非透明的支架成像细胞活性 - 使用新型针织钛种植体为例

Summary

这里，我们提出一个基于荧光的成像技术来检测细胞生存力上的非透明钛脚手架以及检测的脚手架杂质影子。这个协议进行故障排除在非透明支架成像细胞 - 细胞或细胞 - 金属相互作用的缺点。

Abstract

椎间盘退化和椎间盘突出是导致腰痛的主要原因之一。细胞外基质的耗竭，最终导致髓核 （NP） 挤压导致椎间盘破坏。目前可用的手术治疗可以减轻疼痛，但不能恢复脊柱的机械功能。为了保留脊柱的机械特性，全椎间盘或核置换因此成为人们的广泛兴趣。然而，这个关节置换术时代仍然处于不成熟的状态，因为现有的产品都没有经过临床评估。

本研究旨在测试一种由针织钛丝制成的新型细胞核植入物的生物相容性。尽管具有所有机械优势，但该材料在常规光学分析方面存在局限性，因为所得植入物是不透明的。在这里，我们提出了一种策略，描述了支架上骨软骨祖细胞的体外可视化、跟踪和活力测试。该方案可用于可视化清洁方案的效率，以及研究这些和其他不透明支架的生物相容性。此外，该方案可用于显示细胞的粘附模式以及支架上/内的细胞活力和增殖率。这种体外生物相容性测试测定为分析不透明和不透明支架中的细胞-材料相互作用提供了一种有利的工具。

Introduction

慢性背部疼痛是一种多因素疾病。自20世纪50年代的椎间盘退行性疾病的微创治疗选择的兴趣增加。直到今天，在脊柱的多节段的融合是最广泛使用的治疗方法。因为，这种方法常常导致在受影响的段^1,2的移动性限制，关节造形术时代的勘探成为广泛的兴趣。总椎间盘置换髓核置换显著进步已成为治疗慢性背痛¹一个很好的选择。尽管巨大的进步，没有一种方法已被临床评估。少刚性核植入物代表一个有前途的替代全椎间盘置换，只要该纤维环是完好^3,4。然而，市场上的当前存在的核植入物通常伴有并发症像在椎体，错位，盘和叔垂直高度损耗变化他缺乏必要的相关机械刚性^5。为了克服目前的缺点，提出针织钛线的新型核植入物已研制成功^6。由于独特的编织结构，这种新开发的脚手架已经显示出杰出的生物力学性能， 如阻尼特性，孔径，承载能力和可靠性^7。在归因于植入物的非透明性的（光学）分析技术旨在测试此新颖核植入物的生物相容性，描绘严重限制。

为了测试生物相容性，细胞-金属相互作用中起着突出的作用^8-10。细胞和支架之间的相互作用是必要的稳定，从而为在主机系统内的更好的植入物的整合。然而，越来越长入深度可能改变支架的机械性能。旨在不变拟tigate所述支架表面是否提供了用于细胞附着，增殖和分化，或碱金属是否影响细胞生存力，它解决在非透明和不透明支架成像上/细胞的常见公知的问题是重要的。为了克服此限制几个荧光灯为基础的技术进行了探讨。公司提供大范围的荧光的可视化活细胞，细胞器，甚至是特定的细胞状态^11。此实验的荧光团进行，以最好地适合我们的荧光显微镜与在线工具光谱观看者的帮助​​下选择。

上/在非透明针织钛支架贴壁细胞行为的分析开发策略涉及以下内容:osteochondro祖细胞的1）的荧光（绿色荧光蛋白/ GFP）标记，以允许在细胞的跟踪脚手架，2）测定存活率（线粒体chondrial活性）的细胞，以及3）可视化的细胞 - 细胞和所述支架内的细胞物质的相互作用。该过程具有的优点在于它可以很容易地转移到其它贴壁细胞和其他非透明或不透明的支架。此外，生存力和向内生长模式可以在几天进行监控，因此，它可以用有限数量的支架材料或细胞的使用。

本研究证明的成功使用我们的当前协议来测量细胞活力和可视化在生长上/ osteochondro祖细胞的图案在非透明针织钛支架。此外，开发的协议可能，以便确定所述支架的杂质，并检查清洗协议一起使用。

