需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

同时检测IgG和IgM自身抗体的双色抗原微阵列的制备

12.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54543

⸱

2016年9月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

本文内容

摘要

本文介绍一种可生成定制化抗原微阵列的方法，可用于同时检测人和小鼠血清中的IgG和IgM自身抗体。该阵列可实现针对任何目标抗原或表位的抗体高通量、定量检测。

摘要

自身抗体是针对自身抗原的抗体，在多种疾病状态下存在，并可作为疾病活动性的标志物。针对特定抗原的自身抗体水平通常采用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术进行检测。然而，使用ELISA对多种自身抗体进行筛查可能耗时较长，并需要大量患者样本。抗原微阵列技术是一种可替代的方法，能够以多重方式对自身抗体进行筛查。在该技术中，利用机器人微阵列点样仪将抗原点样于特殊涂层的显微镜载玻片上。将载玻片与患者血清样本孵育后，加入荧光标记的二抗，以检测血清中自身抗体与抗原的结合情况。通过荧光信号扫描仪对载玻片进行扫描，从而揭示并定量自身抗体的反应性。本文描述了定制抗原微阵列的构建方法。我们目前的阵列使用9个固相针打印，最多可包含162种抗原，每种抗原均重复点样两次。通过更换微阵列点样仪所用源头板中的抗原，可轻松实现阵列的定制化。我们开发了一种双色二抗检测方案，可在同一载玻片表面区分IgG和IgM的反应性。该检测系统已优化用于研究人和小鼠自身抗体的结合特性。

引言

许多疾病状态下均存在自身抗体，且这些自身抗体常具有直接的致病活性1。鉴定自身抗体对于某些疾病的诊断、疾病预后的判断以及可能从特定治疗中获益的患者分类具有重要意义2。通常使用ELISA技术在患者血清中检测自身抗体；然而，利用该技术对多种抗原进行筛查时工作量大，且需要消耗大量患者样本。因此，亟需新技术以实现更大规模的自身抗体谱分析。

抗原微阵列技术是一种蛋白质组学技术，可实现对自身抗体的多重分析3。该过程的第一步是使用机器人微阵列仪将抗原文库点样到载玻片表面。将稀释后的血清与芯片杂交，然后加入荧光标记的二抗。通过微阵列扫描仪扫描芯片，根据荧光强度对自身抗体反应性进行可视化和定量。与ELISA技术相比，抗原微阵列在自身抗体筛查中具有多项优势：1）仅需几微升血清即可同时分析针对多种抗原的自身抗体；2）抗原用量极少，因每点仅需纳升级别的抗原；3）与ELISA相比具有更高的灵敏度3；4）可同时但独立地检测多种抗体同种型。抗原微阵列已被用于类风湿关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中的自身抗体谱型分析4-6。在这三种疾病中，均通过大规模微阵列自身抗体谱型分析获得了关于疾病发病机制的新认识。

本文介绍了一种使用硝酸纤维素包被载玻片制备抗原微阵列的实验方案。利用该技术，可将包括蛋白质、多肽和细胞裂解物在内的多种抗原固定于载玻片表面。通过在存放抗原文库的源板中加入感兴趣的抗原，可轻松定制所需的微阵列。此外，我们还展示了如何利用一对二抗在同一张载玻片表面区分IgG和IgM的反应性。目前，该技术已优化用于检测人和小鼠体内的自身抗体。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 抗原稀释与抗原微阵列的制备

  1. 将抗原用 PBS 稀释至终浓度为 0.2 mg/ml。使用含 9 根针头的微阵列点样仪，以双份形式点样最多 162 种不同的抗原。在抗原文库中包含 IgG 和 IgM 抗原作为阳性对照，同时设置仅含 PBS 的阴性对照。
  2. 向384孔源板中每孔加入20 µl的每种抗原。将抗原按与打印头设置相对应的分组方式加入源板中。例如，当使用9个点样针打印时，将抗原按每组9个进行排列。
  3. 用铝箔覆盖源板，并在 -80 °C 冷冻，直至准备打印芯片阵列。
  4. 将固体微阵列点样针置于去离子水中，于超声波清洗仪中孵育，每次1分钟，重复3次。将点样针放入支架中晾干，随后将其排列至微阵列打印头中。对于9根点样针，采用3×3排列方式。
  5. 设置点样仪的打印程序，包括点样针数量、打印载玻片数量、每张载玻片上的点样区域数以及每种抗原的重复点样次数。通常使用9根针、70张载玻片、每张载玻片2个点样区域，每种抗原设置2个重复点样。编程控制点样仪在不同抗原组之间用水对点样针进行超声清洗。
  6. 解冻源板，然后以 100 × g 离心 1 分钟。将源板放置于微阵列仪指定位置。移除即将点样第一组抗原上方的箔膜部分。
  7. 将未打印的载玻片排列在点样仪表面，运行打印程序。在室温下进行打印，设置点样仪的湿度为55%–60%，并启用点样仪内置的加湿器。
  8. 每次在所有载玻片上打印完一组抗原后，暂停微阵列仪。用铝箔覆盖已打印的抗原（防止蒸发），并揭开下一组待打印的抗原。继续运行打印程序。
  9. 所有抗原点样完成后，用新的铝箔覆盖源板，并于 -80 °C 冻存。将点样后的芯片放入芯片盒中，真空密封。芯片可在次日使用，或于一个月内使用。

