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方法文章

利用诱导体细胞扇形分析（ISSA）研究木材形成及茎次生发育相关基因与启动子

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DOI：

10.3791/54553

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2016年10月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Ecosystem and Forest Sciences, Faculty of Science, The University of Melbourne, 2Victorian AgriBiosciences Centre, La Trobe University R&D Park, 3College of Biological Sciences, Department of Plant Biology, University of California, Davis, 4Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

本文内容

摘要

本文介绍了一种可在相对较短的时间内，对树木次生茎组织中的基因和启动子结构进行中高通量功能表征的实验方案。该方法高效、操作简便，且可广泛适用于多种树木物种。

摘要

树木的次生茎生长及相关木材形成在生物学和商业上均具有重要意义。然而，关于调控其发育过程的分子机制，目前所知仍相对有限。部分原因在于研究次生生长过程常受到物理条件、资源和时间的限制。已有多种体外（in vitro）技术被应用于木本和非木本植物，涉及植物器官或完整植株系统。然而，这些方法在研究次生茎生长过程中的适用性、某些物种的难转化性以及较高的劳动强度，常常限制了其在中高通量应用中的使用。此外，在研究次生茎发育和木材形成时，所关注的特定性状往往需要经过数年的生长后才能在树木生命周期的后期进行测量。为应对这些挑战，已开发出一种名为诱导体细胞区段分析（Induced Somatic Sector Analysis）的替代体内（in vivo）实验方案，该方法通过在植物次生茎内直接产生转基因体细胞区段来实现研究目的。本实验方案旨在提供一种高效、简便且相对快速的方法，用于在多种树种中创制转基因次生植物组织，以实现基因和启动子功能的表征。本文展示的结果表明，可在多种树种次生茎的所有活体组织和细胞类型中成功产生转基因次生茎区段，并可便捷地评估次生茎中的木材形态性状以及启动子表达模式，从而促进中高通量的功能特性分析。

引言

树木茎干占据了地球生物量的很大一部分，在生物学、文化和商业方面均具有极其重要的意义。次生茎通过为许多其他生命形式提供资源和庇护所而创造了栖息环境。它们还为其所处的生态系统提供多种其他服务，并作为可再生资源用于木材、纸浆、纸张以及其他木质和非木质产品的生产。次生茎的发育，特别是木材形成过程，受到复杂分子系统的调控，这些系统控制着特定细胞类型的发育、细胞壁的生化组成，以及细胞如何排列形成组织和器官。由于多种因素的存在，解析次生茎发育和木材形成的分子基础十分困难，这些因素包括茎内及茎间木材和茎干性状的变异性、较长的世代周期、异花授粉的繁殖系统、高度杂合性、较高的遗传负荷、季节性休眠、成熟性状建立周期长，以及成年树木巨大的物理尺寸。因此，与植物发育其他方面的分子调控机制所具有的详尽知识相比，目前对次生茎发育的理解仍处于初级阶段。

已采用多种体外技术来研究和理解次生维管形成层发育，特别是木材及次生细胞壁的形成过程。这些实验方案涉及使用完整植株或植物部分系统，通过创建转基因植株或转化特定的次生细胞或组织，以研究木材和/或次生茎发育的特定方面1。转基因植株可在遗传转化后从多种植物组织和细胞类型中再生获得，然而进展较为缓慢，尤其是在分析木材纤维性状时，由于再生和茎秆成熟所需时间较长（以年计）、技术与人力投入高、候选基因通量低，以及某些木本植物物种繁殖困难等因素限制了研究效率。在非木本模式系统（如拟南芥）中也已开发出类似技术，成功克服了其中部分限制，但这些植物茎中并不具备所有类型的次生茎细胞，且无法用于研究与季节性或寿命相关的性状2。另一种方法是使用植物部分系统，例如辐射松（Pinus radiata）愈伤组织培养3，可显著缩短相关研究周期。然而，这些方法仅限于单一细胞类型的研究，且仍面临与体外实验类似的局限性。类似地，包含完整茎段外植体的顶端茎段培养技术4已显示出一定前景，但迄今尚未被应用于特定基因或启动子的功能研究。最近，一种基于毛状根培养的替代方案已在桉树中建立并成功应用5，但该方法仍需依赖体外培养，研究对象为次生根而非茎组织，且目前仅限于单一树种。