Protocol

注:永生人类间充质基质细胞前体细胞（SCP-1细胞）用于实验。 SCP-1细胞通过的Matthias Schieker ¹²教授提供。

1. SCP-1细胞的扩展

1. 之前与SCP-1细胞的工作，正确清洁用70％乙醇（V / V）戴着手套工作区域（指定的生物安全柜Ⅰ）。
2. 在清洗过的生物安全柜中通过如表1所示混合所需组分制备细胞培养基的适当体积。为了维持培养基的无菌性，通过无菌过滤器传递具有0.22微米的孔尺寸添加补充剂。
   1. 为防止污染，使用前准备中至少24小时。为了测试其无菌性，孵育在细胞培养板1毫升培养基没有细胞中的标准细胞培养孵化器:37℃，5％CO _{2，20％O 2}和90％的湿度。后24小时，检查中使用显微镜的至少200倍的放大倍数。
3. 保持SCP-1细胞与支持条件的标准的细胞培养孵化器:37℃，5％CO _{2，20％O 2}和90％的湿度。
4. 为了维护和扩展，成长SCP-1细胞，直到他们达到80-90％汇合。在这段时间内培养，培养基改变每2-3天。在达到80-90％汇合，拆分SCP-1的细胞（一般为1:2的比例）到下一个通道扩张或板用于实验（指示）。
5. 用于分离在SCP-1细胞，温培养基在37℃，使用水浴在37℃下解冻胰蛋白酶/ EDTA。
6. 完全吸从80-90％汇合细胞培养液，并弃置于垃圾容器。
7. 用DPBS洗涤细胞至少两次（Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水无镁和钙，pH值7.2）。
   1. 吸取适当体积的DPBS到细胞上（为一个T75培养瓶中5毫升DPBS和12ml的T175培养瓶）。
   2. 吸仔细DPBS并丢弃到废物容器中。
8. 吸取0.25％胰蛋白酶/ EDTA的适当体积到细胞上（1毫升一个T75培养瓶中的DPBS和2ml的T175培养瓶），并在具有5的标准细胞培养培养箱中于37℃孵育5-10分钟％的CO _{2，20％O 2}和90％的湿度。
9. 通过敲击容器逐出细胞并确保所有细胞从培养塑料（胰蛋白酶）通过在显微镜下观察漂浮细胞分离。
10. 灭活通过加入10ml培养基的胰蛋白酶反应。混合胰蛋白酶和细胞反复吹打仔细网上平台。
11. 细胞悬液转移入反应管中，离心分离，在600×g离心在室温下10分钟。
12. 吸出上清液，重悬细胞沉淀在10ml培养中。
13. 通过计数台盼蓝排除法的细胞在协议2描述。
14. 种子取决于实验设计的细胞。

2. SCP-1细胞计数

1. 执行使用血球的再悬浮的细胞的活细胞计数（锥虫蓝排除法）。
2. 前的细胞数，用自来水清洗血细胞计数。干用无绒组织血球成分。濡玻璃盖成反比按下它到两个玻璃选手在计数区域的每一侧组装。确保牛顿环看到在玻璃板上跑步（ 图1）。
3. 采取10微升的再悬浮细胞，并用10微升的0.1％台盼蓝溶液混合，以获得2的稀释因子。
4. 负载10微升的预清洗和装配血细胞计数器室的总样本。
5. 计数活（白/透明细胞）和死亡人数（蓝色核）上的4×4平方细胞（参见图1B）。
6. 计算细胞的定式下列的总数:
   

3. SCP-1细胞的转染GFP

注意:为了观察并进入针织钛支架上我们标有绿色荧光蛋白（GFP）的细胞在一定培养期间SCP-1细胞的生长。 GFP的过表达是通过感染编码GFP的腺病毒颗粒来实现的。复制无能（-E1 / -E3）编码绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒颗粒用于感染SCP-1的细胞。通过收集重组腺病毒（Ad5的-GFP）转染HEK293T细胞（生物安全实验室II）的培养上清从史蒂芬·杜利教授¹³获得了病毒颗粒。三反复冷冻（-80℃）和解冻（37℃水浴）循环保证了没有，他K293T细胞保持存活，以产生新的病毒颗粒。使用这种腺病毒种子库可以有效地感染SCP-1细胞，而不会产生新的病毒颗粒。因此，感染的细胞可以在生物安全实验室一处理

