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方法文章

检查淋巴腺和血细胞的方法 果蝇 幼虫

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DOI：

10.3791/54544

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2016年11月28日

 , 
1The Graduate School of Biomedical Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Oncological Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

本文内容

摘要

Drosophila 与哺乳动物的造血系统具有许多共同特征，这使得 Drosophila 成为研究造血作用的一个理想的遗传模型。本文展示了用于免疫组织化学分析的主要幼虫造血器官的解剖与封片方法。我们还描述了检测各种幼虫造血区室的方法，包括循环血细胞和固着型晶体细胞。

摘要

许多相似之处存在于 果蝇 以及哺乳动物的造血系统，尽管 果蝇 缺乏构成哺乳动物适应性免疫特征的淋巴细胞系。 果蝇 哺乳动物的造血作用以时空上 distinct 的阶段进行，以产生多种血细胞谱系。两个系统均维持着血细胞前体细胞的储备库，用于扩增或替换成熟的谱系。造血系统能够 果蝇 以及哺乳动物应对和适应免疫挑战。重要的是，调控造血系统生成、维持和功能的转录调节因子及信号通路在果蝇到哺乳动物中具有高度保守性。这些相似性使得 果蝇 用于对造血发育和疾病进行遗传学建模。

本文详细介绍了用于研究造血系统的各项检测方法 果蝇 幼虫。特别是，我们概述了测量血细胞数量和浓度的方法，以及对特定成熟谱系进行可视化的方法 体内，并对循环中的血细胞及造血器官中的血细胞进行免疫组织化学分析。这些检测方法可用于揭示基因表达和细胞过程（包括信号转导、存活、增殖和分化）的变化，适用于研究造血过程中的多种科学问题。结合果蝇中可利用的遗传工具 果蝇这些检测可用于评估特定遗传改变对造血系统的影响。尽管此处未详细说明，这些检测也可用于研究环境因素改变（如感染或饮食）对造血系统的作用。

引言

调控造血系统发育以及在血液系统疾病中发生功能障碍的转录因子和信号通路的复杂机制仍不甚清楚。Drosophila 与哺乳动物造血过程中的这些转录因子、信号通路及其调控机制具有高度保守性1-5。因此，Drosophila 造血系统是研究控制造血过程及血液系统疾病分子机制的理想遗传模型。

与哺乳动物类似，Drosophila 在造血过程中以时空上分离的不同阶段产生称为血细胞（hemocytes）的血细胞。传统上认为，Drosophila 的造血仅限于胚胎中胚层阶段和幼虫淋巴腺阶段。近期研究表明，造血过程也发生在幼虫固着细胞簇以及成虫腹部6-8。所有造血阶段均产生两种成熟血细胞：浆细胞（plasmatocytes）和晶体细胞（crystal cells）。浆细胞是类似巨噬细胞的细胞，参与吞噬作用、先天免疫和伤口愈合。晶体细胞含有前酚氧化酶，该酶参与黑色素化反应，该反应在昆虫免疫应答和伤口愈合中发挥作用。幼虫造血可响应某些免疫挑战（例如寄生蜂感染）产生第三种成熟血细胞类型，称为成膜细胞（lamellocyte）9,10。成膜细胞是体积较大、具有黏附性的细胞，与浆细胞和晶体细胞协同作用，包裹并中和寄生蜂产在Drosophila幼虫体内的卵。在无寄生情况下，野生型幼虫体内不存在成膜细胞。黑色素团块类似于被黑色素化包裹的寄生蜂卵；许多突变型Drosophila品系在无寄生时也会形成黑色素团块。成膜细胞和/或黑色素团块的存在可能提示造血异常。事实上，黑色素团块表型已被用于鉴定参与造血的基因和信号通路11-14。