体细胞诱导区分析（ISSA）是一种中高通量的功能筛选工具，旨在解决上述部分问题，用于研究疑似参与木材形成及茎次生组织发育的基因与启动子。ISSA是一种 体内 转化与筛选系统，该系统旨在缩短在完整的次生茎中产生转基因细胞和组织所需的时间，同时克服常规方法在操作劳动强度、技术难度和通量方面存在的局限性 体外 方法。本文所述的实验方案能够在短时间内、以较低的劳动成本，在目标树种和组织的次生茎中同时生成数百个独立转化的组织区域和细胞，且不引入遗传和/或环境变异。ISSA 体内 次生茎的技术最初被描述6 和芽7 组织，并通过有关形成层分化相关基因和/或启动子的研究在次生维管组织中得到进一步优化，包括： 微管蛋白 (TUB)8, 类束蛋白样阿拉伯半乳聚糖 (FLA)9, 纤维素合酶 (CESA)10, 次生细胞壁相关NAC结构域 (SND2)11, ARABIDOPSIS KNOTTED-LIKE HOMEOBOX (ARK1)12 和 非常有趣的新基因 (RINGH2 蛋白13这些研究在杨树和桉树的次生茎中进行，揭示了细胞形态、细胞壁化学成分及基因表达的相关信息。

本文所述方案旨在汇总过去十年间在多个已发表和未发表研究中开发和应用ISSA所积累的经验与知识。方案重点介绍体内次生茎组织的转化过程6，并集中于对银白杨‘金字塔形’克隆（Populus alba 'pyramidalis'）、蓝桉（Eucalyptus globulus）以及11个蓝桉 × 柠檬桉杂交克隆（Eucalyptus globulus x camaldulensis）的研究。本文将引导研究人员完成从植物与细菌培养、茎组织转化、组织生长与收获、转基因细胞与组织鉴定、表型评估前准备，到数据采集与分析方法的完整流程。尽管已有技术成功用于测定细胞壁单糖组成9,11，但受限于篇幅，本文仅聚焦于用于测定次生茎细胞与组织形态以及解析基因表达模式的技术。因此，本方案适用于希望以低成本、技术简便且中高通量的方法，进一步探究与次生茎相关基因功能和/或表达特征的研究人员。

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方案

1. 植物材料的准备

  1. 实验前，通过种子或插条培育所选树种的幼苗，并将树木培育至拟进行实验的茎部区域直径约为1 cm。
    注意：所需时间因植物生长速度而异，因此建议为本步骤预留三到九个月。

2. 双元载体构建

  1. 在可操作根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的实验室或温室中进行本节至第7节的实验操作，并使用实验室规定的适当个人防护装备。
  2. 制备一个双元载体，其中包含目的基因的敲低或过表达表达盒，以及一个β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因表达盒；或根据研究类型，将目的启动子与GUS基因融合。
    注意：目前有多种双元载体骨架可通过商业渠道或科研网络获得，同时也有多种技术可用于将目的基因或启动子插入双元载体。本实验方案中，如何构建双元载体由实验人员自行决定。
  3. 通过电穿孔或热激法14将双元载体转化至根癌农杆菌（A. tumefaciens）的无毒菌株中，并妥善保存，待实验时使用。
  4. 对任何阳性或/和阴性对照重复步骤2.2。
    注意：阴性对照应包括在目的基因研究中使用不含目的基因的双元载体，以及在启动子研究中使用无启动子的GUS载体。启动子研究的阳性对照应包含花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35s）与GUS报告基因的融合。

