在非透明支架上成像细胞活力——以一种新型编织钛植入物为例

摘要

本文介绍一种基于荧光染料的成像技术，用于检测不透明钛支架上的细胞活力，同时可初步观察支架中的杂质。该方案解决了在不透明支架上成像细胞-细胞或细胞-金属相互作用时存在的技术局限。

摘要

椎间盘退变和椎间盘突出是导致下腰痛的主要原因之一。细胞外基质的耗竭最终导致髓核（NP）突出，从而引起椎间盘结构破坏。目前可用的外科治疗方法虽可缓解疼痛，但无法恢复脊柱的力学功能。为了保留脊柱的力学特性，全椎间盘或髓核置换因此受到广泛关注。然而，这一关节成形术时代仍处于不成熟阶段，因为现有产品均未经过临床评估。

本研究旨在测试一种由编织钛丝制成的新型髓核植入物的生物相容性。尽管该材料在机械性能方面具有诸多优势，但由于所制备的植入物不透明，因而限制了其在常规光学分析中的应用。本文介绍了一种策略，用于描述 体外 支架上骨软骨祖细胞的可视化、追踪及活力检测。该方案可用于评估清洗方案的效率，同时研究此类及其他不透明支架的生物相容性。此外，该方案还可用于观察细胞在支架表面或内部的黏附模式，以及细胞的活力和增殖速率。 体外 生物相容性测试实验为分析细胞与不透明支架材料之间的相互作用提供了一种有效的工具。

引言

慢性背痛是一种多因素疾病。自20世纪50年代以来，人们对退行性椎间盘疾病微创治疗方案的兴趣日益增长。迄今为止，脊柱多节段融合术仍是应用最广泛的治疗方法。然而，该方法常导致受累节段活动能力受限^1,2，因此，椎间关节成形术的研究引起了广泛关注。全椎间盘置换和髓核置换技术的显著进展，已成为治疗慢性背痛的良好替代方案¹。尽管取得了巨大进步，但这些方法尚未经过充分的临床评估。在纤维环保持完整的情况下，较柔韧的髓核假体被视为全椎间盘置换的一种有前景的替代选择^3,4。然而，目前市场上现有的髓核假体常伴随多种并发症，如椎体形态改变、假体移位、椎间盘垂直高度丢失以及必要的机械刚性不足等问题⁵。为了克服现有技术的缺陷，一种由编织钛丝制成的新型髓核假体已成功研发⁶。由于其独特的编织结构，这种新型支架表现出优异的生物力学特性，例如，减震性能、孔径大小、承载能力和可靠性⁷。为评估该新型髓核假体的生物相容性，研究发现现有的（光学）分析技术因假体不透明的特性而受到严重限制。

为了测试生物相容性，细胞与金属之间的相互作用起着重要作用^8-10。细胞与支架之间的相互作用对于稳定支架以及实现植入物在宿主系统内的良好整合至关重要。然而，不断加深的组织长入可能改变支架的力学性能。为了研究支架表面是否能够支持细胞的黏附、增殖和分化，或金属是否影响细胞....

方案

注意：实验使用了永生化的人类间充质基质前体细胞（SCP-1 细胞）。SCP-1 细胞由 Matthias Schieker 教授提供¹²。

1. SCP-1 细胞的扩增

1. 在使用 SCP-1 细胞前，佩戴手套并用 70% 乙醇（v/v）彻底清洁工作区域（指定的生物安全柜 I）。
2. 在已清洁的生物安全柜中，按照 表 1 所示配制适量的细胞培养基。为保持基础培养基的无菌状态，需通过孔径为 0.22 µm 的无菌滤器添加补充成分。
   1. 为防止污染，应在使用前至少 24 小时配制培养基。为检测其无菌性，取 1 ml 培养基置于细胞培养板中（不接种细胞），在标准细胞培养孵育箱（37 °C、5% CO₂、20% O₂ 和 90% 湿度）中孵育。24 小时后，使用至少 200 倍的放大倍数在显微镜下检查培养基。
3. 将 SCP-1 细胞置于标准细胞培养孵育箱中，在支持性条件下（37 °C、5% CO₂、20% O₂ 和 90% 湿度）进行培养。
4. 为维持和扩增细胞，将 SCP-1 细胞培养至融合度达到 80–90%。在此期间，每 2–3 天更换一次培养基。当细胞融合度达到 80–90% 时，按通常 1:2 的比例传代 SCP-1....