目前研究最为深入的是幼虫期造血系统。该系统由在血淋巴中循环的血细胞、位于表皮下方呈特定模式分布的固着性血细胞簇，以及驻留在淋巴腺中的血细胞组成。淋巴腺是一系列附着于背血管的成对叶状结构。淋巴腺的每个主叶可分为三个主要区域：最外层区域称为皮质区，包含正在成熟的血细胞；最内层区域称为髓质区，由处于静息状态的血细胞前体构成；第三个区域是位于淋巴腺基部的后端信号中心，是一小群具有类似干细胞微环境功能的细胞。早期研究已证实Notch15-18、Hedgehog19,20、JAK-STAT18和Wingless21信号通路在调控幼虫淋巴腺发育过程中发挥关键作用。近期的研究进一步表明，BMP22、FGF-Ras23以及Hippo24,25信号通路也在幼虫淋巴腺中发挥功能。

四种幼虫造血检测方法概述如下：1）测定循环血细胞浓度，定义为单位体积内的细胞数量；2）分离并固定循环血细胞以用于免疫组织化学分析；3）可视化晶体细胞 体内，以及4）解剖、固定和制备淋巴腺用于免疫组织化学。这些检测方法可作为造血系统的读出手段，用于评估幼虫造血系统中信号通路的功能与调控。尽管这些方法此前已在相关领域中应用，但这些检测的可视化记录直至近期才开始出现8,26-30本文引用的多篇文献均为有价值的参考资料，描述了类似方法及造血标志物26,31-33此外，Trol 和 Viking 是淋巴腺基底膜的有效标记物。

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方案

1. 循环血细胞浓度

  1. 为了在本实验中获得发育阶段大致相同的幼虫，需限制卵的收集时间，使雌虫产卵时间为固定的 2 - 6 小时。
  2. 将幼虫收集至盛有 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，表 1）的解剖培养皿孔中。
  3. 对每只幼虫，在冰上放置一支微量离心管，内含 10 µl 1× PBS，并在洁净的解剖垫上滴加 10 µl 1× PBS。将解剖垫置于透射光源的体视显微镜载物台上。
  4. 将单个幼虫先置于擦拭纸上吸干，再转移至解剖垫上的 PBS 液滴中。
  5. 使用一对镊子轻轻撕开并小心翻转表皮，以释放血淋巴。
    注意：操作时应避免刮擦或刺破表皮，以免释放固着型血细胞29。
  6. 使用移液器从解剖垫上收集血淋巴，避免吸入脂肪体等幼虫碎片。
  7. 将收集的血淋巴加入微量离心管中，并通过上下吹打混匀。
    注意：可同时收集多个样本，并在冰上保存最多一小时。
  8. 可选步骤：将台盼蓝与血淋巴样本等体积混合，用于染色并排除死细胞。加入台盼蓝后需在 3 分钟内完成细胞计数，因其对细胞具有毒性。
  9. 在将 10 µl 样本加入血细胞计数板前，需通过上下吹打充分混匀。
  10. 若使用自动细胞计数仪，应设置合适的细胞大小和圆度参数。例如，设定最小细胞直径为 2 µm，最大为 22 µm，圆度为 75 - 80%，以检测正常、圆形的血细胞34。可通过调整不同参数来检测较大或纺锤形的血细胞，如成毡细胞。或者，也可使用血细胞计数板进行人工计数。

