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方法文章

大鼠提睾肌小动脉中无细胞层的可视化与定量分析

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DOI：

10.3791/54550

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2016年10月19日

 ,  ,  ,  , 
1NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore, 2Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

本文内容

摘要

本研究展示了大鼠提睾肌的手术制备方法，用于可视化观察 体内 无细胞层。本研究讨论了影响无细胞层宽度测量准确性的多种因素。

摘要

无细胞层定义为微血管血流中不含红细胞的壁侧血浆层。体内无细胞层宽度及其时空变化的测量可为微循环中的血流动力学提供全面的认识。在本研究中，我们采用活体显微系统结合高速摄像机，对体内微动脉中的无细胞层宽度进行定量分析。通过手术暴露Sprague-Dawley大鼠的提睾肌，以观察血流情况。同时开发了一套自定义的成像脚本，用于自动处理和分析无细胞层宽度的图像。该方法相比以往的手动测量，能够更一致地量化时空变化。然而，测量的准确性在一定程度上依赖于蓝色滤光片的使用以及阈值分割算法的选择。具体而言，我们评估了使用与不使用蓝色滤光片所获取图像的对比度和质量差异。此外，我们比较了五种基于图像直方图的阈值分割算法（Otsu法、最小值法、间模法、迭代选择法和模糊熵阈值法），并展示了它们在确定无细胞层宽度时的差异。

引言

在体 动物研究对于理解人类生理学和病理学的基础科学具有重要作用。特别是 体内 微血流动力学研究可以阐明由血液异常流变学条件引起的微循环功能潜在损伤。许多先前的微血流动力学研究1 已采用大鼠提睾肌模型来观察微血管血流。提睾肌是一层包绕睾丸的薄层横纹肌。因此，通过手术暴露后，可利用透射照明显微镜观察该肌肉内的血流情况。这使我们能够获取 体内 无需使用任何荧光或对比剂即可获得血流图像。此外，通过腹主动脉阻断减少上游血流，可控制整个肌肉网络的血液灌注。2由于这些优势，提睾肌模型已被广泛用于研究微血管中无细胞层（CFL）的形成1,3.

红细胞压积层（CFL）宽度是微循环中一个重要的血流动力学参数，因其在调节微循环功能中的关键作用而备受关注。CFL的形成是由于红细胞（RBCs）在剪切力作用下向血管中心横向迁移所致4。这种迁移导致血管壁附近红细胞减少，最终形成无细胞的血浆层。因此，靠近管壁的CFL自然成为氧气（O2）从红细胞核心向组织输送以及红细胞清除一氧化氮（NO）的扩散屏障5,6。此外，CFL宽度的动态变化还可能调节NO的生成7,8。因此，为了更深入理解微循环中的血流机制，有必要全面明确CFL在气体运输和微循环稳态调节中的作用。近期研究集中于建立微循环中CFL的血流动力学特性与其气体运输功能之间的联系9-12。此外，另一系列研究也探讨了病理状态下红细胞聚集性升高如何影响CFL的形成及其对组织中O2和NO生物利用度的影响13,14。

在微循环中，由于无细胞层（CFL）宽度相对于血管直径的比例较为显著，其作用变得更加重要。因此，有必要采用有效的方法对CFL进行量化 体内 血流。特别是，图像采集和图像分析是决定中心流层（CFL）宽度测量准确性的两个关键组成部分。要成功实现组织血流的可视化，必须首先对动物模型进行适当的手术准备。此外，还需要采用恰当的图像分析技术，以克服传统人工测量方法的局限性，这些局限性主要由人为误差引起。15,16随着光学仪器和数字图像处理计算能力的进步，现在可以更准确、一致地测量CFL宽度17-19然而，由于这些测量基于图像，其准确性最终仍取决于图像的质量。

