双色抗原微阵列产生的IgG和IgM自身抗体的同时检测

摘要

我们在这里描述了一种生成可定制抗原微阵列的方法，该方法可用于同时检测人类和小鼠的血清 IgG 和 IgM 自身抗体。这些芯片可对针对任何抗原或目标表位的抗体进行高通量和定量检测。

摘要

自身抗体是针对自身抗原的抗体，存在于许多疾病状态中，可以作为疾病活动的标志物。针对特异性抗原的自身抗体水平通常使用酶联免疫吸附测定 （ELISA） 技术进行检测。然而，使用 ELISA 筛选多种自身抗体可能非常耗时，并且需要大量患者样本。抗原微阵列技术是一种可用于以多重方式筛选自身抗体的替代方法。在这种技术中，抗原被用机器人微阵列仪排列到特殊涂层的显微镜载玻片上。用患者血清样品探测载玻片，随后加入荧光标记的二抗以检测血清自身抗体与抗原的结合。通过使用可检测荧光信号的扫描仪扫描载玻片来揭示和定量自身抗体反应性。在这里，我们描述了生成定制抗原微阵列的方法。我们目前的阵列印有 9 个实心针，可以包含多达 162 个抗原，一式两份。通过改变微阵列仪使用的源板中的抗原，可以轻松定制阵列。我们开发了一种双色二抗检测方案，可以区分同一玻片表面的 IgG 和 IgM 反应性。该检测系统已经过优化，可用于研究人抗体和小鼠自身抗体的结合。

引言

自身抗体存在于许多疾病状态中，并且通常具有直接的致病活性¹。自身抗体的鉴定对于某些疾病的诊断、疾病结局的预后以及可能从特定治疗中受益的患者的分类很重要²。通常使用 ELISA 技术在患者血清中鉴定自身抗体;然而，使用这种技术筛选多种抗原很费力，并且会消耗大量患者样本。因此，需要新技术来更大规模地分析自身抗体。

抗原微阵列技术是一种蛋白质组学技术，允许以多重方式分析自身抗体³。在此过程的第一步中，使用机器人微阵列仪将抗原文库排列到载玻片表面。用稀释的血清探测载玻片，然后加入荧光标记的二抗。通过使用微阵列扫描仪扫描载玻片来观察抗体反应性，并通过荧光强度进行定量。与 ELISA 技术相比，抗原微阵列在筛选自身抗体方面具有多种优势：1） 它们只需要微升血清即可同时分析针对多种抗原的自身抗体，2） 它们很少使用抗原，因为只有纳升抗原被发现到阵列上，3） 与 ELISA 相比，它们具有更高的灵敏度³ 和 4） 它们允许同时， 单独检测多种抗体同种型。抗原微阵列已用于分析自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮）中的自身抗体^4-6。在所有这三种疾病中，通过使用芯片大规模分析自身抗体，获得了对疾病发病机制的新见解。

这里我们描述了一种使用硝酸纤维素包被载玻片生成抗原微阵列的方案。使用这种技术可以将各种抗原（包括蛋白质、肽和细胞裂解物）排列到载玻片上。通过将目标抗原包含在保存抗原文库的源板中，可以轻松定制阵列。此外，我们还展示了如何使用一对二抗来分离同一玻片表面上的 IgG 和 IgM 反应性。我们现在已经优化了这项技术来测量人类和小鼠的自身抗体。

方案

1.稀释抗原和生成抗原微阵列

1. 稀释在PBS中的抗原，以0.2毫克/毫升的最终浓度。打印一式两份可达162独特的抗原与9针的微阵列的配置。包括在抗原库作为阳性对照IgG和IgM的抗原。包括的PBS仅作为阴性对照。
2. 加入20微升的每种抗原到384孔源板。添加抗原到源盘在镜像打印头的设置团体（ 例如 ，安排抗原的9组时9引脚用于打印）。
3. 盖源板箔片和冷冻在-80°C，直到准备打印阵列。
4. 通过在超声处理浴使用去离子水将其培养为3×1分钟清洗固体微阵列引脚。在机架的地方针脚干燥，然后安排打印头芯片的引脚。对于9针，使用3×3的配置。
5. 对于打印程序微阵列通过设置打印头数针运行，幻灯片的数量来打印，垫片的数目在每个滑动，并为每个抗原重复点的数目。通常情况下，使用9销70滑动，第2焊盘/滑动，并为每个抗原2重复点。计划到微阵列销超声处理在水中抗原的不同群体之间。
6. 解冻源盘和在100×g的1分钟，然后离心板。将源盘在微阵列指定地点。除去被覆盖要打印的抗原的第一组的箔的部分。
7. 排列在表面点样仪和运行打印程序未打印幻灯片。在室温打印幻灯片与湿度对点样仪设定在55 - 60％，而阵列机加湿器构建。
8. 每一组抗原被印在所有的幻灯片后，暂停微阵列。覆盖只是印有铜箔的抗原（防止蒸发），并发现要打印抗原的下一组。继续打印程序。
9. 毕竟抗原已打印，覆盖源PL吃了在-80℃的新的金属箔片和冻结。将在滑动盒和真空密封打印幻灯片。载玻片可使用第二天或长达一个月后。

