本研究展示了大鼠提睾肌的手术制备方法，用于可视化观察 体内 无细胞层。本研究讨论了影响无细胞层宽度测量准确性的多种因素。
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本文内容
摘要
摘要
无细胞层定义为微血管血流中不含红细胞的壁侧血浆层。体内无细胞层宽度及其时空变化的测量可为微循环中的血流动力学提供全面的认识。在本研究中，我们采用活体显微系统结合高速摄像机，对体内微动脉中的无细胞层宽度进行定量分析。通过手术暴露Sprague-Dawley大鼠的提睾肌，以观察血流情况。同时开发了一套自定义的成像脚本，用于自动处理和分析无细胞层宽度的图像。该方法相比以往的手动测量，能够更一致地量化时空变化。然而，测量的准确性在一定程度上依赖于蓝色滤光片的使用以及阈值分割算法的选择。具体而言，我们评估了使用与不使用蓝色滤光片所获取图像的对比度和质量差异。此外，我们比较了五种基于图像直方图的阈值分割算法（Otsu法、最小值法、间模法、迭代选择法和模糊熵阈值法），并展示了它们在确定无细胞层宽度时的差异。
引言
在体 动物研究对于理解人类生理学和病理学的基础科学具有重要作用。特别是 体内 微血流动力学研究可以阐明由血液异常流变学条件引起的微循环功能潜在损伤。许多先前的微血流动力学研究1 已采用大鼠提睾肌模型来观察微血管血流。提睾肌是一层包绕睾丸的薄层横纹肌。因此，通过手术暴露后，可利用透射照明显微镜观察该肌肉内的血流情况。这使我们能够获取 体内 无需使用任何荧光或对比剂即可获得血流图像。此外，通过腹主动脉阻断减少上游血流，可控制整个肌肉网络的血液灌注。2由于这些优势，提睾肌模型已被广泛用于研究微血管中无细胞层（CFL）的形成1,3.
红细胞压积层（CFL）宽度是微循环中一个重要的血流动力学参数，因其在调节微循环功能中的关键作用而备受关注。CFL的形成是由于红细胞（RBCs）在剪切力作用下向血管中心横向迁移所致4。这种迁移导致血管壁附近红细胞减少，最终形成无细胞的血浆层。因此，靠近管壁的CFL自然成为氧气（O2）从红细胞核心向组织输送以及红细胞清除一氧化氮（NO）的扩散屏障5,6。此外，CFL宽度的动态变化还可能调节NO的生成7,8。因此，为了更深入理解微循环中的血流机制，有必要全面明确CFL在气体运输和微循环稳态调节中的作用。近期研究集中于建立微循环中CFL的血流动力学特性与其....
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方案
本研究符合新加坡国立大学实验动物管理与使用委员会的规定（批准方案编号：R15-0225）。
1. 动物模型的手术准备
- 血管插管
- 通过腹腔注射（i.p.）给予6-7周龄、体重为(203 ± 20) g的雄性Sprague-Dawley大鼠氯胺酮（37.5 mg/ml）和赛拉嗪（5 mg/ml）混合麻醉剂（2 ml/kg）进行麻醉。注射后切勿重新套上针帽或从注射器上取下针头。
- 待动物麻醉成功（通过脚趾夹捏无反应确认）后，将其置于加热垫上以维持体温在37 °C。轻柔剃除肩胛区、颈部前侧、下腹部、后肢内侧及阴囊部位的毛发，并使用胶带轻轻固定四肢。
- 在体视显微镜下，使用显微剪刀和弯头镊子进行所有外科手术操作。将所有锐利的手术器械放置在防穿刺托盘上，以防止术中意外损伤。
- 切口前，用碘伏和70%酒精交替对所有手术部位进行三次消毒。所有导管均需用含30 IU/ml肝素的生理盐水冲洗。
- 使用手术剪在右颈外静脉上方的肩胛区中线处做1 - 1.5 cm长的皮肤切口。通过钝性分离筋膜暴露颈外静脉，并使用5-0丝线将充满肝素生理盐水的聚乙烯导管（PE-50）插管固定。在整个手术和实验过程中，必要时追加补充麻醉（初始剂量的1/3至1/2，静脉注射（i.v.））。
- 行气管切开术以保持气道通畅。在颈部前侧区域做1 - ....