1. 悬浮用的50,000个细胞/ ml的培养基中接种密度靶细胞（SCP-1细胞）。加入2毫升，每孔到6孔组织培养板。
2. 孵育在37℃下在标准细胞培养培养箱5％CO _{2，20％O 2}和90％湿度，直到SCP-1细胞达到70-80％铺满。
   注:会合取决于细胞的接种密度。对于上述的条件时，SCP-1细胞达到70-80％在1.5-2天汇合。
3. 在70-80％铺满，吸不培养基每毫升培养液中加入100μl腺病毒种子库。
   1. 个别地取决于病毒颗粒在各病毒本身的量确定的浓度范围编辑备料。在情况下，感染效率太低，纯化和浓缩使用各种市售试剂盒的病毒颗粒。
4. 在37℃下（5％CO _{2，20％O 2}和90％湿度）孵育在标准细胞培养孵化一小时。
5. 删除含有病毒种子储备培养基并将其收集处置。加入新鲜的培养液2毫升，每井的6孔培养板来补充的。
   1. 确保在处置之前，含中等病毒颗粒高压灭菌。
6. 评估细胞内GFP表达（感染效率）使用带有GFP LED立方体/过滤器设置的荧光显微镜在感染后24小时。
   1. 观察细胞的形态（ 图2）。细胞从培养塑料分离可以给假阳性结果。

4.针织钛支架的清洁

1. P花边高达5支架到50ml反应管。
2. 用30ml蒸馏水，去离子水洗净该支架（6-7毫米厚）三次，在室温下20分钟，使用转子条件（8 XG）。
3. 用30ml 1％的取代的蒸馏去离子水（重量/体积）的Triton-X-100溶液（溶解在蒸馏水去离子水），然后洗支架一次，在室温下20分钟，使用转子条件（8 XG） 。
4. 丢弃的Triton-X-100的溶液中，接着用30毫升蒸馏水 - 去离子水洗涤两次（每次5分钟，在室温下）保持转子条件（8 XG）。
5. 更换蒸馏水，去离子水。冲洗支架依次用试剂级99％丙酮，99％异丙醇和99％的乙醇（30ml每次）为2×5分钟的每个在超声浴（〜50赫兹，50瓦，220-240伏）。
6. 用30ml蒸馏水，去离子水再次洗涤三次5分钟，保持超声浴处理常数。
7. 放置scaffo为了在无绒布组织LDS至室温空气干燥过夜。
8. 用15磅高压灭菌该支架15分钟在121℃。
9. 作为协议的5所描述确认通过间接荧光清洗协议。

5.成像支架结构由间接荧光

备注:本协议通过使用荧光磺若丹明B上在586分之565纳米EX / EM波长给出了一个明亮的红色荧光间接免疫荧光支架描述结构的成像。但是，荧光团是可以改变的，以更好地适合于给定的显微镜设置或支架的可能自发荧光。

1. 制备在1％乙酸和存储的磺酰罗丹明B染色溶液（0.04％），在室温下避光。
2. 取24孔组织培养板中，并通过将它INS沉浸于500μl的磺酰罗丹明B染色溶液的清洗支架IDE井使用镊子。
3. 捕获使用荧光显微镜支架的负像。
   1. 拍照与RFP LED立方体/滤波器40分之531纳米的激发波长和四十零分之五百九十三纳米的发射波长设置的。可替代地选择具有荧光光谱观察者²⁰的帮助下适当激发和发射波长。磺酰罗丹明B在578纳米的高峰期激发和593纳米的峰值发射。
   2. 为了形象化的支架结构，拍照在较低的放大倍率， 例如，4X或10X（ 图3）。使用这些图片，确定的特性， 例如，孔大小和与ImageJ的的帮助下成形。
   3. 为了检测支架的杂质，拍照时的倍率， 例如，20X或40X，考虑到这会限制分析深度。确保灰尘颗粒/物质没有看到（见代表性的结果; 图URE 3）。