2. 循环血细胞免疫组织化学

  1. 为了在本实验中获得发育阶段大致相同的幼虫，需限制卵的收集时间，使雌虫产卵时间为固定的 2 - 6 小时。
  2. 在 6 孔或 12 孔板的每个孔中放置一片盖玻片。
    注意：方形盖玻片（22 mm）适用于 6 孔板，圆形盖玻片（直径 18 mm）适用于 12 孔板。
  3. 将幼虫收集至盛有 1× PBS 的解剖皿孔中。
  4. 在每片盖玻片中央滴加 5 µl 1× PBS。
  5. 将培养板置于带有照明的体视显微镜载物台上。
  6. 用纸巾轻轻吸干单个幼虫表面水分，然后将其放入盖玻片上的 PBS 液滴中。
  7. 使用镊子轻轻撕开并小心翻转幼虫表皮。在移除幼虫残体前，利用其将血淋巴均匀涂布。
    注意：操作时应避免刮擦或刺破表皮，以免释放附着的血细胞29。
  8. 对所有幼虫重复上述操作，每片盖玻片上仅处理一只幼虫的血淋巴。让血细胞在室温下贴附于盖玻片 5 - 8 分钟。固定前不得超过 30 分钟。
  9. 向每片盖玻片上加入 5 µl 7.5% 甲醛（表 1），室温固定 15 分钟。
  10. 用 1× PBS 洗涤盖玻片三次，每次洗涤后倾斜培养板并吸除 PBS。为防止下一步通透化溶液流失，使用移液器吸除盖玻片边缘多余的 PBS。
  11. 向每片盖玻片加入 100 µl 通透化溶液（表 1），室温孵育 20 分钟。
  12. 倾斜并轻拍培养板，吸除通透化溶液。
  13. 根据抗体供应商的说明，用抗体稀释液（表 1）稀释一抗。对于 12 孔板中的盖玻片，每孔至少加入 500 µl 一抗溶液；对于 6 孔板，每孔至少加入 1.5 ml。4 °C 过夜孵育。
  14. 移除一抗溶液，并在旋转摇床上用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 10 分钟，共洗三次。
  15. 根据抗体供应商的说明，用抗体稀释液稀释二抗。对于 12 孔板中的盖玻片，每孔至少加入 500 µl 二抗溶液；对于 6 孔板，每孔至少加入 1.5 ml。室温孵育至少 2 小时。
  16. 移除二抗溶液，并参照步骤 2.10 的方法，在旋转摇床上用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 10 分钟，共洗三次。
  17. 在洗涤过程中，使用纸巾蘸取 70% 乙醇（表 1）清洁玻璃载玻片。对每片盖玻片，在载玻片上滴加 5 µl 封片缓冲液（表 1）。
    注意：每张载玻片可放置两片盖玻片。
  18. 吸除最后一次 PBS 洗涤液。
  19. 用镊子小心将盖玻片从培养板中取出，翻转后置于封片缓冲液上。
    注意：载玻片可在成像前于 4 °C 保存。最长保存时间取决于所用抗体的稳定性。6 孔板和 12 孔板可冲洗后重复使用。

3. 在体 内 晶体细胞黑化

  1. 为了在本实验中获得发育阶段大致相同的幼虫，需限制雌虫产卵时间，使其在2-6小时的固定时间段内产卵。
  2. 开始实验前，将加热源设定为60 °C。
    注意：使用PCR仪程序在60 °C加热10分钟（随后在25 °C保温）效果最佳，但只要能够对每只幼虫均匀且一致地传热，水浴锅或其他加热装置亦可满足要求。
  3. 将幼虫收集至盛有1x PBS（表1）的解剖皿孔中。
  4. 逐个用纸巾吸干一只幼虫，并将其置于PCR管底部。每只幼虫应分别放入独立的PCR管中。（见图3A。）
  5. 为获得一致的结果，在加热前可将装有幼虫的PCR管置于4 °C环境中冷却10-15分钟，和/或轻轻敲击管壁，以确保幼虫始终位于PCR管底部。
  6. 将PCR管放入PCR仪（或水浴锅）中，在60 °C下加热10分钟。
  7. 小心地将幼虫从PCR管中取出，转移至盛有新鲜1x PBS的解剖皿孔中。
  8. 用纸巾吸干幼虫表面液体，并将其平铺于成像面上，在体视显微镜下进行成像。
  9. 由多名观察者对幼虫图像进行盲法评分。

4. 幼虫淋巴腺免疫组织化学

注意：淋巴腺位于幼虫前端约三分之一长度处，背侧，略低于脑部。（见图3B中的箭头。）淋巴腺位于背血管两侧，最便于连同口钩或脑部一起解剖。野生型三龄幼虫的淋巴腺结构非常小，主叶长度约为100 - 200 µm。（见图4A。）

