在糖尿病伤口愈合模型中构建与移植脂肪源性干细胞（ASC）片层

摘要

脂肪来源的干细胞（ASCs）可从正常大鼠的脂肪组织中轻松分离和获取。利用细胞片工程技术可制备ASC片，并将其移植到具有全层皮肤缺损且骨组织外露的Zucker糖尿病肥胖大鼠体内，随后覆盖双层人工皮肤。

摘要

人工皮肤在临床实践中已取得显著的治疗效果。然而，对于血液循环障碍或创面较大的糖尿病患者，人工皮肤治疗可能需要较长时间。基于细胞的疗法已成为治疗糖尿病溃疡的一种新技术，而细胞片工程技术则提高了细胞移植的疗效。已有大量研究报告指出，脂肪来源的干细胞（ASCs）作为一种间充质基质细胞（MSC），因其在脂肪组织中相对丰富且易于获取，与其他组织来源的MSC相比具有更高的可及性，因而展现出良好的治疗潜力。因此，ASCs似乎是用于治疗的理想干细胞来源。本研究中，利用温度响应性培养皿及含抗坏血酸的常规培养基，成功制备了来自正常Lewis大鼠附睾脂肪组织的ASC细胞片。随后将ASC细胞片移植至Zucker糖尿病肥胖（ZDF）大鼠的创面，ZDF大鼠是2型糖尿病和肥胖的动物模型，其伤口愈合能力受损。在大鼠颅后背侧制造创面后，将ASC细胞片移植至创面，并以双层人工皮肤覆盖细胞片。接受ASC细胞片移植的ZDF大鼠其伤口愈合情况优于未接受细胞片移植的ZDF大鼠。该方法存在一定局限性，即ASC细胞片对干燥环境敏感，需维持湿润的创面环境。因此，使用人工皮肤覆盖ASC细胞片以防止其干燥。同种异体ASC细胞片联合人工皮肤的移植策略，也可能适用于其他难治性溃疡或烧伤，例如外周动脉疾病和胶原血管病相关的创面，以及营养不良或正在使用类固醇的患者。因此，该治疗方法可能是改善糖尿病创面愈合治疗选择的第一步。

引言

全球糖尿病患者人数正在不断增加，2015年已达到4亿人¹；据估计，15%至25%的糖尿病患者存在下肢糖尿病溃疡恶化的风险²。下肢糖尿病溃疡难以治愈，即使完全康复后也可能需要长期的治疗和康复训练。漫长的治疗周期常常显著降低患者的生活质量。因此，必须开发能够减轻或防止病情恶化的新型疗法，以治疗糖尿病创面。为了评估糖尿病创面的愈合效果，我们优化了一种在大鼠中建立的糖尿病溃疡创面愈合模型，该模型可模拟实际临床条件，并评估了利用细胞片工程技术移植脂肪来源干细胞（ASC）片是否能够加速创面愈合。

间充质基质细胞（MSCs）因其具有自我更新能力、免疫调节作用以及向多种细胞谱系分化的潜能，在促进伤口愈合方面展现出巨大潜力³。脂肪来源的基质细胞（ASCs）是一类来源于脂肪组织的MSCs，相较于其他组织来源的MSCs，其具有多种优势，包括更强的促血管生成潜能和旁分泌活性^4,5。脂肪组织在人体内相对丰富，且易于获取，可通过微创手段进行采集。因此，ASCs已被用于伤口愈合的实验性研究^6,7。

方案

以下所示的所有实验方案均经东京女子医科大学医学院动物福利委员会批准，并严格遵守《动物实验正当实施指南》的全部要求。

1. 动物、仪器、培养基和培养皿的准备

1. 使用含20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的α最小必需培养基配制完全培养基。4 °C下保存数月，待用。
2. 采用成年雄性ZDF大鼠作为2型糖尿病肥胖模型。取雄性Lewis大鼠的脂肪垫分离脂肪组织，用于制备细胞片层。

2. rASCs 的分离与培养

1. 在异氟烷全身麻醉下，从Lewis大鼠（雄性，8 - 33周龄）获取脂肪组织。
   1. 准备啮齿类动物机械呼吸机和4%异氟烷。准备若干无菌棉签、清洁纱布、手术刀、持针器、手术剪、一把镊子和5-0尼龙缝线。对手术器械和用品进行灭菌处理。
   2. 准备一个含有10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的100 mm培养皿，用于临时保存获取的脂肪组织。手术开始前，使用天平称量含PBS的培养皿重量，以测定所采集脂肪组织的重量。将外科手术器械和用品摆放于无菌铺巾上。
   3. 使用3%–4%的异氟烷麻醉大鼠 通过 使用啮齿类动物呼吸机，并在手术期间将大鼠维持于2-3%异氟烷。通过观察每只大鼠呼吸的深度和频率来监测麻醉深度。
   4. 佩戴无菌手套后，将大....