因此，本研究探讨了影响测量结果的因素 体内 CFL 宽度。我们重点展示了大鼠提睾肌小动脉中 CFL 宽度的手术准备及用于测量的数字图像分析方法。

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方案

本研究符合新加坡国立大学实验动物管理与使用委员会的规定（批准方案编号：R15-0225）。

1. 动物模型的手术准备

  1. 血管插管
    1. 通过腹腔注射（i.p.）给予6-7周龄、体重为(203 ± 20) g的雄性Sprague-Dawley大鼠氯胺酮（37.5 mg/ml）和赛拉嗪（5 mg/ml）混合麻醉剂（2 ml/kg）进行麻醉。注射后切勿重新套上针帽或从注射器上取下针头。
    2. 待动物麻醉成功（通过脚趾夹捏无反应确认）后，将其置于加热垫上以维持体温在37 °C。轻柔剃除肩胛区、颈部前侧、下腹部、后肢内侧及阴囊部位的毛发，并使用胶带轻轻固定四肢。
    3. 在体视显微镜下，使用显微剪刀和弯头镊子进行所有外科手术操作。将所有锐利的手术器械放置在防穿刺托盘上，以防止术中意外损伤。
    4. 切口前，用碘伏和70%酒精交替对所有手术部位进行三次消毒。所有导管均需用含30 IU/ml肝素的生理盐水冲洗。
    5. 使用手术剪在右颈外静脉上方的肩胛区中线处做1 - 1.5 cm长的皮肤切口。通过钝性分离筋膜暴露颈外静脉，并使用5-0丝线将充满肝素生理盐水的聚乙烯导管（PE-50）插管固定。在整个手术和实验过程中，必要时追加补充麻醉（初始剂量的1/3至1/2，静脉注射（i.v.））。
    6. 行气管切开术以保持气道通畅。在颈部前侧区域做1 - 1.5 cm切口，使用2-0丝线将聚乙烯导管（PE-205）插入气管并固定。
    7. 通过股动脉插管监测血压。在左侧后肢内侧表面做1 - 1.5 cm切口，通过钝性分离暴露股动脉，使用5-0丝线将充满肝素生理盐水的聚乙烯导管（PE-10）插入股动脉并固定。
  2. 提睾肌制备与血流可视化
    1. 将一根5-0丝线穿过阴囊顶端以拉伸阴囊组织。沿阴囊腹侧表面做切口。定期向暴露的肌肉滴加温热等渗溶液（37 °C；pH 7.4）。
    2. 使用棉签仔细且彻底地去除周围结缔组织。
    3. 将一根5-0丝线穿过提睾肌顶端，剪成两段等长线段，并在两端各打一个结。在两个结之间剪断肌肉，通过轻柔牵拉丝线将肌肉展平于定制的透明聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）平台上，并用蓝丁胶固定丝线末端。
      注：彻底清除周围结缔组织对于获得最佳成像对比度至关重要。
    4. 重复步骤1.2.3，直至完成5至6个固定点。使用高温电灼法小心将提睾肌从附睾上分离。持续灌注温热等渗溶液以防止暴露的组织脱水。
      1. 用折叠的纱布围绕提睾肌，再用聚乙烯薄膜覆盖暴露的肌肉。纱布与薄膜共同形成一个浅盆，用于容纳温热等渗溶液，以适配浸水物镜显微镜的使用（图1A）。
    5. 将动物转移至活体显微镜的载物台上（图1C）。将动脉插管连接至生理数据采集系统，以持续监测血压（图1E）。
    6. 通过动物平台下方安装的加热元件维持肌肉温度在35 °C（图1B）。将温度探针置于肌肉旁，向加热元件的电源控制器提供负反馈信号以精确控温（图1D）。
    7. 让动物在载物台上静置15分钟，使其与环境达到平衡。
    8. 使用40倍水浸物镜和长工作距离聚光镜，在活体显微镜下观察血流情况。
    9. 选择一段无分支的小动脉（< 60 µm），要求红细胞核心、血浆层（CFL）与血管壁之间具有清晰的成像焦点和对比度，以便将显微镜聚焦于血管的直径平面。旋转显微镜上的相机，使血管壁呈垂直方向排列。
    10. 使用高速摄像机以每秒3,000帧的速度记录1秒的血流视频。将录制的视频保存为未压缩的8位灰度AVI格式，以保留图像质量。
      注：建议最低录制帧率为3,000帧/秒，以确保在生理条件下小动脉血流中每个红细胞至少可被测量一次CFL值。
    11. 使用峰值透射波长为394 nm、光谱通带为310 - 510 nm的蓝色滤光片，增强红细胞与血浆之间的对比度。
      注：应确保来自显微镜光源（100 W卤素灯）并通过蓝色滤光片的光谱强度较低，以避免对组织造成潜在损伤。
    12. 实验结束后，通过过量戊巴比妥钠处死动物。