  1. 为了在本实验中获得发育阶段大致相同的幼虫，应限制卵的收集时间，让雌虫产卵固定时间为2 - 6小时。
  2. 淋巴腺解剖
    1. 对于每个实验条件，加入 1 ml 1x PBS（表124 孔板的一个孔中。
    2. 加入1滴0.1% PBST（表1使用一次性移液管向每个孔中加入）
      注意：添加去垢剂（如 Tween 20）可降低表面张力，使组织沉入孔板底部。
    3. 将培养皿平放在冰上。
    4. 在含有1x PBS的解剖培养皿孔中收集幼虫。
    5. 将一块干净的解剖垫放置在照明立体显微镜底座上。使用一次性移液管滴加少量0.01% PBST表1) 上。将一条幼虫转移至一滴 PBST 中以进行解剖。
    6. 用一对镊子夹住幼虫，位置在距后端约四分之一体长处，背面向上。
    7. 使用另一把镊子夹住紧邻夹持幼虫的镊子前方的角质层。轻轻将角质层向前端拉动，直至口钩暴露。
      注意：目的是剥离角质层，同时不破坏任何内部结构。
    8. 松解角质层，用两把镊子将幼虫剪成两段。将后段从PBST液滴中移除。
      注意：如果表皮未完全剥离至口钩处，可将幼虫切成两段，并移除后端。用一对镊子夹住表皮边缘，另一对镊子将口钩从开口处推出。这样可使表皮外翻，从而暴露口钩。此方法也可作为替代解剖法使用。
    9. 使用一对镊子固定外骨骼（腹侧外骨骼、背侧外骨骼瓣膜，或两者同时固定）以保持稳定。
    10. 使用另一把镊子夹住暴露的口钩，并轻轻将其拉出。
      注意：这将使表皮与内部结构分离。理想情况下，眼/触角成虫盘、脑、环腺以及沿背血管两侧分布的淋巴腺将仍附着在口钩上。
    11. 在仍持住口钩的同时，小心去除唾液腺、脂肪体和肠道等不需要的结构。
      注意：如果脑部与口钩分离，淋巴腺可能仍附着在脑部并随其一同被收集。此时，应握住腹神经索而非口钩。
    12. 以口钩或腹神经索作为抓手，将解剖得到的包含淋巴腺的复合体转移至冰上的孔中。 固定前不得超过30分钟。
  3. 固定与免疫组织化学
    1. 将24孔板放置在体视显微镜载物台上。
    2. 使用 p200 移液器小心地从孔中移除 PBST。
      注意：空的相邻孔可用于暂时放置废弃物。
    3. 轻轻加入 200 µl 3.7% 甲醛（表1沿孔壁加入液体，并轻轻摇晃培养板，以确保已分离的组织完全浸没。
    4. 将培养板放回冰上孵育30分钟。如果淋巴结表达荧光蛋白，需将培养板保持遮盖状态，以防止荧光淬灭。
    5. 使用 p200 移液器小心移除固定液。
    6. 加入 200 µl 1× PBS 至孔中，将板置于室温下振荡器上孵育 5 分钟进行洗涤。使用 p200 移液器小心吸除 PBS。
      注意：固定的淋巴腺可在 PBS 中置于冰上，直至所有实验条件下的淋巴腺均完成解剖和固定。
    7. 重复洗涤步骤两次。
    8. 加入200 µl透化溶液（表1将溶液加入孔板中，于室温下置于轨道摇床上孵育45分钟。
      注意：45 分钟是 "金标准" 用于淋巴腺通透化，但作者仅在20分钟后即获得成功。
    9. 用 p200 移液枪吸除溶液。
    10. 用抗体稀释液稀释一抗（表1根据供应商说明书操作。向孔中加入 300 µl 一抗溶液，确保所分离的组织完全浸没。4 °C 下孵育过夜。
    11. 使用 p200 移液器移除一抗。
    12. 加入 200 µl 1× PBS 至孔中，将板置于室温下振荡摇床孵育 10 分钟进行洗涤。使用 p200 移液器小心吸除 PBS。
    13. 重复洗涤步骤两次。
    14. 根据供应商说明书，用抗体溶液稀释二抗。向孔中加入300 µl二抗溶液，确保所分离的组织完全浸没。于室温在摇床上孵育至少2小时。
    15. 使用 p200 移液器吸除二抗，并按照步骤 4.3.12 中所述进行洗涤 & 4.3.13. 最终洗涤后不要移除PBS。
  4. 淋巴腺体封片
    1. 使用70%乙醇清洁玻璃显微镜载玻片（表1）和组织擦拭纸。
    2. 对于每个实验条件，加入一滴封片缓冲液（表1)置于载玻片上。
      注意：一张载玻片可放置两个样品。封片缓冲液体积取决于待封片淋巴腺的数量。约18–20个淋巴腺使用2 µl，10–12个使用1 µl，5个或更少使用0.5 µl。
    3. 将显微镜载玻片置于透射光体视显微镜载物台上。
    4. 每次最多针对两种条件，用镊子将所有淋巴腺从孔中转移至封片缓冲液中，操作时以口钩或腹神经索作为抓握点。
    5. 将解剖后的组织均匀地排列成圆形或矩形，在此过程中铺开封片缓冲液。
    6. 对于每一份分离的组织，用镊子的一个尖端从下方插入背血管，然后轻轻向封片缓冲液的边缘拉动。
      注意：这将使淋巴腺从其他解剖组织中分离出来，并将其在玻璃表面展平。
    7. 用镊子的一侧钳尖以锯切动作，切断淋巴腺与脑之间的背血管。
    8. 将剩余的解剖组织移至淋巴腺的对侧，置于缓冲液的最外缘。
      注意：不需要的解剖组织最终会围绕淋巴腺形成一圈边缘，可作为盖玻片的支撑。
    9. 重复上述操作，直至所有淋巴腺均从解剖组织中分离，并保留一份不需要的解剖组织置于中央。
    10. 用两根手指夹住盖玻片。检查盖玻片表面是否无灰尘和指纹。如有必要，可用擦拭纸和70%乙醇清洁盖玻片。
    11. 确保盖玻片边缘与载玻片边缘平行，小心地将盖玻片缓缓覆盖在封片缓冲液上。
      注意：显微镜载玻片可在成像前于 4 °C 保存。最长保存时间取决于所用抗体的稳定性。24 孔板可冲洗后重复使用。