3. 准备 A. tumefaciens 用于接种

  1. 实验前至少一周，取步骤 2.2 和 2.3 中制备的少量（约 1 µl）A. tumefaciens，分别均匀涂布于含适当抗生素用于细菌筛选的 LB 琼脂培养基14平板上。在 28 °C 培养箱中培养至形成小菌落，随后于 4 °C 保存备用。
  2. 实验前 48 小时，从每个平板上挑取单个 A. tumefaciens 菌落，分别接种至含有 5 ml 预热（28 °C）并添加适当抗生素用于细菌筛选的 LB 培养基14 的 50 ml 螺口管中，在摇床培养箱中以 200 rpm 振荡培养约 48 小时（28 °C），直至菌液明显浑浊。
  3. 在接种植物茎段（第 4 节）前 4–6 小时，将 1 ml LB/A. tumefaciens 菌液转移至新的 50 ml 螺口管中，加入 19 ml 新鲜温热（28 °C）并含适当抗生素用于细菌筛选的 LB 培养基（1:20 稀释）。若在 600 nm 处测得的光密度（OD，通过分光光度法测定）高于 0.1，则需用温热 LB 培养基进一步稀释，直至 OD600 达到该值。
  4. 将稀释后的 LB/A. tumefaciens 菌液重新放回摇床培养箱，在相同条件下（200 rpm，28 °C）振荡培养，直至 OD600 达到 0.4–0.6 后取出。
  5. 将 LB/A. tumefaciens 菌液在 1,000 × g 条件下于 4 °C 离心 15 分钟。
  6. 弃去上清液，立即将 A. tumefaciens 沉淀重悬于 1 ml 冷却的 MS 培养基15 中，转移至 2 ml 微量离心管，冰上保存备用（用于接种，第 4 节）。该溶液称为接种培养基。

4. 植物茎秆接种 A. tumefaciens​

  1. 在晚春或初夏开始实验，使用第1节中培育的植物，其形成层应处于活跃且快速生长的状态。判断形成层活跃且生长迅速的一个有效指标是韧皮部可轻易从木质部剥离。
  2. 在植株基部附近选择一段清晰、笔直的茎段，并去除所有叶片和侧枝。
  3. 使用锋利的解剖刀（建议使用11号刀片）或剃须刀片，在茎段的清晰区域制作一个1 cm2大小的“形成层窗口”：先在韧皮部上做两条平行的纵向切口，长度为20 mm，间距为5 mm，再在两条切口的底端之间做一条横向切口，将二者连接。
  4. 将切口产生的韧皮部条片向上剥离，暴露正在发育的木质部组织，然后用移液器加入适量第3.6步配制的接种培养基（通常为5–10 µl），润湿暴露的发育中木质部表面。随后立即重新插入韧皮部条片。
  5. 用Parafilm将韧皮部条片紧密包裹固定在茎上。
  6. 对目标基因或启动子的其他形成层窗口重复步骤4.2至4.5，每个新形成的窗口应位于其他窗口上下至少1 cm处，并呈90°角错开。
  7. 对阳性与阴性对照载体（步骤2.4）执行步骤4.2至4.5，确保每种载体均添加至实验所用每株植物的同一茎段上。
  8. 定期监测茎直径的生长情况，当观察到茎的径向生长至少达到5 mm时，进行采样并开展GUS检测（第5节）。
    注意：所需径向生长量取决于下游分析所需的组织量。

5. GUS 组织化学检测的样品采集

  1. 从茎部切除“形成层窗口”，去除形成层窗口内不属于新生组织的所有部分。
    1. 对于与成熟木质部和韧皮部细胞/组织形态相关研究，将韧皮部从木质部分离剥离。
    2. 对于需要保持形成层区域完整或需评估启动子表达模式的研究，使用剃刀刀片或其他锋利刀片将形成层窗口横向切成厚度为0.5至1 mm的薄片。
  2. 将处理后的形成层窗口组织置于14 ml圆底试管中，用pH 7的0.1 M磷酸缓冲液冲洗两次14。确保组织完全浸没，每次在溶液中至少保留5分钟，并在第二次冲洗结束后彻底去除多余液体。
  3. 向每支试管中加入5 ml GUS试剂（含0.5 mM X-葡萄糖苷酸（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸）、10 mM EDTA、0.5% Triton X-100 v/v、0.5 mM铁氰化钾(III)、0.05 mM亚铁氰化钾(II)，用0.1 mM磷酸缓冲液（pH 7）定容至最终体积；参见Hawkins et al.16）。若组织未完全浸没，需补充适量GUS试剂。
  4. 将试管在黑暗条件下于55 °C孵育10分钟。
  5. 随后将试管在黑暗条件下于37 °C摇床孵育12–16小时，以轻柔振荡（30–60 rpm）促进混合。
  6. 从摇床孵育器取出后，使用pH范围为0–7的石蕊试纸随机检测少量试管中GUS试剂的pH值。
    1. 若任一试管pH值低于6，则进行标记。继续检测其余试管以确认pH值，并对pH值为6或更低的试管进行标记。
      注意：pH值低于6的样品可能不适合用于分析，应排除在后续分析之外。
  7. 倒出GUS试剂，加入足量70%乙醇以完全覆盖组织。
  8. 于4 °C保存，待后续使用。