2. 图像分析

  1. 用于CFL宽度测量的预处理
    1. 打开MATLAB并运行“CFL_pre.m”文件。（此文件及其他MATLAB文件可在补充MATLAB存档中找到。）
    2. 点击“打开文件”以选择要分析的视频文件。
    3. 调整“旋转”滑块，使血管壁垂直对齐。
      注：用户可通过选择“网格开启”单选按钮显示辅助网格线以帮助对齐血管，并通过滑动“缩放”滑块调整图像的缩放级别。
    4. 点击“确认编辑”按钮以确认血管对齐。
    5. 点击“设置ROI以裁剪”按钮以定义感兴趣区域（ROI）。对齐后的图像将在弹出窗口中显示。在图像上调整矩形区域，双击以确认ROI。如果无需裁剪图像，可跳过此步骤。
      注：ROI中仅应包含单个血管，以便从该血管分析CFL宽度。如有需要，可点击“重置图像”按钮将图像恢复至原始状态。
    6. 点击“提取图像”按钮，将所有编辑后的视频帧提取为连续的位图图像（8位灰度“bmp”格式）。提取的图像可在与所选视频文件同名的文件夹中找到。
  2. CFL宽度的测量
    1. 打开MATLAB并运行“CFL_measure.m”文件。
    2. 点击“选择文件夹”以选择包含提取图像的文件夹。
    3. 点击包含图像的文件夹，然后点击“选择文件夹”。文件夹中的第一帧图像将被加载并显示在“灰度图像”面板中，其灰度强度直方图同时显示在“图像直方图”面板中。
    4. 从列表框中选择要分析的图像帧，否则将默认选择第一帧图像。
    5. 点击“查找血管壁”以识别图像中的血管内壁，该位置由光强度剖面在两个像素范围内从暗到亮的峰值过渡点确定。
    6. 勾选“中值滤波”以对图像应用中值滤波，减少“椒盐噪声”。
    7. 勾选“自动对比度”以数字方式调整图像强度，增强图像对比度。
    8. 在列表框中选择一种阈值算法，该算法将自动确定一个阈值（τ），将灰度级分为两类——灰度级高于τ的白色像素（CFL），以及灰度级低于τ的黑色像素（RBC核心）。
      注：作为替代方法，若自动阈值算法均无法提供合适的图像阈值，可使用手动阈值。点击“手动”单选按钮，并滑动滑块以定义手动阈值。
    9. 为测量CFL宽度的空间变化，在“像素分辨率”框中输入像素分辨率（本实验设置的分辨率为0.42 µm/像素）。
    10. 点击“计算”按钮以获得CFL宽度的空间变化。点击“导出.csv”以表格格式导出CFL宽度数据。
    11. 为测量沿血管特定分析线处CFL宽度的时间变化，点击“时间变化”单选按钮，并输入帧率信息（本实验设置使用的帧率为3,000帧/秒）。
    12. 分别在“起始帧”和“末帧”框中输入用于分析的图像的第一帧和最后一帧编号。
    13. 通过滑动“分析线”滑块选择沿血管的分析线位置。确认分析线位置，其将在“灰度图像”和“二值图像”中同时显示。
    14. 点击“计算”以获得CFL宽度的时间变化。点击“导出.csv”以表格格式导出CFL宽度数据。

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结果

CFL 的可视化 体内 在很大程度上取决于动物的手术准备。过度失血或手术时间过长可能导致动物发生休克和血流异常。在手术及实验过程中，使用加热垫和定制平台维持组织温度，对于保持大鼠的生理状态也至关重要。在显微镜系统中使用100 W卤素灯时，即使在实验结束时也未观察到明显的组织损伤。

图2A 显示了大鼠提睾肌中一条无分支小动脉内典型的红细胞流动情况，其中可在红细胞核心与血管内壁之间观察到细胞脱流层（CFL）（图2C）。实验过程中，这些结构之间具备良好对比度，对于确保CFL宽度测量的准确性至关重要。图像分析的初始阶段包括识别血管内壁。通过获取垂直于血管方向的分析线上光强度分布，可将血管内壁位置近似确定为在两个像素范围内由暗变亮的峰值处（图2B）。

由于红细胞（RBCs）和细胞周液层（CFL）具有不同的透光率，灰度水平的差异可被划分为两类（二值图像）。然而，图像直方图中两个峰之间准确阈值的确定可能受到图像质量差和对比...