5. 成像

  1. 根据制造商的操作手册，使用适当的标准荧光显微镜或共聚焦显微镜，在20倍或更高放大倍数下对固定的血细胞和安装的淋巴腺进行成像。根据制造商的操作手册，使用标准体视显微镜在2倍放大倍数下对整个幼虫进行成像。
  2. 如需进行去卷积，请遵循软件供应商的说明。
溶液成分储存评论
1× PBS200 mg/L 氯化钾室温
200 mg/L 磷酸二氢钾
8,000 mg/L 氯化钠
1,150 mg/L 磷酸氢二钠
dH2O
固定剂1× PBS 中的 3.7% 或 7.5% 甲醛避光、室温甲醛具有毒性。 
通透液/抗体稀释液0.4% Triton4 °C标准配方使用 0.4% Triton，但作者成功使用了 0.1% Tween 20。请根据供应商推荐的浓度，用该溶液稀释一抗和二抗。
5% 牛血清白蛋白、正常山羊血清或正常驴血清
1x PBS
70% 乙醇70% 200 proof 乙醇的 dH2O 溶液室温
封片缓冲液0.5% N-丙基没食子酸酯4 °C 避光没食子酸丙酯有害。DAPI 为诱变剂。
80% 甘油
可选：1 μg/ml DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）
1× PBS
0.1% PBST1× PBS 中含 0.1% Tween 20室温
0.01% PBST0.1% PBST 的 1:10 稀释液室温

表1. 本方案中使用的溶液。

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结果

循环血细胞浓度

在整个幼虫发育过程中，血细胞数量逐渐增加35。为了说明该方法能够检测出血细胞数量和浓度的差异（无论其生物学原因如何），我们测定了发育延迟与非延迟幼虫的血细胞浓度。通过遗传消融产生促前胸腺激素（ptth）的神经元（ptth>grim）导致ptth缺失，从而引起幼虫发育延迟36。对于每种基因型，均按照方案1所述方法，对至少8只在25 °C条件下培养的个体幼虫进行血细胞浓度测定。在收集卵2小时后经过120小时，发育延迟幼虫（ptth>grim）的平均血细胞浓度低于对照组幼虫（ptth）的平均浓度。直到第9天，发育延迟幼虫的平均血细胞浓度才接近对照组水平（图1B）。另一项使用该方法检测血细胞浓度差异的研究已有报道37。

...