6. 转基因组织的鉴定

  1. 用镊子将试管中的所有形成层窗组织取出，置于小托盘或培养皿中，以便进行显微观察。
  2. 使用解剖显微镜在1X至4X放大倍数下，识别并计数呈现亮蓝色染色的细胞或组织数量。此后，将染成蓝色的细胞或组织统称为“扇区”。按以下方式对其进行计数。
    1. 对于已去除韧皮部的样品（步骤 5.1.1），统计发育中木质部表面形成层组织中的扇区数量（形成层扇区， 图1a).
    2. 对于已切割成圆片的样品（步骤 5.1.2），统计不同细胞或组织类型中所含的扇形区域数量图1b, 1c, 1d）。可在以下组织类型中观察到扇区：表皮（表皮扇区， 图1e），韧皮部（韧皮部区域， 图1f），形成层组织（形成层区域， 图1g, 1小时, 1I），创伤薄壁组织（创伤薄壁组织区段， 图1j）以及在侵填体中（侵填体区域， 图1k).
      1. 在显微镜评估过程中，应确保观察到每个培养皿的两侧，并将跨越两个培养皿的菌落扇区进行匹配，以避免菌落数量被高估。
  3. 将仅含区段的组织放回含有70%乙醇的离心管中，保存至需要时使用。
  4. 对其他任何形成层窗口（包括阳性对照和/或阴性对照）重复步骤6.1至6.3。
  5. 分别计算每个目标基因或启动子以及对照组的每种扇区类型的平均转化效率，方法是将扇区总数除以1 cm的总数2 形成层窗口以获得每厘米平均转化事件数2 接种于坎比琼脂（ATScm-2).
  6. 进入步骤7.2和8，用于分析启动子表达模式；进入步骤7.1、7.2或7.3，用于分析形成层组织中细胞和组织形态的技术。