6. 在体外试验生物相容性

1. 在37℃的水浴中预加温培养基中。
2. 取24孔组织培养板和使用镊子，将清洗和消毒的支架中每个测试孔无菌。在预清洁生物安全柜我下工作！
3. 浸泡/孵化用培养基支架为约15分钟（每24孔组织培养板的孔500微升）中，为了从该支架的内部除去空气。
4. 与此同时，重悬500000的Ad-GFP感染的SCP1细胞于1ml培养基中。
5. 支架浸泡15分钟后，完全吸出介质关闭支架。
6. 用于接种细胞在支架上，免除小心在支架上（其被放置在24孔板）表面100微升细胞悬浮液。保持细胞悬浮液的最小体积，而接种的细胞，所以，以确保没有介质流ö支架的UT。
7. 孵育30分钟的细胞中，在37℃在标准细胞培养孵育箱（5％CO _{2，20％O 2}和90％湿度）。
8. 加入500μl更培养基并孵育在标准细胞培养孵化24小时（37℃，5％CO _{2，20％O 2}和90％湿度）。
9. 评估细胞附着图案和细胞使用荧光显微镜在支架表面上扩散。
   1. 拍照用GFP LED立方体/滤波器二十二分之四百七十零纳米的激发波长和四十二分之五百十纳米的发射波长设置的。或者选择适当的激发和发射波长的荧光光谱查看器的帮助。 GFP具有488nm的高峰期激发和507纳米的峰值发射。
   2. 为了在较低的放大倍数， 例如，4倍或10倍（ 图4）可视化细胞粘附模式拍摄的照片。为了观察细胞扩散更高的MAGnification（至少100X）需要 - 限制了聚焦深度。
10. 为进一步评估细胞在支架表面上铺展，固定用4％福尔马林的细胞并用细胞结构的传统的荧光染色， 例如，肌动蛋白丝（鬼笔环肽）进行。然而，适应的孵育时间和抗体的荧光标记，以适合个别脚手架特性， 例如，扩散时间或自体荧光^14。
11. 次日，更换培养基以除去非粘附细胞。
12. 通过如在协议7所述刃天青转换测量计算在支架上的贴壁细胞的百分比。

