本文描述了一种动物模型的建立，该模型可用于直接检验肿瘤缺氧对转移的影响，并解析其作用机制。尽管本文所述实验主要针对尤文肉瘤，但类似方法也可应用于其他类型的肿瘤。
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本文内容
摘要
摘要
缺氧通过临床观察已被认为与尤文肉瘤（Ewing sarcoma, ES）的转移有关 体外 数据，但其促进转移的直接证据仍然缺乏，且其作用的具体机制尚不明确。本文报道了一种动物模型，可用于直接检验肿瘤缺氧对尤文肉瘤（ES）播散的影响，并探究其潜在的作用通路。该方法结合了两种成熟的实验策略：尤文肉瘤细胞的原位异种移植和股动脉结扎（FAL），后者可诱导后肢缺血。将人源尤文肉瘤细胞注射至SCID/beige小鼠的腓肠肌中，让原发肿瘤生长至250 mm³大小3在此阶段，对肿瘤进行切除（对照组），或对动物实施 FAL 以诱导肿瘤缺氧，3 天后再行肿瘤切除。FAL 的有效性通过肿瘤组织中 hypoxyprobe-1 结合显著增加、严重的肿瘤坏死以及原发性肿瘤生长的完全抑制得以证实。重要的是，尽管缺血具有这些直接效应，仍观察到缺氧肿瘤中肿瘤细胞的播散增强。该实验策略可实现对大小相同但缺氧水平显著不同的原发性肿瘤转移特性的比较分析，同时也为深入评估缺氧诱导的转移性肿瘤进展过程中所发生改变的机制基础提供了新平台。 体内此外，尽管本模型是利用ES细胞建立的，但我们预计该实验策略还可用于检测低氧对其他肉瘤以及在具有明确血供通路的部位原位移植的肿瘤的影响。
引言
尤文肉瘤（Ewing sarcoma, ES）是一种影响儿童和青少年的高度恶性肿瘤。1 肿瘤可发生于软组织和骨骼，常见于四肢。尽管转移灶的存在是ES患者预后不良的最强预测因素，但其发生发展的机制仍不明确。2 肿瘤缺氧是目前已被发现参与ES进展的少数因素之一。在ES患者中，肿瘤组织内无灌注区域的存在与不良预后相关。3 体外研究表明，缺氧可增强ES细胞的侵袭能力，并诱导促转移基因的表达。4-6 然而，尽管有上述证据，目前仍缺乏缺氧直接导致ES进展和扩散的实验证据。此外，缺氧发挥这些作用的具体机制尚不清楚。因此，我们建立了一种体内模型，以填补现有体外研究数据与临床观察之间的空白。该模型系统能够在肿瘤自然生长环境中直接检测缺氧对其的影响，结合磁共振成像（MRI）进行体内肿瘤进展和转移的动态监测，并辅以离体病理学和分子分析（图1）。
由于目前尚无成熟的尤文肉瘤（ES）转基因模型，针对这些肿瘤转移特性的体内研究主要依赖于将人类细胞注射到免疫缺陷小鼠体内。尽管使用免疫功能受损的动物可能低估免疫系统对疾病进展的影响，但使用人类细胞的能力提高了此类研究的可转化性。在不同的异种移植模型中，尾静脉系统注射操作最为简便，但该方法跳过了肿瘤细胞侵入血管及从原发部位逃逸的初始步....
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方案
所有实验程序均经乔治城大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 原位注射用细胞的制备
- 在标准条件下培养人胚胎干细胞。每注射5只小鼠，使用约一个15 cm的细胞培养皿，细胞融合度不超过70%。
注：本研究中，SK-ES1细胞在McCoy's 5A培养基中培养，其中含15%胎牛血清（FBS），培养皿预先用胶原蛋白包被；TC71细胞则在RPMI培养基中培养，含10% FBS和1% 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）。两种培养基均添加抗生素——青霉素（100单位/ml）、链霉素（100 µg/ml）和两性霉素B（1 µg/ml）。 - 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤胚胎干细胞，并在细胞融合度达70%时，加入0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化5分钟。
- 用细胞培养基将胚胎干细胞从培养皿中收集，室温下以200 × g离心5分钟。用10 ml冷PBS重悬细胞，计数细胞数量。
- 将胚胎干细胞在室温下以200 × g离心5分钟，然后分别用冷PBS重悬为每毫升含2 × 107个（SK-ES1）或107个（TC71）细胞的悬液。注射过程中将最终细胞悬液置于冰上保存。
2. 将ES细胞原位注射至腓肠肌
- 使用 4 至 6 周龄的雌性 SCID/beig....