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讨论

在发生遗传或环境改变的情况下，此处描述的四种方法可单独或联合使用，以分析造血过程中的不同事件，例如信号转导、细胞存活、增殖和分化。Drosophila 的造血是一个动态过程；每只动物体内血细胞的数量在发育过程中会增加35，淋巴腺的结构和基因表达也会发生变化32。因此，在进行这些检测之前，必须通过限制雌虫产卵时间来控制卵的收集，并确认幼虫处于所需的发育阶段。对于较短时间的卵收集（少于6小时），或当雌虫健康状况不佳或数量稀少时，可通过在培养基中制造缝隙来促进产卵。这可以通过使用经乙醇清洁的刮刀移除部分培养基来实现。如果培养基中积聚过多液体，可用纸巾吸除多余液体。（见图1A。）

单独来看，本文所述方法存在局限性。例如，测量循环血细胞浓度可反映血细胞存活或增殖的变化，但无法提供有关血细胞谱系分布的信息，也无法揭示因遗传或环境改变可能导致的谱系异常。相反，对循环血细胞进行免疫组织化学分析能够揭示血淋巴中特定血细胞谱系的变化，但仅能获得相对数量，而非绝对数值。晶体细胞黑化反应 体内...

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披露

作者声明不存在任何竞争性或经济利益冲突。

致谢

感谢 Matthew O'Connell、Maryam Jahanshahi 和 Andreas Jenny 提供的帮助。感谢 István Andó 提供浆细胞特异性抗体，Utpal Banerjee 提供 dome-meso-EBFP2 果蝇，Julian Martinez-Agosto 提供 antp>GFP 果蝇，以及 Michael O'Connor 提供 ptth 和 ptth>grim 果蝇。本研究方法得到了 Kimmel 基金会、白血病与淋巴瘤学会、NIH/NCI R01CA140451、NSF 1257939、DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 和 NIH/NCI T32CA078207 项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PBS 片剂MP Biomedicals2810305
解剖皿Corning7220-85
微量离心管DenvilleC2170
硅胶解剖垫，由 Sylgard 184 试剂盒制备Krayden（通过 Fisher 销售）NC9644388（Fisher 目录编号）在培养皿中按照制造商说明混合 Sylgard 弹性体试剂盒组分制备。
体视显微镜Morrell Instruments（Nikon 分销商）mna42000, mma36300Nikon 型号 SMZ1000 和 SMZ645
擦拭纸VWR82003-820
镊子Electron Microscopy Sciences72700-DZ
p200 移液器Eppendorf3120000054
Countess 自动细胞计数仪InvitrogenC10227
Countess 细胞计数板载玻片InvitrogenC10283
血细胞计数板Hausser Scientific3200
台盼蓝染液Life TechnologiesT10282
甲醛FisherBP531-500
TritonFisherBP151-500
Tween 20FisherBP337-500
牛血清白蛋白Rocky Mountain BiologicalsBSA-BSH-01K
正常山羊血清SigmaG9023-10ML
正常驴血清SigmaD9663-10ML
200 证明乙醇VWRV1001
没食子酸丙酯MP Biomedicals102747
甘油VWREM-4750
DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）Fisher62248
6 孔板Corning351146
12 孔板Corning351143
显微镜盖玻片，22 mm 方形Fisher12-544-10
显微镜盖玻片，18 mm 圆形Fisher12-545-100
玻璃显微镜载玻片Fisher22-034-980
PCR 仪EppendorfE950010037Mastercycler EP Gradient S
PCR 管USA Scientific1402-2700
24 孔板Corning351147
一次性移液管Fisher13-711-9AM
荧光显微镜ZeissAxio Imager.Z1

参考文献

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