图5: 在体外试验时间安排 （ 一 ）电镀细胞的实验装置。 （B 请点击此处查看该图的放大版本。

7.刃天青转换测量

注:刃天青转化测定法用于测量线粒体活性，从而间接细胞增殖。刃天青还原成试卤灵产生荧光信号，这是基于与存活细胞数（ 图7A）相关的线粒体活性。

1. 完全吸从SCP-1细胞的培养液中，并丢弃到废物容器中。
2. 用DPBS除去脱落的细胞冲洗SCP-1细胞一次。添加每个含在支架上的SCP-1细胞在24孔组织培养板的孔500微升DPBS。
3. 覆盖所需上午细胞无菌刃天青工作溶液（在培养基0.25％刃天青）和'mount孵育在37℃下在标准细胞培养孵育箱（5％CO _{2，20％O 2}和90％湿度）中30分钟。
   1. 记下;孵育时间取决于细胞类型和细胞密度。它可以在10分钟和6小时之间变化。优化的温育时间为:SCP-1细胞是30分钟。
4. 作为背景对照，包括至少一个孔与刃天青工作溶液，但没有细胞，即在37℃下在标准细胞培养培养箱中培养（5％CO _{2，20％O 2}和90％湿度）为同一多少时间。
5. 转移100μl的空调上清液从24孔组织培养板的各孔于96微孔板。
6. 用1毫升DPBS在室温下5分钟洗涤剩余的细胞三次，以去除残留的刃天青工作溶液。第三次洗涤后添加培养基Ť直径:与SCP-1细胞的植入物（每24孔组织培养板的孔500微升），并继续在37℃下温育在标准细胞培养孵育箱（5％CO _{2，20％O 2}和90％湿度）进一步的时间过程的测量。
   1. 确保在该步骤（2-4），以尽量减少移液误差来设置重复。
7. 在此期间，将96微孔板入酶标仪并测量形成的试卤灵的荧光。
   1. 为了降低背景信号，在545纳米的激发波长和585nm的发射波长测量荧光。
   2. 或者选择适当的激发和发射波长的荧光光谱查看器的帮助。试卤灵具有572纳米的高峰期激发和585纳米的峰值发射。给定的信号强度是25个别读数（每孔25闪烁）的平均值。
8. 测量氟在条件培养基形成试卤灵的escence，使用底部光学器件。
   1. 作出这样的，增益取决于平均量刃天青转换并可以在10和4000之间变化的说明。调整吹打一个试卤灵的标准曲线，以便该荧光信号是低于最大信号强度可检测的80％（在此情况下，20,000）所使用的增益到各个酶标仪。对于SCP-1细胞的优化增益为800。
9. 减去背景信号（刃天青工作液没有细胞）从所述测试样品的信号。
10. 根据实验装置/宗旨，继续进一步的步骤:
11. 计算上使用的标准曲线的支架的细胞的生存力的百分比。分别使个体的标准曲线对所使用的每个细胞系。
12. 通过估算刃天青转换整个培养时间相对增加分析细胞生长/增殖。对于这个计算，设置作为基准1天刃天青转换。刚准备对这种分析的刃天青工作溶液。此外，孵育时间必须是不同的测量之间相等。
13. 重复刃天青转换测量的整个协议至少三次，以得到一致的结果。

8.活死细胞染色

1. 板与50,000个细胞/支架的接种密度在支架的SCP1细胞，并允许它在支架上保持的标准细胞培养条件下生长（参见方案1和2）。
2. 24-48小时后完全吸从SCP-1细胞的培养液中，并丢弃到废物容器中。
3. 用DPBS除去脱落的细胞冲洗SCP-1细胞一次。加入500微升DPBS每24孔组织培养板的孔，并孵育在室温下5分钟。
4. 染色SCP-1用荧光团（同时所有三个污渍）:
   1. 从现在开始保持在黑暗中的支架，以防止荧光漂白从白天！
   2. 设定的温育时间为30分钟，以允许在整个支架相等分布。如果转移到其他的支架，以确保最优化的温育时间，以适应个别脚手架特性（孔径，脚手架深度等 ）。
   3. 为了检测在支架上的活细胞，染色用钙黄绿素AM的细胞以2μM的终浓度（在培养基中）。
   4. 为了检测在支架上的所有细胞，染色用Hoechst 33342细胞在0.002微克/微升（在培养基中）的终浓度。
   5. 为了检测死细胞，孵育乙锭同二聚体，支架在4微米（在培养基中）的最终浓度。
5. 温育时间之后，洗涤细胞用DPBS 3次（1毫升，每孔）在室温下，每次5分钟。
6. 立即拍照S按使用荧光显微镜。
   1. （分别为二十二分之四百七十零nm和四十二分之五百十纳米，激发和发射波长）取钙黄绿素的照片（活细胞）用GFP LED立方体/过滤器集。或者选择一个适当的激发和发射波长的荧光光谱查看器的帮助。钙黄绿素具有488nm的高峰期激发和507纳米的峰值发射。注:确保不使用GFP转染细胞与钙黄绿素或其他绿色荧光染料荧光染色。
   2. 取的Hoechst 33342的照片使用DAPI LED立方体/滤波器44分之357纳米的激发波长和六十零分之四百四十七纳米的发射波长设置的。或者选择适当的激发和发射波长的荧光光谱查看器的帮助。赫斯特33342具有347纳米的高峰期激发和483纳米的峰值发射。
   3. 就拿乙锭同型二聚体的照片与RFP LED立方体/过滤器设置（激发和发射波长Ø˚F四十零分之五百三十一nm和四十零分之五百九十三纳米，分别）。或者选择适当的激发和发射波长的荧光光谱查看器的帮助。乙锭同型二聚体具有530nm的高峰期激发和618纳米的峰值发射。

