检查淋巴腺和血细胞的方法 果蝇 幼虫

摘要

Drosophila 与哺乳动物的造血系统具有许多共同特征，这使得 Drosophila 成为研究造血作用的一个理想的遗传模型。本文展示了用于免疫组织化学分析的主要幼虫造血器官的解剖与封片方法。我们还描述了检测各种幼虫造血区室的方法，包括循环血细胞和固着型晶体细胞。

摘要

许多相似之处存在于 果蝇 以及哺乳动物的造血系统，尽管 果蝇 缺乏构成哺乳动物适应性免疫特征的淋巴细胞系。 果蝇 哺乳动物的造血作用以时空上 distinct 的阶段进行，以产生多种血细胞谱系。两个系统均维持着血细胞前体细胞的储备库，用于扩增或替换成熟的谱系。造血系统能够 果蝇 以及哺乳动物应对和适应免疫挑战。重要的是，调控造血系统生成、维持和功能的转录调节因子及信号通路在果蝇到哺乳动物中具有高度保守性。这些相似性使得 果蝇 用于对造血发育和疾病进行遗传学建模。

本文详细介绍了用于研究造血系统的各项检测方法 果蝇 幼虫。特别是，我们概述了测量血细胞数量和浓度的方法，以及对特定成熟谱系进行可视化的方法 体内，并对循环中的血细胞及造血器官中的血细胞进行免疫组织化学分析。这些检测方法可用于揭示基因表达和细胞过程（包括信号转导、存活、增殖和分化）的变化，适用于研究造血过程中的多种科学问题。结合果蝇中可利用的遗传工具 果蝇这些检测可用于评估特定遗传改变对造血系统的影响。尽管此处未详细说明，这些检测也可用于研究环境因素改变（如感染或饮食）对造血系统的作用。

引言

调控造血系统发育以及在血液系统疾病中发生功能障碍的转录因子和信号通路的复杂机制仍不甚清楚。Drosophila 与哺乳动物造血过程中的这些转录因子、信号通路及其调控机制具有高度保守性^1-5。因此，Drosophila 造血系统是研究控制造血过程及血液系统疾病分子机制的理想遗传模型。

与哺乳动物类似，Drosophila 在造血过程中以时空上分离的不同阶段产生称为血细胞（hemocytes）的血细胞。传统上认为，Drosophila 的造血仅限于胚胎中胚层阶段和幼虫淋巴腺阶段。近期研究表明，造血过程也发生在幼虫固着细胞簇以及成虫腹部^6-8。所有造血阶段均产生两种成熟血细胞：浆细胞（plasmatocytes）和晶体细胞（crystal cells）。浆细胞是类似巨噬细胞的细胞，参与吞噬作用、先天免疫和伤口愈合。晶体细胞含有前酚氧化酶，该酶参与黑色素化反应，该反应在昆虫免疫应答和伤口愈合中发挥作用。幼虫造血可响应某些免疫挑战（例如寄生蜂感染）产生第三种成熟血细胞类型，称为成膜细胞（lamellocyte）^9,10。成膜细胞是体积较大、具有黏附性的细胞，与浆细胞和晶体细胞协同作用，包裹并中和寄生蜂产在Drosophila幼虫体内的卵。在无寄生情况下，野生型幼虫体内不存在成膜细胞。黑色素团块类似于被黑色素化包裹的寄生蜂卵；许多突变....

方案

1. 循环血细胞浓度

1. 为了在本实验中获得发育阶段大致相同的幼虫，需限制卵的收集时间，使雌虫产卵时间为固定的 2 - 6 小时。
2. 将幼虫收集至盛有 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，表 1）的解剖培养皿孔中。
3. 对每只幼虫，在冰上放置一支微量离心管，内含 10 µl 1× PBS，并在洁净的解剖垫上滴加 10 µl 1× PBS。将解剖垫置于透射光源的体视显微镜载物台上。
4. 将单个幼虫先置于擦拭纸上吸干，再转移至解剖垫上的 PBS 液滴中。
5. 使用一对镊子轻轻撕开并小心翻转表皮，以释放血淋巴。
   注意：操作时应避免刮擦或刺破表皮，以免释放固着型血细胞²⁹。
6. 使用移液器从解剖垫上收集血淋巴，避免吸入脂肪体等幼虫碎片。
7. 将收集的血淋巴加入微量离心管中，并通过上下吹打混匀。
   注意：可同时收集多个样本，并在冰上保存最多一小时。
8. 可选步骤：将台盼蓝与血淋巴样本等体积混合，用于染色并排除死细胞。加入台盼蓝后需在 3 分钟内完成细胞计数，因其对细胞具有毒性。
9. 在将 10 µl 样本加入血细胞计数板前，需通过上下吹打充分混匀。
10. 若使用自动细胞计数仪，应设置合适的细胞大小和圆度参数。例如，设定最小细胞直径为 2 µm，最大为 22 µm，圆度为 75 - 80%，以检测正常、圆形的....

