿瘤，是一种高度相关的模型，可用于阐明缺氧对疾病播散的影响。重要的是，与以往的体外（in vitro）研究不同，该方法可在天然肿瘤微环境中全面评估缺氧的促转移作用。4-6

实验设计的目标是实现较低的基础转移水平，以便能够...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助：通过临床与转化科学奖项目资助的 UL1TR000101（此前为 UL1RR031975）、1RO1CA123211、1R03CA178809、R01CA197964 以及授予 JK 的 1R21CA198698。磁共振成像（MRI）在乔治城-隆巴迪综合癌症中心的临床前影像研究实验室（PIRL）完成，组织处理在乔治城-隆巴迪综合癌症中心的组织病理学与组织共享资源平台完成，这两个平台均获得 NIH/NCI 资助 P30-CA051008。作者感谢北卡罗来纳大学教堂山分校细胞生物学与生理学系的 Dan Chalothorn 和 James E. Faber 在死后X射线血管造影方面的协助，以及他们在侧支血管生成领域提供的见解与专业知识。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SK-ES1 人尤文肉瘤（ES）细胞ATCC
TC71 人尤文肉瘤细胞由 Toretsky 博士惠赠
McCoy's 5A（改良型）培养基Gibco by Life Technologies12330-031
RPMI-1640ATCC30-2001
PBSCorning Cellgro21-040-CV
FBSSigma-AldrichF2442-500mL
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）Gibco by Life Technologies25200-056
青霉素-链霉素Gibco by Life Technologies15140-122
Fungizone® 抗真菌剂Gibco by Life Technologies15290-018
MycoZap™ 预防剂LonzaVZA-2032
高浓度大鼠尾胶原 I 型BD Biosciences354249
SCID/beige 小鼠Harlan 或 Charles River250（Charles River）或 18602F（Harlan）
1 ml 胰岛素注射器，带永久连接的 28 G ½ 针头BD329424
生理盐水（0.9% 氯化钠注射液，USP）Hospira, INCNDC 0409-7984-37
数显卡尺World Precision Instruments, Inc501601
外科手术器械Fine Science Tools
Rimadyl（卡洛芬）注射液 Zoetis
Hypoxyprobe-1（盐酸匹莫硝唑固体）HPI, IncHP-100mg
hypoxyprobe-2（CCI-103F-250 mg）HPI, IncCCI-103F-250mg
聚维酮碘棉签棒PDIS41350
无菌酒精擦拭垫Fisher HealthCare22-363-750
LubriFresh P.M.（眼用润滑软膏） Major PharaceuticalsNDC 0904-5168-38
VWR 吸水垫，带防水防潮屏障VWR56617-014 
Oster Golden A5 单速兽用剪毛器，配 50 号刀片Oster078005-050-002（剪毛器），078919-006-005（刀片）
Nair 含婴儿油乳液Church & Dwight Co., Inc.
丝线 6-0Surgical Specialties Corp752B
Prolene（聚丙烯）缝线 6-0Ethicon8680G
Vicryl（聚乳酸-共-乙醇酸 910）缝线 4-0 EthiconJ386H
Fisherbrand 涂药棒（纯化棉）Fisher Scientific23-400-115
GelFoam 可吸收牙科海绵 - 4 号规格Pfizer Pharmaceutical9039605
Autoclip 伤口缝合钉施加器BD427630
体视显微镜OlympusSZ61
Autoclip 移除器BD427637
伤口夹BD427631
7 特斯拉 MRIBruker Corporation
Paravision 5.0 软件Bruker Corporation
CO2 安乐死系统VetEquip
25 G 5/8 针头（用于心脏穿刺）BD305122
0.1 ml 注射器（用于心脏穿刺）TerumoSS-01T
K3-EDTA 微量管 1.3 mlSarstedt41.1395.105
10% 中性缓冲福尔马林Fisher ScientificSF100-4

参考文献

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