2.探测抗原基因芯片与血清稀释

1. 将滑入使用培养室帧。加入700微升封闭缓冲液（2.5％[体积/体积]胎儿小牛血清（FCS），0.1％[体积/体积]吐温20在PBS中）的每个阵列表面。
2. 放置在框架和地点粘合膜在用一块湿纸巾的密封容器中。在摇杆孵育O / N在4℃。
3. 在封闭缓冲液100:稀释血清样品1。吸阻塞来自阵列溶液，并添加500μl的稀释样品至每个阵列的表面上。
4. 带粘接膜覆盖，并于4℃用摇动孵育1小时。
5. 稀释的二抗在封闭缓冲液。对人类的研究，稀一个Cy3标记的山羊抗 - 人IgG抗体以0.33微克/毫升和Cy5标记的山羊抗 - 呼玛Ñ​​的IgM抗体至0.25微克/毫升。对小鼠的研究中，稀一个Cy3标记的山羊抗小鼠IgG抗体至0.38微克/毫升和Cy5标记的山羊抗小鼠IgM抗体至0.7微克/毫升。
6. 从阵列吸的样品和冲洗阵列表面4次漂洗缓冲液（在PBS中的0.1％吐温20）。倒入缓冲到到幻灯片和快速轻弹关闭。
7. 加入700μl封闭液与摇摆洗每个阵列表面和孵化10分钟，在室温中。重复洗涤步骤两次。
8. 加入500μl稀释的第二抗体与各滑动表面并与粘合剂膜覆盖。孵育45分钟，在4℃下用摆动。
9. 从幻灯片吸二级抗体混合物作为冲洗上述4倍。洗涤滑动用封闭/稀释缓冲液700微升如上3次。
10. 除去从浸渍在PBS中的金属滑动机架帧和地方幻灯片。孵育在室温20分钟以轨道振荡。在PBS的新容器中，并培育另一个20米在发抖。
11. 地方滑动架中的去离子水15秒的容器。安置机架在水的新容器和孵化另一个15秒。
12. 要干片，离心机和旋转220 XG ELISA板适配器，在室温下5分钟的地方滑架上。
13. 放置在不透光的盒滑动，直到准备好进行扫描。

3.扫描抗原微阵列和导出数据

1. 扫描载玻片使用​​微阵列扫描仪，可以检测Cy3和Cy5的荧光信号。为了调整扫描器的光电倍增管（PMT）的水平，预扫描只与二次抗体探测的幻灯片。
   注:该幻灯片应该有印有包括正（IgG和IgM）的全部抗原库以及阴性（PBS）的控制。预扫描是低分辨率扫描，允许用户迅速地找到最佳的PMT设置。
2. 设置PMT值，以便人IgG等功能（详见Cy3的信道）和嗡嗡声IgM的功能（在Cy5的通道）也有类似的中位数荧光强度减去背景（MFI-B）（通常为40,000）。 PMT中水平通过按下"硬件"按钮组。一旦设定，保持这些PMT设置不变。
3. 通过按下"扫描"按钮扫描上的两个通道中的实验滑动。每次扫描后保存幻灯片图像（两个通道）。
4. 加载滑待分析成通过使用"文件"按钮微阵列的软件。
5. 通过使用"文件"按钮加载基因数组列表（GAL）文件。在GAL文件具有与阵列特征的身份阵列的布局。
6. 将在扫描图像阵列模板，以便阵列特征密切模板匹配越好。
7. 对齐中的所有块的特征与通过按下"调整"按钮的模板。该计划通常会发现的圆形特征的轮廓，但一些手动调整可能是必要的。这些调整可以通过输入功能模式进行。然后软件将每个抗原的计算MFI-B。
8. 使用"文件"按钮将这些结果导出为文本文件。

4.使用微阵列显着性分析分析阵列数据（SAM）

1. 加载单独的文本文件转换成Excel和确定具有MFI-B的Cy3和Cy5通道列。
2. 计算平均值的重复功能。
3. 对于任何负面的MFI-B取代除以100原始MFI-B，然后通过计算日志基座2变换数据与10分的负数。
4. 如前面描述的⁷与分析微阵列（SAM）的意义分析日志转换后的数据。
5. 使用两个群体（ 例如 ，健康对照与患者），标记一组"1"和该组的研究"2"。使用SAM两班，不成对的分析来识别抗原的反应性是有s两组ignificantly不同（Q值<0.05）。
6. 使用聚类和热图生成软件制作图像供呈现^8。