7. 形成层组织中细胞和组织形态的分析

注意：以下是已成功用于分析ISSA来源样本的一系列技术。

  1. 使用扫描电子显微镜（SEM）分析木质部细胞面积、管腔面积、细胞壁厚度和细胞壁面积
    注意：本方案所需的样品制备步骤极少，可实现与所列形态特征相关的扇区分析的相对高通量。
    1. 从这一步开始，每次处理木质组织时，均须穿戴实验服、护目镜和手套。
    2. 确定一个形成层区域用于分析，使用单刃剃须刀片在该区域两侧各约0.5 mm处进行切口，以制备一个圆盘状样本图 2a).
    3. 切除多余的木质部组织，保留约 1 mm 的木质部组织位于该区域的切向一侧图2b).
    4. 使用新的双刃剃须刀片，从扇形区域的中心小心地横向切割图2c).
    5. 在横切面上，于该扇形区域两侧再制作两个浅层放射状切口，以标记转基因组织图2d）。由于GUS染色无法深入组织，应沿形成层表面染色组织两侧的径向细胞列进行观察。
    6. 将制备好的形成层扇形面朝上，用扫描电镜导电胶带固定在扫描电镜针式样品台的载物台上图 2e）并置于干燥器中保存，直至进行扫描电镜观察时使用。
    7. 对阴性对照及其他任何附加区域重复执行步骤 7.1.2 至 7.1.6。
    8. 使用扫描电子显微镜（SEM）在低真空模式下（电压5 kV，束斑3.0 nm），观察并拍摄扇区内部以及紧邻扇区的细胞/组织的图像图 2f）。放大倍数取决于所关注的特征。对于木质部纤维，2,000X 的放大倍数较为合适（图2g).
    9. 在适当放大倍数下观察并拍摄形成层区段图像后，使用图像测量软件测量目标木质部细胞/组织的形态特征。
    10. 对于统计分析，对每个转基因扇区及其相邻的非转基因对照细胞/组织（在扇区边缘0.5 mm范围内测量）的形态学测量值之间的差异，采用配对t检验进行多次两两分析，以确定p值。
    11. 对阴性对照重复步骤 7.1.10。
      1. 当阳性对照显示较低的 p 值（α <0.05），计算转基因细胞/组织与相邻非转基因细胞/组织在某一形态学性状上的差异，将该“差异值”用于非配对t检验，以比较目的基因与阴性对照的效应，从而确定p值。
  2. 利用光学显微镜对形成层细胞/组织形态或干细胞/组织中启动子表达模式进行组织化学分析。
    注意：尽管该方法耗时较长，但它允许进行更多分析，包括形成层动态方面的研究 例如， 形成层宽度以及启动子表达模式。此外，若无法使用扫描电子显微镜（SEM），本方案可作为第7.1步的替代方法。
    1. 使用剃刀刀片切取目标区域及部分周围组织，切成不超过1 mm的小块3) 立即放入带有螺旋盖的样品管中，加入1-3 ml 100%乙醇，在4 °C摇床上固定至少2天。将小组织块修整成便于切片时暴露目标表面的形状，以便使用切片机进行切片。
    2. 对阴性对照及其他任何附加区域重复上述步骤。
    3. 去除液体，更换为25%乙醇：75% LR White混合液，在相同条件下维持2天。
    4. 用50%乙醇：50% LR white、25%乙醇：75% LR white处理，最后再用100% LR white处理两次，重复步骤7.2.3。
    5. 将小组织块放入包埋模具中，使待研究的表面与模具短端对齐，小心覆盖新鲜的LR White树脂，按制造商说明进行聚合。
    6. 在旋转式切片机上从目标表面切取5 µm切片，并置于载玻片上。使用0.01%沙黄O染色以观察细胞壁和/或其他结构特征。
    7. 加入封片剂，盖上盖玻片，室温静置过夜。
    8. 在100倍至600倍放大倍数下使用光学显微镜观察并采集图像。
    9. 使用图像测量软件从图像中获取形态学特征。
      1. 定量形态性状的统计分析，请接续步骤 7.1.10。
      2. 对于形态学性状的定性分析，应比较并描述目标基因或启动子与阴性对照和/或阳性对照所观察到的模式。
  3. 利用光学显微镜分析离析纤维中的微纤丝角（MFA）
    1. 从某一区域直接切除转基因木质部组织，以及紧邻的非转基因组织（距离在0.5 mm以内） 图 2h）并分别放入不同的1.5 ml离心管中。对其他所有区域（包括阴性对照）重复此步骤。
    2. 在通风橱中完成步骤 7.3.3 至 7.3.5。
    3. 向每根试管中加入250 µl过氧化氢和250 µl冰醋酸。
    4. 将试管置于90 °C的加热块中，在通风橱内孵育2小时。
    5. 从管中取出组织，用蒸馏水仔细冲洗至少两次。
    6. 使用水溶性封片剂将组织置于载玻片上，并用尖头镊子轻轻分离组织，然后加盖盖玻片。
    7. 在光学显微镜下观察，并以400倍以上的放大倍数拍摄单根纤维的图像。
    8. 为测定纤维的微纤丝角，需测量纤维壁凹口开口和/或细胞壁条纹与纤维长轴之间的角度。图 2i使用图像测量软件。
    9. 统计分析请接续步骤 7.1.10 进行。