结果

初步结果显示，所述新型椎体植入物不仅具有良好的减震性能，而且与SCP-1细胞具有良好的生物相容性。在植入物的生产过程中，其会接触强腐蚀性和有毒物质（润滑剂、媒染剂、电抛光液）。借助间接荧光染色技术，我们能够可视化残留的杂质，从而优化清洗方案，显著降低支架上的物质残留量。图3展示了所建立清洗方案的效率。

用于关节成形术治疗的植入物的成功与否，取决于细胞-材料界面发生的事件。图4展示了按照第6节实验方案所述，在接种24小时后细胞在支架上的附着情况。我们观察到SCP-1细胞具有显著的转染效率，能够成像间充质基质前体细胞在支架上的生长模式（参见图2）。直接可视化观察证实了支架的生物相容性，同时也描绘了细胞在支架表面的附着模式（图4）。可进一步通过荧光染色来检测细胞与支架表面的相互作用及其在表面的铺展情况。

讨论

支架表面在其与周围组织的相互作用中起着重要作用 体内 从而确定植入物的功能耐久性。因此，通过以下方法研究支架的生物相容性： 体外 使用细胞（SCP1细胞系）在支架上接种后进行的检测。

对于薄且光学透明的支架具有良好效果的显微技术，却不适用于研究不透明支架的生物相容性。这主要是因为不透明支架会显著阻碍光线穿透并造成严重畸变¹⁵。为部分克服这些问题，本文建立了一种利用多种荧光染料对编织钛金属支架上的/内的细胞进行评估的方法。

为了实现钛丝的编织及后续折叠，材料会接触强腐蚀性和有毒物质（润滑剂、媒染剂、电抛光液），如果这些物质的残留物残留在支架内部或表面，可能会改变支架的生物相容性。借助所开发的间接荧光检测方案（方案5），我们能够可视化支架结构。此外，使用ImageJ分析了支架的特性，例如，材料厚度、单个孔径大小与形状，以及连接密度。更高倍数的落射荧光显微图像可用来观察支架内部及表面的杂质。图3b因此证实了所开发的清洗方案的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6/24/48 孔板，T25/T75 培养瓶	Greiner Bio-One GmbH	*
* 24 孔板	Greiner Bio-One GmbH	CELLSTAR 662 160
* 48 孔板	康宁公司 美国	3548
* 6 孔板	Falcon	353046
* T25	Greiner Bio-One GmbH	690 175
T75	Greiner Bio-One GmbH	658 175
乙酸，purum ≥ 99.0%	卡尔·罗特	3738.4
丙酮	卡尔·罗特	5025.1
Axioplan-2	卡尔·蔡司，德国
生物安全柜	赛默飞世尔科技	安全 2020
钙黄绿素乙酰氧基甲酯（calcein AM）	Sigma	17783
细胞培养箱	Binder，德国图特林根	9040-0078
滤器单元（0.22 µm)	默克密理博，IRL	SLGP033RS
离心机 5810 R 和 5417 R	赛默飞世尔科技，纽约	Megafuge 40R
二甲基亚砜（DMSO）	卡尔·罗斯	4720.2
杜尔贝科’不含 Ca 的 PBS &和 Mg	Sigma	H15-002
乙醇 99%	SAV 液体产品有限公司	475956
碘化丙啶同二聚体	Sigma	46043
EVOS 荧光成像系统	Life technologies	AMF4300
胎牛血清（FCS）	Gibco	10270-106
血细胞计数板	美国宾夕法尼亚州豪斯尔科学公司
Hoechst 33342	Sigma	14533-100MG
编织钛核植入物	雄鹿 & KG，德国
含谷氨酰胺但不含核苷的 MEM α 改良培养基	Sigma	E15-832
Omega微孔板读板机	BMG Labtech，德国	FLUOstar Omega
青霉素/链霉素	Sigma	P11-010
刃天青钠盐	Sigma	199303-1G
磺酰罗丹明B钠盐	Sigma	S1402-1G
试管旋转仪	Labinco B.V.，荷兰	Model LD-76
三(羟甲基)氨基甲烷	卡尔·罗特	AE15.1
Triton	卡尔·罗斯	3051.2
0.5% 台盼蓝	卡尔·罗斯	CN76.1
胰蛋白酶/EDTA	Sigma	L11-004