2. 使用稀释血清探测抗原微阵列

  1. 使用孵育室将载玻片放入框架中。向每个芯片表面加入 700 µl 封闭缓冲液（含 2.5% [体积/体积] 胎牛血清（FCS）和 0.1% [体积/体积] Tween 20 的 PBS 溶液）。
  2. 用粘性薄膜覆盖框架，并将其放入含有湿纸巾的密封容器中。在 4 °C 条件下于摇床上孵育过夜（O/N）。
  3. 用封闭缓冲液将血清样本稀释 1:100。吸除芯片上的封闭液，向每个芯片表面加入 500 µl 稀释后的样本。
  4. 用粘性薄膜覆盖，于 4 °C 在摇床上孵育 1 小时。
  5. 用封闭缓冲液稀释二抗。对于人类研究，将 Cy3 标记的山羊抗人 IgG 抗体稀释至 0.33 µg/ml，将 Cy5 标记的山羊抗人 IgM 抗体稀释至 0.25 µg/ml。对于小鼠研究，将 Cy3 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体稀释至 0.38 µg/ml，将 Cy5 标记的山羊抗小鼠 IgM 抗体稀释至 0.7 µg/ml。
  6. 吸除芯片上的样本，用洗涤缓冲液（含 0.1% Tween 20 的 PBS）冲洗芯片表面 4 次。将缓冲液倒在载玻片上，迅速甩去。
  7. 向每个芯片表面加入 700 µl 封闭缓冲液，在室温下于摇床上孵育 10 分钟。重复该洗涤步骤两次。
  8. 向每张载玻片表面加入 500 µl 稀释后的二抗，并用粘性薄膜覆盖。在 4 °C 条件下于摇床上孵育 45 分钟。
  9. 吸除载玻片上的二抗混合物，按上述方法冲洗 4 次。再按上述方法用 700 µl 封闭/稀释缓冲液洗涤载玻片 3 次。
  10. 将载玻片从框架中取出，放入浸没于 PBS 中的金属载玻片架中。在室温下以轨道振荡方式孵育 20 分钟。随后转移至新的 PBS 容器中，继续振荡孵育 20 分钟。
  11. 将载玻片架置于去离子水中 15 秒。再将架转移至新的水容器中，继续孵育 15 秒。
  12. 为干燥载玻片，将载玻片架置于离心机中的 ELISA 板适配器上，在室温下以 220 × g 离心 5 分钟。
  13. 将载玻片放入避光盒中，待扫描时使用。

3. 扫描抗原微阵列并导出数据

  1. 使用能够检测 Cy3 和 Cy5 荧光信号的微阵列扫描仪扫描载玻片。为调整扫描仪的光电倍增管（PMT）水平，预先扫描仅用二抗探针处理过的载玻片。
    注意：该载玻片应包含完整的抗原文库，包括阳性对照（IgG 和 IgM）以及阴性对照（PBS）。预扫描是一种低分辨率扫描，可帮助用户快速找到最佳的 PMT 设置。
  2. 设置 PMT 值，使人类 IgG 特征（在 Cy3 通道）和人类 IgM 特征（在 Cy5 通道）具有相似的中位荧光强度减去背景值（MFI-B）（通常为 40,000）。通过点击 "hardware" 按钮来设置 PMT 值。一旦设定，保持这些 PMT 设置不变。
  3. 通过点击 "scan" 按钮，在两个通道上扫描实验载玻片。每次扫描后保存载玻片图像（两个通道）。
  4. 使用 "file" 按钮将待分析的载玻片载入微阵列软件中。
  5. 使用 "file" 按钮加载基因阵列列表（GAL）文件。GAL 文件包含阵列布局及各阵列特征的身份信息。
  6. 将阵列模板覆盖在扫描图像上，使阵列特征尽可能与模板对齐。
  7. 点击 "align" 按钮，使所有区块中的特征与模板对齐。程序通常能识别圆形特征的轮廓，但可能需要进行一些手动调整。这些调整可通过进入特征模式完成。软件随后将计算每种抗原的 MFI-B 值。
  8. 使用 "file" 按钮将这些结果导出为文本文件。

4. 使用微阵列显著性分析（SAM）分析阵列数据

  1. 将各个文本文件导入 Excel，并确定包含 Cy3 和 Cy5 通道的 MFI-B 的列。
  2. 计算重复特征值的平均值。
  3. 对于任何负的 MFI-B 值，将其替换为 10；通过将原始 MFI-B 值除以 100，再计算以 2 为底的对数，对数据进行转换。
  4. 使用微阵列显著性分析（Significance Analysis of Microarrays, SAM）对对数转换后的数据进行分析，方法如前所述7。
  5. 对于包含两组的研究（例如，健康对照组与患者组），将其中一组标记为 "1"，另一组标记为 "2"。在 SAM 中使用两组非配对分析，以鉴定两组间抗原反应性存在显著差异的指标（q 值 < 0.05）。
  6. 使用聚类和热图生成软件制作用于展示的图像8。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