Results

初步结果表明，所描述的新颖的核植入物不仅具有良好的阻尼特性，而且是生物相容与SCP-1的细胞。在植入物的生产过程中，它与强腐蚀性和有毒物质（润滑剂，媒染剂，电解抛光溶液）接触。用间接荧光染色技术的帮助下，我们能够可视化剩余的杂质，从而优化示出在支架上物质负载显著减少清洁协议; 图3示出了建立的清洁协议的效率。

用于关节成形术治疗是由在蜂窝材料的界面发生的事件来确定植入物的成功与否。 图4示出了附连在支架后电镀的24小时的细胞，如在协议部分6，一种显著反式描述观察到SCP-1细胞的染效率，因为我们可以像在支架上（参照图2）间充质基质细胞前体细胞的生长分析。直接可视确认支架的生物相容性和也示出了支架表面上的附着图案（ 图4）。荧光染色可以做进一步的检查与和支架表面上散布细胞相互作用。

Discussion

在支架表面起着其相互作用与体内周围组织，从而确定植入官能耐久性重要的作用。因此，支架的生物相容性，通过使用细胞（SCP1细胞系） 的体外测定，对支架镀时的研究。

与薄和光学透明支架功能良好的显微技术适合较差的非透明支架研究生物相容性。这主要是由于非透明支架防止未经显著失真¹⁵穿透光。为了部分解决这些问题，我们在此建立在/在使用各种荧光针织钛制成的支架细胞评价的方法。

为了使编织接着钛导线折叠，材料抵接强腐蚀性和有毒物质（润滑剂，媒染剂，电-polishing溶液）中，如果迹线保持在/脚手架上可能改变支架的生物相容性。随着开发间接荧光协议的帮助（协议5），我们可以想像的支架结构。此外，脚手架特性， 例如 ，材料的厚度，各个孔的尺寸和形状，或结缔组织密度，使用ImageJ进行分析。较高放大萤光显微镜图像中允许的支架以及所述支架表面上的可视化的杂质。 图3b从而表示成功开发清洁协议的验证结果。这种间接染色方案的原理可以很容易...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/24/48 孔板，T25/ T75 培养瓶	Greiner Bio-One GmbH	*
* 24 孔板	Greiner Bio-One GmbH	CELLSTAR 662 160
* 48 孔板	康宁公司美国	3548
* 6 孔板	Falcon	353046
* T25	Greiner Bio-One GmbH	690 175
* T75	Greiner Bio-One GmbH	658 175
醋酸，纯度和乙醇; 99.0%	Carl Roth	3738.4
丙酮	Carl Roth	5025.1
Axioplan-2	Carl Zeiss，德国
生物安全柜	Thermo Scientific	safe 2020
钙黄绿素乙酰氧基甲酯（钙黄绿素 AM）	Sigma	17783
细胞培养培养器	粘合剂，图特林根，德国	9040-0078
过滤装置（0.22 µm）	Millipore， IRL	SLGP033RS
离心机 5810 R 和 5417 R	Thermo Fisher Scientific， NY	Megafuge 40R
二甲基亚砜 （DMSO）	Carl Roth	4720.2
Dulbecco's PBS，不含 Ca 和Mg	Sigma	H15-002
乙醇 99%	SAV 液体产品GmBH	475956
乙锭同源二聚体	Sigma	46043
EVOS 荧光成像系统	Life technologies	AMF4300
胎牛血清 （FCS）	Gibco	10270-106
血球计数器	美国宾夕法
Hoechst 33342	Sigma	14533-100MG
针织钛核植入物	Buck co &KG，德国
MEM α 修饰，含无核苷的谷氨酰胺	Sigma	E15-832
Omega 酶标仪	BMG Labtech，德国	FLUOstar Omega
青霉素/链霉素	Sigma	P11-010
刃天青钠盐	Sigma	199303-1G
磺酰罗丹明 B 钠盐	Sigma	S1402-1G
试管旋转器	Labinco BV，荷兰	型号 LD-76
TRIS（羟甲基）氨基甲烷	Carl Roth	AE15.1
Triton	Carl Roth	3051.2
台盼蓝 0.5%	Carl Roth	CN76.1
胰蛋白酶/EDTA	Sigma	L11-004