Method Article

在大鼠提睾肌的小动脉的可视化和量化的无细胞层

DOI:

10.3791/54550

⸱

October 19th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore, 2Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究展示了大鼠提睾肌的手术准备，用于体内无细胞层的可视化。本研究讨论了影响无单元层宽测量精度的相当大的因素。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

无细胞层定义为微血管流中的壁状血浆层，不含红细胞。体内无细胞层宽度及其时空变化的测量可以全面了解微循环中的血流动力学。在这项研究中，我们使用活体显微镜系统结合高速摄像机来量化体内小动脉中的无细胞层宽度。Sprague-Dawley 大鼠的提睾肌通过手术外展以可视化血流。还开发了一种定制的成像脚本，用于自动化图像处理和无单元层宽度的分析。与以前的手动测量相比，这种方法能够更一致地量化时空变化。然而，测量的准确性部分取决于蓝色滤光片的使用和选择合适的阈值算法。具体来说，我们评估了使用和不使用蓝色滤镜获取的图像的对比度和质量。此外，我们比较了五种不同的基于图像直方图的阈值算法（Otsu、最小值、模态、迭代选择和模糊熵阈值），并说明了它们在确定无单元层宽度方面的差异。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

体内动物研究有助于了解人类生理学和病理学的基础科学。特别是，体内微血流动力学研究可以阐明血液异常流变条件改变的微循环功能的潜在损害。许多先前的微血流动力学研究1 都使用大鼠 Cremaster 肌肉模型来可视化微血管血流。提睾肌是围绕睾丸的一层薄薄的横纹肌。因此，可以通过手术暴露用透射显微镜观察肌肉中的血流。这使我们能够在不使用任何荧光或造影剂的情况下获取体内血流图像。此外，可以通过减少腹主动脉闭塞的上游血流来控制肌肉网络的整个血液灌注2。由于这些优点，Cremaster 肌肉模型已被广泛用于研究微血管中无细胞层 （CFL） 的形成1,3。

CFL 宽度是微循环中一个突出的血流动力学参数，因其在调节微循环功能中的重要作用而受到极大的关注。CFL 是由剪切诱导的红细胞 （RBC） 向血流中心 4 横向向内迁移形成的。因此，这种迁移导致血管壁附近的红细胞耗竭，最终导致无细胞血浆层。因此，壁层 CFL 自然成为氧 （O2） 从红细胞核心输送到组织的扩散屏障，并阻止红细胞清除一氧化氮 （NO）5,6。此外，NO 的产生也可以由 CFL 宽度的动态变化7,8 调制。因此，需要充分确定 CFL 在气体运输和微循环中稳态调节中的作用，以更好地了解微循环中的血流。最近的研究集中在弥合 CFL 在微循环中的血流动力学和气体运输功能9-12。此外，另一组研究还调查了 RBC 聚集的病理升高如何调节 CFL 的形成及其对组织中 O2 和 NO 生物利用度的影响13,14。

CFL 的作用在 CFL 宽度与血管直径的相对大小突出的微循环中变得更加重要。这需要一种有效的方法来量化体内血流中的 CFL。特别是，图像采集和图像分析是决定 CFL 宽度测量精度的两个关键组成部分。在成功观察组织血流之前，应先对动物模型进行适当的手术准备。此外，需要一种适当的图像分析技术来克服传统手动测量的局限性，这些测量主要是由人为错误引起的15,16。随着光学仪器和数字图像处理计算能力的进步，现在可以实现更准确和一致的 CFL 宽度测量17-19。尽管如此，这些基于图像的测量的准确性最终仍然取决于图像质量。

因此，本研究探讨了影响体内 CFL 宽度测量的因素。我们特别注重展示手术准备和数字图像分析，用于测量大鼠提睾肌小动脉中的 CFL 宽度。

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Protocol

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这项研究是按照新加坡的机构动物护理和使用委员会（批准的协议没有。R15-0225）的国立大学。