结果

抗原是由机器人微阵列布置在384孔板和印刷到载玻片如图1， 图2示出了放置在培养室和处理后的扫描滑动一帧滑动。 图3示出了阳性和阴性对照载玻片。负滑动仅与二级抗体探测，与阳性对照载玻片从系统性红斑狼疮的患者探测血清。通过使用两个单独标记的二次抗体，IgG和IgM的反应性可以在同一滑动表面上分离。 图4示出了针对单链DNA（ssDNA）和IgG在宽针对核糖体的P（日波P）的抗体的IgM抗体的荧光强度范围血清稀释的。在从与反对瑞博P已知的反应性系统性红斑狼疮患者的这个实验阳性对照血清使用。林耳响应的IgM抗体通道在所有血清稀释观察。线性响应于IgG的信道到约30,000的MFI-B的观察到的。这点之后，反应开始饱和并增加抗体日波P不会导致在MFI-B的相应增加。 图5示出的阵列是如何可用于检测人血清中的类风湿因子。在这项研究中，使用从患者用冷球蛋白血症血管炎与记录类风湿因子的血清的167国际单位/毫升（通常&...

讨论

这里所描述的协议允许使用抗原微阵列技术的自身抗体的定量。抗原芯片提供比传统的ELISA几个优点筛选自身抗体。首先，多种抗原包括核酸，蛋白质，肽和细胞裂解物的可以排列到硝化纤维素包被的载玻片，因此允许自身抗体的多路复用筛选。另外，由于抗原的纳升被点样到每个幻灯片只有抗原的微克是必要的，以产生阵列。该阵列还需要很少的患者样本，因为只需要5微升血清在1探测阵列面:100样品稀释。最后，阵列点样到硝化纤维素已被证明是在筛选抗体⁹比常规的ELISA更敏感。

除了使用抗原微阵列来筛选抗体，该阵列可以是使用d，来检测对非自身蛋白质（ 例如病毒蛋白）的反应性，以限定的单克隆抗体的特异性，如先前^9-12描述测量移植非HLA抗体的水平。抗原微阵列也可以用于执行详细的表位作图实验，其中一个单一的蛋白的重叠肽被排列到滑动。最近的一项研究中使用这种方法来定义在系统性红斑狼疮¹³自身抗体的目标U1-70K蛋白的抗原表位。

使用此处描述的协议，IgG和IgM的反应性的检测是...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
核糖体 P0	Diarect	14100	在 PBS 人 IgG 中稀释至 0.2 mg/ml，Jackson
	Immuno	009-000-003	中稀释至 0.2 mg
			/ml，在 PBS 小鼠 IgG 中稀释至 0.2 mg/ml，Sigma-Aldrich
		I5381	中稀释至 0.2 mg/ml
			在 PBS 双链 DNA 中稀释至 0.2 mg/
		D1626	在 PBS 单链 DNA 中稀释至 0.2 mg/
		D8899	在 PBS 微阵列仪中稀释至 0.2 mg/ml，Virtek
		VersArray Chipwriter Pro	多种类型的阵列仪是合适的
固体印刷引脚	Arrayit Corporation	SSP015
机器人微阵列仪	Virtek	Chipwriter Pro 软件
FAST 载玻片（2 个垫）	GVS 北美	10485317
FAST 框架	GVS 北美	10486001
FAST 孵育室（2 个垫）	GVS 北美	10486242
384 孔板	Whatman	7701-5101
板密封剂	VWR	60941-062
铝箔板盖	VWR	60941-124
吐温-20	Fisher Scientific	BP337-500
胎牛血清	Invitrogen	12483020
Cy3 山羊抗人 IgG	Jackson Immuno	109-165-096	使用 50% glyercol
Cy5 山羊抗人 IgM	的工作原料 Jackson Immuno	109-175-129	使用 50% glyercol
Cy3 山羊的工作原料抗小鼠 IgG	Jackson Immuno	115-165-071	使用 50% glyercol
Cy5 山羊抗小鼠 IgM	Jackson Immuno	115-175-075	使用 50% glyercol
微阵列扫描仪	Molecular Devices	Axon 4200A
微阵列软件	Molecular Devices	Genepix 6.1
聚类软件	eisenlab.org	Cluster 3.0
热图软件	eisenlab.org	Treeview 1.60
微阵列统计软件	斯坦福大学	SAM 4.0（微阵列的显着性分析）