抗原被排列在384孔板中，并由机器人微阵列点样仪打印到载玻片上，如图1所示。图2展示了放置在带有孵育腔室框架中的载玻片以及处理后的扫描载玻片。图3展示了阳性和阴性对照载玻片。阴性对照载玻片仅使用二抗进行探针检测，而阳性对照载玻片则使用系统性红斑狼疮患者的血清进行探针检测。通过使用两种分别标记的二抗，可在同一张载玻片表面区分IgG和IgM的反应性。图4展示了在广泛血清稀释度范围内，IgM抗体针对单链DNA（ssDNA）以及IgG抗体针对核糖体P蛋白（Ribo P）的荧光强度。本实验中使用了已知对Ribo P具有反应性的系统性红斑狼疮患者的阳性对照血清。在所有血清稀释度下，IgM通道均呈现线性响应；IgG通道在MFI-B值达到约30,000之前也呈现线性响应。超过该点后，信号开始饱和，抗Ribo P抗体浓度的增加不再引起MFI-B值的相应升高。图5展示了如何利用该阵列检测人血清中的类风湿因子。本研究中使用了来...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述方案利用抗原微阵列技术对抗体进行定量检测。与传统的ELISA方法相比，抗原微阵列在自身抗体筛查中具有多项优势。首先，多种类型的抗原（包括核酸、蛋白质、多肽和细胞裂解物）均可固定于硝酸纤维素包被的载玻片上，从而实现对多种自身抗体的高通量同步筛查。此外，由于每个载玻片上仅需点样纳升级体积的抗原，因此制备微阵列仅需微克量级的抗原。该方法对患者样本的需求量也极低，在1:100的样本稀释比例下，仅需5 μl血清即可完成一次阵列表面的孵育检测。最后，已有研究表明，固定于硝酸纤维素膜上的微阵列在自身抗体检测中的灵敏度高于传统ELISA9。

除了使用抗原微阵列筛选自身抗体外，该阵列还可用于检测对非自身蛋白（例如，病毒蛋白）的反应性，确定单克隆抗体的特异性，以及如先前所述测量移植中非HLA抗体的水平9-12。抗原微阵列还可用于进行详细的表位定位实验，其中将单一蛋白的重叠肽段点样于固相载体上。最近一项研究采用该方法鉴定了系统性红斑狼疮患者自身抗体所靶向的U1-70K蛋白的表位13。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

A.C. 获得了加拿大心脏与中风基金会和再生医学培训项目（加拿大卫生研究院）提供的博士后奖学金支持。F.Y.Y.H. 得到了再生医学培训项目的支持。本研究由安斯泰来制药加拿大公司提供的资助支持。我们还要感谢多伦多大学的 Mark Menenghini 博士提供 Axon 微阵列扫描仪。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
核糖体P0Diarect14100用PBS稀释至0.2 mg/ml
人IgGJackson Immuno009-000-003用PBS稀释至0.2 mg/ml
人IgMJackson Immuno009-000-012用PBS稀释至0.2 mg/ml
小鼠IgGSigma-AldrichI5381用PBS稀释至0.2 mg/ml
小鼠IgMBiolegend401601用PBS稀释至0.2 mg/ml
双链DNASigma-AldrichD1626用PBS稀释至0.2 mg/ml
单链DNASigma-AldrichD8899用PBS稀释至0.2 mg/ml
微阵列点样仪VirtekVersArray Chipwriter Pro多种类型的点样仪均适用
实心打印针Arrayit CorporationSSP015
机器人微阵列点样仪软件VirtekChipwriter Pro 
FAST载玻片（2孔垫）GVS Northa America10485317
FAST框架GVS Northa America10486001
FAST孵育室（2孔垫）GVS Northa America10486242
384孔板Whatman7701-5101
板封膜机VWR60941-062
铝箔板盖VWR60941-124
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
胎牛血清Invitrogen12483020
Cy3标记的山羊抗人IgGJackson Immuno109-165-096使用50%甘油中的工作液
Cy5标记的山羊抗人IgMJackson Immuno109-175-129使用50%甘油中的工作液
Cy3标记的山羊抗小鼠IgGJackson Immuno115-165-071使用50%甘油中的工作液
Cy5标记的山羊抗小鼠IgMJackson Immuno115-175-075使用50%甘油中的工作液
微阵列扫描仪Molecular DevicesAxon 4200A
微阵列软件Molecular DevicesGenepix 6.1
聚类分析软件eisenlab.orgCluster 3.0
热图软件eisenlab.orgTreeview 1.60
微阵列统计分析软件Stanford UniversitySAM 4.0（微阵列显著性分析）

参考文献

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224(2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555(2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

IgG IgM PBS
同时检测IgG和IgM自身抗体的双色抗原微阵列的制备
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。