1.手术动物模型的制备

  1. 血管插管
    1. 麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠（6 - 7周龄）称重（203±20）G用氯胺酮（37.5毫克/毫升）和甲苯噻嗪（5毫克/毫升）的鸡尾酒通过腹膜内（IP）注射（2毫升/千克） 。不要回顾一下针头或注射后注射器将其删除。
    2. 一旦动物被麻醉（趾捏证实），把它放在一个加热垫，以保持其体温在37℃。轻轻地刮在肩胛骨，前宫颈，小腹，内侧后腿和阴囊的头发。轻轻地克制使用胶粘纸带的腿。
    3. 采用显微剪刀，一边欣赏角度的，通过执行镊子所有外科手术立体显微镜。放置在一个抗穿刺托盘中的所有锋利的外科手术工具，以防止手术过程中受伤。
    4. 在进行切开前擦洗手术部位交替碘和70％乙醇3次。同花顺30 IU / ml肝素盐水解决方案的所有导管。
    5. 做一个1 - 使用一双手术剪过右颈静脉肩胛骨1.5厘米中线皮肤切口。钝性分离分离筋膜，露出颈静脉，用聚乙烯管（PE-50）充满利用5-0丝线缝合肝素盐水导管插入它。注入补充麻醉必要时（1/3到初始剂量的1/2，静脉内（IV））在整个手术和实验过程。
    6. 执行气管切开，以保持呼吸道通畅。做一个1 - 在颈前区有1.5厘米的切口。使用的聚乙烯管（PE-205）用2-0丝线缝合以固定导管代替导管插入气管。
    7. 监测血压通过在股动脉插管。使1 - 在后腿的左内侧表面1.5厘米切口。分离钝性分离股动脉。导管插入填充用5-0丝线缝合肝素盐水的聚乙烯管（PE-10）的股动脉。
  2. 提睾肌准备和流量可视化
    1. 将5-0丝线穿过阴囊的顶点来扩展它。使沿阴囊腹面切口。定期应用暖等渗溶液（37℃; pH 7.4）中到暴露的肌肉。
    2. 删除认真彻底周围结缔组织使用棉签。
    3. 通过提睾肌的顶点将5-0丝线缝合。切缝合线成相等长度的两件，并在每一侧打结。切两个节点之间的肌肉，并轻轻拉动缝线拉伸它到一个定制的透明有机玻璃平台。固定缝合年底到具有粘性的蓝色平台。
      注:彻底清除周围结缔组织的是获得最佳图像对比度的关键。
    4. 重复步骤1.2.3至5〜6注视制成。小心取出使用高温烧灼附睾提睾肌。 Superfuse温暖等渗溶液到暴露肌肉，以防止组织的脱水。
      1. 围绕提睾肌，用纱布折叠块。盖上聚乙烯薄膜的露出肌肉。纱布片与薄膜形成浅盆保持为浸水显微镜物镜（ 图1A）温暖等渗溶液。
    5. 转移动物到一个活体显微镜（ 图1C）的动物阶段。动脉插管连接至连续压力监测（ 图1E）的一种生理数据采集系统。
    6. 保持肌肉TEMPERATURE在35℃下与附着在动物的平台（ 图1B）下方的加热元件。放置一个温度探头肌肉旁，以提供给加热元件（ 图1D）的功率控制器负反馈。
    7. 离开舞台上的动物15分钟以与环境平衡。
    8. 可视化的活体显微镜下血流40倍水浸泡的目的和长时间工作冷凝器。
    9. 选择无支链的小动脉（<60微米）的基础上的RBC芯之间的清晰图像的焦点和对比度，CFL和血管壁，以便聚焦显微镜上的血管的直径平面。旋转安装到显微镜垂直对齐血管壁的相机。
    10. 用的高速视频摄像机以3000 /秒的帧速率1秒记录血流量。保存所记录的视频作为未压缩的8位灰度AVI格式保存的图像质量。
      注意:推荐3000帧/秒的最小记录帧速率，以确保所述CFL测量可生理动脉流动条件下每红细胞至少执行一次。
    11. 使用具有峰值发送一个蓝色滤色器在310 394纳米和光谱带通波长 - 510毫微米，以提高红细胞和血浆之间的对比度。
      注:确保光谱通过从微观光源（100瓦卤素灯）蓝色的过滤器是低光照强度，以防止任何潜在的组织损伤。
    12. 在实验结束时，安乐死动物用戊巴比妥钠的过量。