8. 启动子表达模式的分析

  1. 次生茎组织中启动子表达模式的分析。
    1. 统计目标启动子以及步骤6.2.2中所述的阳性对照和阴性对照中各类扇区类型的出现频率。
    2. 利用卡方检验将目标启动子不同扇区类型的频率与阳性对照进行比较，以确定p值。根据需要，可进一步采用步骤7.2进行细胞/组织特异性的分析。
      1. 若同时研究多个目标启动子，则需重复此分析，将所有目标启动子与阳性对照进行比较。
      2. 若在阴性对照中观察到扇区或蓝色染色，则应根据染色程度或是否怀疑存在内源性染色（见讨论部分）决定将其纳入分析或放弃实验结果。
  2. 维管形成层衍生物发育与分化过程中启动子表达模式的分析。
    1. 使用解剖显微镜观察步骤6.2中鉴定出的所有维管形成层扇区（图1g、1h、1i），并判断来源于形成层的三种组织类型——韧皮部（P）、发育中的木质部（X1）和已发育的木质部组织（X2）中是否存在蓝色染色（见图3a）。
    2. 参照步骤8.1.2，利用卡方检验将目标启动子在P、X1和X2区域中GUS染色有无的频率与阳性对照进行比较，以确定p值。根据需要，可进一步采用步骤7.2进行细胞/组织特异性的分析。
      1. 有关其他注意事项，请参见步骤8.1.2.1和8.1.2.2。

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结果

利用本方案，所有存活的次生分生组织及组织类型均已被证实可被根癌农杆菌（A. tumefaciens）转化，并可根据最初被转化的细胞类型及其后续的发育生长模式划分为不同的扇区类型。扇区类型包括周皮、韧皮部、形成层、创伤薄壁组织和侵填体（图1b、1c、1d），其位置在本段后续内容中有详细描述。周皮扇区由一组仅存在于周皮中且从不延伸至韧皮部的转化细胞组成（图1e）。韧皮部扇区可出现在起始层与周皮之间的不同位置，但从不延伸至这些周围组织中（图1f）。形成层扇区由起始于形成层原始细胞转化而来的木质部/形成层/韧皮部组织构成，可呈现三种不同的模式：i）“完整”形成层扇区，转化的木质部/形成层/韧皮部细胞从创伤薄壁组织边界延伸，穿过木质部和形成层区域，直至包含射线细胞和纺锤状细胞或仅含射线结构的韧皮部组织（图1g）；ii）“原始细胞丢失”形成层扇区，为完整形成层扇区的...

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讨论

ISSA 方法是一种相对简单且高效的手段，可在数月内创制转基因茎组织，用于分析参与木材和茎形成的基因与启动子。与体外（in vitro）方法相比，该方法在接种后仅需基本的植株存活维护即可生长出转基因茎组织，而体外方法则需要长期培养以维持组织或植株，且木材生成可能需要数年时间才能启动，或无法形成真正的次生茎1。ISSA 方法还已被证明适用于多种树木物种，包括杨属（Populus）、桉属（Eucalyptus）和松属（Pinus）6，以及相思属（Acacia）和伞房属（Corymbia）（数据未显示），在这些物种中几乎无需或仅需极少优化即可获得转基因组织。因此，利用该方法可在大多数目标物种中研究多个感兴趣的基因或启动子。此外，该方案既可单独使用，也可与更常用的体外（in vitro）技术结合使用：可首先通过 ISSA 方法对多个基因进行初步筛选，以鉴定出有潜力的候选基因，再进一步应用于更复杂的体外（in vitro）方法中进行深入研究。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢澳大利亚研究理事会通过链接资助项目 LP0776563（GB、AS）和 LP0211919（GB）以及行业合作伙伴 Sappi 和 Mondi 为本研究的部分工作提供的资金支持，同时感谢澳大利亚研究生奖（EM）以及澳大利亚农业部颁发的青年创新者与科学家奖（LT）。我们还要感谢 Zander Myburg、Qing Wang、Colleen MacMillan 和 Simon Southerton 在本实验方案开发过程中提出的诸多讨论与建议，并感谢 Martin Ranik、Minique De Castro、Julio Najera、Valerie Frassiant、Angelique Manuel 和 Noemie Defaix 在实验室相关工作中提供的协助。

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材料

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参考文献

  1. Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
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利用诱导体细胞扇形分析（ISSA）研究木材形成及茎次生发育相关基因与启动子
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