结果

循环血细胞浓度

在整个幼虫发育过程中，血细胞数量逐渐增加³⁵。为了说明该方法能够检测出血细胞数量和浓度的差异（无论其生物学原因如何），我们测定了发育延迟与非延迟幼虫的血细胞浓度。通过遗传消融产生促前胸腺激素（ptth）的神经元（ptth>grim）导致ptth缺失，从而引起幼虫发育延迟³⁶。对于每种基因型，均按照方案1所述方法，对至少8只在25 °C条件下培养的个体幼虫进行血细胞浓度测定。在收集卵2小时后经过120小时，发育延迟幼虫（ptth>grim）的平均血细胞浓度低于对照组幼虫（ptth）的平均浓度。直到第9天，发育延迟幼虫的平均血细胞浓度才接近对照组水平（图1B）。另一项使用该方法检测血细胞浓度差异的研究已有报道³⁷。

.......

讨论

在发生遗传或环境改变的情况下，此处描述的四种方法可单独或联合使用，以分析造血过程中的不同事件，例如信号转导、细胞存活、增殖和分化。Drosophila 的造血是一个动态过程；每只动物体内血细胞的数量在发育过程中会增加³⁵，淋巴腺的结构和基因表达也会发生变化³²。因此，在进行这些检测之前，必须通过限制雌虫产卵时间来控制卵的收集，并确认幼虫处于所需的发育阶段。对于较短时间的卵收集（少于6小时），或当雌虫健康状况不佳或数量稀少时，可通过在培养基中制造缝隙来促进产卵。这可以通过使用经乙醇清洁的刮刀移除部分培养基来实现。如果培养基中积聚过多液体，可用纸巾吸除多余液体。（见图1A。）

单独来看，本文所述方法存在局限性。例如，测量循环血细胞浓度可反映血细胞存活或增殖的变化，但无法提供有关血细胞谱系分布的信息，也无法揭示因遗传或环境改变可能导致的谱系异常。相反，对循环血细胞进行免疫组织化学分析能够揭示血淋巴中特定血细胞谱系的变化，但仅能获得相对数量，而非绝对数值。晶体细胞黑化反应 体内.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS 片剂	MP Biomedicals	2810305
解剖皿	Corning	7220-85
微量离心管	Denville	C2170
硅胶解剖垫，由 Sylgard 184 试剂盒制备	Krayden（通过 Fisher 销售）	NC9644388（Fisher 目录编号）	在培养皿中按照制造商说明混合 Sylgard 弹性体试剂盒组分制备。
体视显微镜	Morrell Instruments（Nikon 分销商）	mna42000, mma36300	Nikon 型号 SMZ1000 和 SMZ645
擦拭纸	VWR	82003-820
镊子	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 移液器	Eppendorf	3120000054
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen	C10227
Countess 细胞计数板载玻片	Invitrogen	C10283
血细胞计数板	Hausser Scientific	3200
台盼蓝染液	Life Technologies	T10282
甲醛	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
牛血清白蛋白	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
正常山羊血清	Sigma	G9023-10ML
正常驴血清	Sigma	D9663-10ML
200 证明乙醇	VWR	V1001
没食子酸丙酯	MP Biomedicals	102747
甘油	VWR	EM-4750
DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）	Fisher	62248
6 孔板	Corning	351146
12 孔板	Corning	351143
显微镜盖玻片，22 mm 方形	Fisher	12-544-10
显微镜盖玻片，18 mm 圆形	Fisher	12-545-100
玻璃显微镜载玻片	Fisher	22-034-980
PCR 仪	Eppendorf	E950010037	Mastercycler EP Gradient S
PCR 管	USA Scientific	1402-2700
24 孔板	Corning	351147
一次性移液管	Fisher	13-711-9AM
荧光显微镜	Zeiss		Axio Imager.Z1