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结果
CFL 的可视化 体内 在很大程度上取决于动物的手术准备。过量失血或手术时间过长可能导致动物发生休克和血流异常。在手术及实验过程中，使用加热垫和定制平台维持组织温度，对于保持大鼠的生理状态也至关重要。在显微镜系统中使用100 W卤素灯时，即使在实验结束时也未观察到明显的组织损伤。
图2A 显示了大鼠提睾肌中一条无分支小动脉内典型的红细胞流动情况，其中可在红细胞核心与血管内壁之间观察到细胞脱层层（CFL）（图2C）。实验过程中，这些结构成分之间具备良好对比度，对于确保CFL宽度测量的准确性至关重要。图像分析的初始阶段包括识别血管内壁的位置。通过获取垂直于血管方向的分析线上光强分布，可将血管内壁位置近似确定为在两个像素范围内由暗变亮的峰值处（图2B）。
由于红细胞（RBCs）和细胞周液层（CFL）具有不同的透光率，灰度水平的差异可被划分为两类（二值图像）。然而，图像直方图中两个峰之间的准确阈值确定可能受到图像质量.......
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讨论
测量红细胞边缘层（CFL）宽度对于深入理解微循环中的血流动力学至关重要。特别是，已有研究在肠系膜中进行了CFL宽度的测量。6脊部斜方肌24 和大脑的25 微循环。传统测量方法 体内 CFL 宽度仅通过手动检查录制的视频帧进行估算。手动测量需要对连续的多个视频帧取平均值，然后目视确定红细胞核心和血管壁的边界。15,16在另一项研究中，使用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的红细胞和罗丹明-B异硫氰酸酯（RITC）标记的血浆来测定猫脑微血管的平均中心流层宽度25这些先前的测量方法耗时较长，且需要额外的荧光标记步骤，从而限制了CFL宽度测量的空间和时间分辨率。相比之下，本研究所展示的技术通过将高速摄像记录与高效图像分割和分析相结合，能够以0.42 µm的空间分辨率（小于一个红细胞的尺寸量级）和1/3,000秒的时间分辨率，对CFL的时空变化进行量化。
提睾肌的适当外科制备对于确定CFL宽度测量的准确性至关重要。特别是，彻底清除邻近的结缔组织是确保提睾肌内小动脉获得.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由新加坡国家医学研究委员会（NMRC）/合作基础研究资助（CBRG）/0078/2014 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 活体显微镜 | 奥林巴斯 | BX51WI | 仪器设备 |
| 高速相机 | Photron | 1024PCI | 仪器设备 |
| 蓝色滤光片 | HOYA | B390 | 仪器设备 |
| 压力传感器 &和 Biopac 系统 | Biopac 系统 | TSD104A，MP100 | 仪器设备 |
| 温度控制器 | Shimaden | SR 1 | 仪器设备 |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC：0338-0221 | 37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C |
| 0.9% 生理盐水 | Braun | ||
| 肝素（5,000 IU/ml） | LEO | ||
| PE-10 聚乙烯管 | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD × 0.011" ID |
| PE-50 聚乙烯管 | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD × 0.023" ID |
| PE-205 聚乙烯管 | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD × 0.062" ID |
| 2-0不可吸收丝线缝合线 | Deknatel | 113-S | |
| 5-0不可吸收丝线缝合线 | Deknatel | 106-S | |
| 水循环加热垫 | Gaymar | ||
| 水浴锅 | Fisher Scientific | Isotemp 205 | 仪器设备 |
| 无菌棉纱布 | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| 棉签 | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| 杜蒙镊 | Kent Scientific | INS14188 | 手术器械 |
| 显微解剖镊 | Kent Scientific | INS15915 | 手术器械 |
| 虹膜镊，1×2齿 | Kent Scientific | INS15917 | 手术器械 |
| 血管插管镊 | Kent Scientific | INS500377 | 外科手术器械 |
| 显微剪刀 | Kent Scientific | INS14177 | 手术器械 |
| 虹膜剪 | Kent Scientific | INS14225 | 外科手术器械 |
| 血管夹 | Kent Scientific | INS14120 | 外科手术器械 |
| Gemini电凝系统 | 布雷因特里科学公司 | GEM 5917 | 外科手术器械 |
参考文献
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
- Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S.
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重印与许可