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结果
将ES细胞注射至腓肠肌后，允许原发肿瘤生长至小腿体积达250 mm3 (图1，2）。TC71异种移植瘤长至该体积通常需要10至15天，而SK-ES1异种移植瘤则通常需要20至25天。当肿瘤体积达到250 mm³时3 基于Hypoxyprobe-1（pimonidazole）染色，表现出较低水平的内源性缺氧（约肿瘤组织的3%）图 4A、C重要的是，在这些对照肿瘤中，Hypoxyprobe-1 的阳性染色仅出现在生理性缺氧区域。 即，位于远离血管的肿瘤细胞中，这些细胞开始发生细胞死亡（图 4A）。这种染色呈现出特征性的“喷雾状”模式，而大部分健康的肿瘤组织对hypoxyprobe-1呈阴性。6 相比之下，在此阶段进行的FAL会导致严重的缺氧，这由FAL术后4小时绝大多数肿瘤细胞中检测到的缺氧探针-1阳性染色所证实图4B值得注意的是，在FAL处理的肿瘤中，Hyp.......
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讨论
本模型涉及两个实验组之间转移情况的比较：对照组中，肿瘤在后肢自然生长，当小腿体积达到 250 mm3 时进行截肢；缺氧暴露组中，当肿瘤承载后肢达到相同体积时实施股动脉结扎（FAL），并在 3 天后进行截肢。尽管在这些实验中，FAL 处理的肿瘤相比对照组肿瘤截肢时间略有延迟，但在结扎至截肢的 3 天期间，其肿瘤体积并未增加。因此，该方法能够对大小相近但缺氧水平显著不同的肿瘤之间的转移潜能进行比较。相比之下，若采用假手术（sham surgery）作为外科干预常用的对照方式，并在术后继续让肿瘤生长 3 天，则会导致实验组间肿瘤体积出现显著差异，且假手术组的原发肿瘤本身已存在较高水平的内源性缺氧。根据预实验结果，假手术对肿瘤生长及其缺氧水平均无显著影响，因此可从实验设计中省略。相反，比较大小相似而缺氧程度不同的肿瘤，是一种高度相关的模型，可用于阐明缺氧对疾病播散的影响。重要的是，与以往的体外（in vitro）研究不同，该方法可在天然肿瘤微环境中全面评估缺氧的促转移作用。4-6
实验设计的目标是实现较低的基础转移水平，以便能够.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助：通过临床与转化科学奖项目资助的 UL1TR000101（此前为 UL1RR031975）、1RO1CA123211、1R03CA178809、R01CA197964 以及授予 JK 的 1R21CA198698。磁共振成像（MRI）在乔治城-隆巴迪综合癌症中心的临床前影像研究实验室（PIRL）完成，组织处理在乔治城-隆巴迪综合癌症中心的组织病理学与组织共享资源平台完成，这两个平台均获得 NIH/NCI 资助 P30-CA051008。作者感谢北卡罗来纳大学教堂山分校细胞生物学与生理学系的 Dan Chalothorn 和 James E. Faber 在死后X射线血管造影方面的协助，以及他们在侧支血管生成领域提供的见解与专业知识。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SK-ES1 人尤文肉瘤（ES）细胞 | ATCC | ||
| TC71 人尤文肉瘤细胞 | 由 Toretsky 博士惠赠 | ||
| McCoy's 5A（改良型）培养基 | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×） | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® 抗真菌剂 | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ 预防剂 | Lonza | VZA-2032 | |
| 高浓度大鼠尾胶原 I 型 | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige 小鼠 | Harlan 或 Charles River | 250（Charles River）或 18602F（Harlan） | |
| 1 ml 胰岛素注射器，带永久连接的 28 G ½ 针头 | BD | 329424 | |
| 生理盐水（0.9% 氯化钠注射液，USP） | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| 数显卡尺 | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| 外科手术器械 | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl（卡洛芬）注射液 | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1（盐酸匹莫硝唑固体） | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2（CCI-103F-250 mg） | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| 聚维酮碘棉签棒 | PDI | S41350 | |
| 无菌酒精擦拭垫 | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M.（眼用润滑软膏） | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR 吸水垫，带防水防潮屏障 | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 单速兽用剪毛器，配 50 号刀片 | Oster | 078005-050-002（剪毛器），078919-006-005（刀片） | |
| Nair 含婴儿油乳液 | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| 丝线 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene（聚丙烯）缝线 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl（聚乳酸-共-乙醇酸 910）缝线 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand 涂药棒（纯化棉） | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam 可吸收牙科海绵 - 4 号规格 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip 伤口缝合钉施加器 | BD | 427630 | |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip 移除器 | BD | 427637 | |
| 伤口夹 | BD | 427631 | |
| 7 特斯拉 MRI | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 软件 | Bruker Corporation | ||
| CO2 安乐死系统 | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 针头（用于心脏穿刺） | BD | 305122 | |
| 0.1 ml 注射器（用于心脏穿刺） | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA 微量管 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Fisher Scientific | SF100-4 |
参考文献
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 tri....
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