2.图像分析

  1. 预处理的CFL宽度测量
    1. 打开MATLAB并运行"CFL_pre.m'文件。 （这和其他MATLAB文件可以在找到IP">补充MATLAB归档）。
    2. 点击"打开文件"，选择视频文件进行分析。
    3. 调整"旋转"滑块垂直对齐血管壁。
      注:用户可以通过选择"网格"单选按钮，显示该容器对准辅助网格线，并通过滑动"缩放"滑块来调整图像的缩放级别。
    4. 点击"确认编辑"按钮，确认船舶对齐。
    5. 点击"设置ROI作物"按钮来定义感兴趣区域（ROI）的区域。对准的图像将显示在一个弹出窗口。调整图像上的矩形目标，并双击以确认投资回报率。跳过此步骤如果不需要图像的裁切。
      注意:仅包括在以分析从容器中的CFL宽度将ROI的单一容器中。点击"重置图片"按钮将图像恢复到其原来的形式，如果有必要。
    6. 点击9，提取图像"按钮，提取所有编辑的视频帧到连续的位图图像（8位灰度"BMP"格式）。所提取的图像可以具有相同的名称作为所选择的视频文件的文件夹中找到。
  2. CFL宽度的测量
    1. 打开MATLAB并运行"CFL_measure.m'文件。
    2. 点击"选择文件夹"，选择包含提取图像的文件夹。
    3. 单击包含图片的文件夹，然后单击"选择文件夹"。该文件夹中的第一个图像帧将会被加载，并在"灰度图像"面板中显示，随着"图像直方图"面板的灰色强度直方图一起。
    4. 从列表框中选择所需的图像帧进行分析，否则第一图像帧将被选中。
    5. 点击"查找容器壁"，以识别图像，其在该位置确定在内部容器壁，其中从暗光强度分布的峰过渡到点亮了两个像素。
    6. 检查'中值滤波器"以中值滤波应用到图像，以减少"椒盐"噪音。
    7. 检查'自动对比度'以数字方式调整图像强度，以提高图像对比度。
    8. 选择在列表框中自动确定阈值（τ）一个阈值化的算法，将所述灰度级分为两类 - 白像素与上述τ灰度级（CFL），并用下面τ灰度级（RBC芯）黑色像素。
      注:另一种方法是，使用手动阈值，如果没有自动阈值处理算法提供了一个合适的图像阈值。点击"手动"单选按钮，调节滑块定义手动阈值。
    9. 为了测量宽度CFL的空间变化，在"像素分辨率"框中输入像素分辨率（分辨率这个实验装置为0.42微米/像素）。
    10. 点击"计算"按钮来获得CFL宽度的空间变化。点击"导出的.csv'的CFL宽度导出数据以表格的格式。
    11. 为了测量宽度CFL在沿着容器具体分析线的时空变化，点击"时空变化"单选按钮，然后输入帧速率信息（在本实验装置使用的帧速率为3000帧/秒）。
    12. 在'开始帧'和'末帧'盒，输入分别在第一帧和用于分析图像的最后一帧。
    13. 选择沿滑动"分析线"滑杆容器内的分析线的位置。确认分析线，这是双方"灰度图像"和"二值图像"上所示的位置。
    14. 点击"计算"，以获得CFL宽度的时间变化。 CLICK"导出的.csv'的CFL宽度导出数据以表格的格式。