结果

本方案旨在建立一种针对难治性糖尿病伤口的新型细胞疗法。简而言之（如图1所示），利用细胞片工程技术从正常大鼠获取同种异体大鼠脂肪源性干细胞（rASC）片，并通过双层人工皮肤将其移植至糖尿病大鼠的全层皮肤缺损部位。图2展示了质量良好的rASC片（图2A）和质量较差的rASC片（图2B）的光学显微镜图像。当将ASC接种到新的培养皿中时，应在培养箱内缓慢地前后、左右轻轻摇动培养皿，以实现rASC的均匀接种并形成厚度均一的rASC片（图2A）。如果rASC无法在培养皿表面均匀贴附和培养，则无法收获完整的连续ASC片（图2B）。图3显示了在室温下成功收获的、保持完整结构的ASC片，前提是ASC在培养皿表面实现了均匀贴附。通常情况下，rASC片可用镊子进行操作。如有必要，可使用转移膜将细胞片从培养皿转移至伤口部位，例如当细胞片较为脆弱易碎时。

讨论

成功培养rASC片的关键步骤如下：1）在温度响应型培养皿上进行培养时，必须将温度维持在约37 °C。在制备rASC片的过程中，所有操作均在37 °C的加热板上进行，所有试剂均预热至37 °C，以防止细胞从培养皿上自发脱落³¹。2）必须密切监测受体ZDF大鼠，防止其移除非粘附性敷料，这对于rASC片的成功移植至关重要。若敷料被移除，必须立即更换新的非粘附性敷料，以防止移植的ASC片从伤口部位脱落。

采用该方法，通常在将第3代细胞接种于温度响应性培养皿后5至7天内获得rASC细胞片。生成rASC细胞片所需的培养时间可根据初始细胞密度以及添加含AA的完全培养基的时间进行调整。若rASC细胞片在细胞培养过程中从培养皿脱落，应重新制备rASC细胞片，并额外准备培养皿以应对细胞脱落的情况。

本方案的局限性如下：1）使用温度响应性培养皿时，必须严格控制温度，确保整个过程中温度维持在约37 °C。2）获取rASC细胞片后，必须使用特殊医疗器械以维持湿润环境，因为rASC细胞片对干燥条件敏感。3）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-MEM 谷氨酰胺	Invitrogen	32571-036	加利福尼亚州卡尔斯巴德
胎牛血清（FBS）	Japan Bioserum Co Ltd.	S1650-500
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140-122
胶原酶A	Roche Diagnostics	10 103 578 001	德国曼海姆
60 cm2 Primaria 细胞培养皿	BD Biosciences	353803	新泽西州富兰克林湖
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	1490-144
0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）	Life Technologies	25200-056
L-抗坏血酸磷酸镁盐 n-水合物	Wako	013-19641
35 mm 温度响应性细胞培养皿（UpcellTM）	CellSeed	NUNC-174904	日本东京
微型加热板（MP-1000）	Kitazato Science Co., Ltd.	1111
啮齿类动物机械呼吸机	Stoelting	#50206	伊利诺伊州伍德代尔
4% 异氟烷	Pfizer Japan	114-13340-3	日本东京
人工皮肤（Pelnac®）	Smith & Nephew	PN-R40060	日本东京
非粘连性敷料（Hydrosite plus®）	Smith & Nephew	66800679	在美国称为 Allevyn non-adhessing®
5-0 尼龙缝线	Alfresa	EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR 管	greiner bio-one	227 261
15 mL 离心管	Corning Incorporated	430791
14 GOLDMAN-FOX 骨膜剥离器	Hu-Friedy	P14	伊利诺伊州芝加哥