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讨论

测量红细胞边缘层（CFL）宽度对于深入理解微循环中的血流动力学至关重要。特别是，已有研究在肠系膜中进行了CFL宽度的测量。6脊部斜方肌24 和大脑的25 微循环。传统测量方法 体内 CFL 宽度仅通过手动检查录制的视频帧进行估算。手动测量需要对连续的多个视频帧取平均值，然后目视确定红细胞核心和血管壁的边界。15,16在另一项研究中，使用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的红细胞和罗丹明-B异硫氰酸酯（RITC）标记的血浆来测定猫脑微血管的平均中心流层宽度25这些先前的测量方法耗时较长，且需要额外的荧光标记步骤，从而限制了CFL宽度测量的空间和时间分辨率。相比之下，本研究所展示的技术通过将高速摄像记录与高效图像分割和分析相结合，能够以0.42 µm的空间分辨率（小于一个红细胞的尺寸量级）和1/3,000秒的时间分辨率，对CFL的时空变化进行量化。

提睾肌的适当外科制备对于确定CFL宽度测量的准确性至关重要。特别是，彻底清除邻近的结缔组织是确保提睾肌内小动脉获得...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由新加坡国家医学研究委员会（NMRC）/合作基础研究资助（CBRG）/0078/2014 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
活体显微镜奥林巴斯BX51WI仪器设备
高速相机Photron1024PCI仪器设备
蓝色滤光片HOYAB390仪器设备
压力传感器 &和 Biopac 系统Biopac 系统TSD104A，MP100仪器设备
温度控制器ShimadenSR 1仪器设备
Plasma Lyte ABaxterNDC：0338-022137℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
0.9% 生理盐水Braun
肝素（5,000 IU/ml）LEO
PE-10 聚乙烯管Becton Dickinson427400.024" OD × 0.011" ID 
PE-50 聚乙烯管Becton Dickinson427411.038" OD × 0.023" ID
PE-205 聚乙烯管Becton Dickinson427446.082" OD × 0.062" ID
2-0不可吸收丝线缝合线Deknatel113-S
5-0不可吸收丝线缝合线Deknatel106-S
水循环加热垫Gaymar
水浴锅Fisher ScientificIsotemp 205仪器设备
无菌棉纱布 Fisher Scientific22-415-468
棉签Fisher Scientific23-400-124
杜蒙镊Kent ScientificINS14188手术器械
显微解剖镊Kent ScientificINS15915手术器械
虹膜镊，1×2齿Kent ScientificINS15917手术器械
血管插管镊Kent ScientificINS500377外科手术器械
显微剪刀Kent ScientificINS14177手术器械
虹膜剪Kent ScientificINS14225外科手术器械
血管夹Kent ScientificINS14120外科手术器械
Gemini电凝系统布雷因特里科学公司GEM 5917外科手术器械

参考文献

  1. Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
  2. Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).
  3. Namgung, B., Kim, S. Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules. Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).
  4. Goldsmith, H. L. The Microcirculatory Society. Eugene M. Landis Award Lecture. The Microrheology of Human-Blood. Microvasc Res. 31 (2), 121-142 (1986).
  5. Buerk, D. G. Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).
  6. Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance. J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).
  7. Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles. Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).
  8. Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles. Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).
  9. Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability. Front Comput Neurosci. 9, 131(2015).
  10. Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width. Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).
  11. Sriram, K., et al. The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles. Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).
  12. Hightower, C. M., et al. Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).
  13. Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations. J Biomech. , (2015).
  14. Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation. Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).
  15. Maeda, N. Erythrocyte rheology in microcirculation. Jpn J Physiol. 46 (1), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8743714 1-14 (1996).
  16. Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from: http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959 H1959-H1965 (1995).
  17. Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation. Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).
  18. Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels. Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).
  19. Namgung, B., et al. A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels. Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).
  20. Ong, P. K., et al. An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles. Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).
  21. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
  22. Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L. The analysis of cell images. Ann N Y Acad Sci. 128 (3), 1035-1053 (1966).
  23. Ridler, T. W., Calvard, S. Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).
  24. Shanbhag, A. G. Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding. Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).
  25. Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).
  26. Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. Cell-free plasma layer in cerebral microvessels. Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).

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