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Results

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所述CFL 在体内的可视化很大程度上取决于动物的手术准备。因失血过多或延长手术时间可能使动物震惊和血流像差。使用加热垫以及手术和实验期间定制平台组织温度的维护也用于保持大鼠的生理条件的关键。通过在显微镜系统中使用一个100瓦的卤素灯，即使在实验结束时没有观察到明显的组织损伤。

图2A示出了通过在大鼠提睾肌无支链动脉，在那里可以红细胞芯和内部容器壁（ 图2C）之间可以观察到所述CFL一个典型的RBC流。在实验过程中这些部件之间的良好的对比度为确保CFL宽度测量的精度是至关重要的。图像分析的初始阶段涉及检测的内血管壁。通过获取在垂直于容器沿着分析线的光强度分布，该位置是在高峰，从暗过渡到超过两个像素（ 图2B）点亮近似。

作为RBC和紧凑型荧光灯具有不同的光透射率，在灰度级的差异可被细分为两类（二值图像）。然而，在图像的直方图的两个峰之间的精确阈值的识别可以通过图像质量差和对比度（ 图3A）

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CFL宽度的测量是为了更好地理解微循环血流动力学是必不可少的。特别是，CFL宽度的测量已经在肠系膜6进行spinotrapezius 24和脑25微循环。 体内 CFL宽度的常规测量通过所记录的视频帧的人工检查仅限于估计。手动测量所需几个连续视频帧的平均肉眼识别红细胞核心和血管壁15,16的边界之前。在另一项研究中，异硫氰酸荧光素（FITC） -标记的RBC和罗丹明-B异硫氰酸（RITC）标记的血浆被用来确定在猫脑微血管25的平均CFL宽度。这些以前的测量方法是非常耗时的，需要为荧光标记，这限制了紧凑型荧光灯的Wi的空间和时间分辨率的附加步骤嗞嗞的测量。与此相反，由高速摄像机的记录耦合到有效图像分割和分析，这里展示的技术中允许与一个命令的空间分辨率（0.42微米）的紧凑型荧光灯的时空变化的定量小于一个红细胞的大小1/3000秒的时间分辨率。

提睾肌的正确的手术的准备是在确定的CFL宽度测量的精度是至关重要的。特别是，彻底去除相邻结缔组织是必不可少的，以确...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人声明没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了美国国家医学研究委员会 （NMRC）/合作基础研究资助 （CBRG）/0078/2014 的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
奥林巴斯BX51WI设备
高速摄像机Photron1024PCI设备
蓝色滤光片HOYAB390设备
压力传感器和生物保护系统Biopac 系统TSD104A、MP100设备
温度控制器ShimadenSR 1设备
等离子体 Lyte ABaxterNDC：0338-022137 &°C 温C 水浴 使用前
水 0.9%Braun
肝素 （5,000 IU/ml）LEO
PE-10 聚乙烯管Becton Dickinson427400.024" OD x .011" ID 
PE-50 聚乙烯管Becton Dickinson427411.038" OD x .023" ID
PE-205 聚乙烯管Becton Dickinson427446.082" OD x .062" ID
2-0 不可吸收丝缝合线Deknatel113-S
5-0 不可吸收丝缝合线Deknatel106-S
水循环加热垫Gaymar
水浴Fisher ScientificIsotemp 205设备
无菌棉纱布 Fisher Scientific22-415-468
棉签涂抹器Fisher Scientific23-400-124
Dumont 镊子Kent ScientificINS14188手术器械
显微解剖镊Kent ScientificINS15915手术器械
鸢尾鸢尾镊 1 x 2 齿Kent ScientificINS15917外科器械
血管插管钳Kent ScientificINS500377手术器械
微型剪刀Kent ScientificINS14177手术器械
鸢尾剪刀Kent ScientificINS14225手术器械
血管夹Kent ScientificINS14120手术器械
Gemini 烧灼系统Braintree ScientificGEM 5917手术器械
盐子

References

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