从小鼠成年心脏窦房结分离、培养及功能表征心肌细胞的方法

摘要

本文演示了从小鼠成年个体中分离窦房结心肌细胞（SAMs）的方法，可用于膜片钳电生理学或成像研究。分离的细胞可直接使用，也可在培养中维持，以实现目的蛋白（如基因编码报告蛋白）的表达。

摘要

窦房结心肌细胞（SAMs）作为心脏的天然起搏细胞，通过产生自发性动作电位（APs）启动每一次心跳。这些起搏动作电位反映了多种膜电流与细胞内钙循环的协调活动。然而，驱动SAMs自发起搏活动的确切机制仍不明确。急性分离的SAMs是解析心脏起搏分子基础实验中的关键样本。然而，由于解剖结构不清晰、显微解剖复杂以及酶消化条件难以控制，急性分离SAMs尚未被广泛应用。此外，直到最近，尚无可行方法能够长期培养成年小鼠SAMs以用于蛋白质表达研究。本文提供了一种从成年小鼠分离SAMs的分步操作方案及视频演示，同时展示了一种维持成年小鼠SAMs长期培养的方法。 体外 以及通过腺病毒感染表达外源蛋白。采用这些方法制备的急性分离和培养的SAMs适用于多种电生理和成像研究。

引言

心脏窦房结中的起搏心肌细胞（窦房结心肌细胞，"SAMs"）可产生自发的节律性动作电位（AP），并由此在心肌中传播，启动每一次心跳。利用多种物种急性分离的SAMs进行的实验，对于阐明起搏活动产生机制至关重要。SAMs是一类高度特化的心肌细胞，在形态、功能和蛋白质表达方面均显著区别于心房和心室心肌细胞。SAMs中自发动作电位的典型特征是在舒张期出现自发性去极化，使膜电位达到阈值，从而触发下一次动作电位^1,2。这种"起搏电位"依赖于多种膜电流的协同作用，包括"起搏电流"（I_f）、T型和L型钙电流，以及由肌浆网释放Ca²⁺驱动的钠钙交换电流（I_NCX）^3,4。

尽管急性分离的小鼠窦房结（SAM）是研究起搏功能必不可少的实验材料，但从小鼠分离SAM的方法较难掌握，因为小鼠窦房结（SAN）解剖结构不明显且体积微小，需要精细的显微解剖操作，同时细胞的分离需结合酶消化与机械解离，并进行 careful optimization。

我们在此提供一个详细的视频演示，展示了一种已成功用于从成年小鼠分离SAMs以进行膜片钳记录的实验方案。^5-8据我们所知，目前尚无其他来源提供此类可视化演示。此外，本文还展示了一种新方法，可将成年小鼠分离的SAMs进行体外维持 体外 数天，从而可通过腺病毒感染引入蛋白质、基因编码的报告分子或RNA干扰分子⁹.

方案

所有动物实验均按照科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。以下标准方案已使用2-3月龄的雄性C57BL/6J小鼠进行优化。

1. 实验前预先准备溶液储备液和耗材

注意：所需设备和材料请参见材料表。

1. 按 表1 所示，分别配制 1 L 的以下溶液：完全 Tyrode's 溶液、低 Ca²⁺/Mg²⁺ Tyrode's 溶液、改良 Kraft-Brühe (KB) 溶液和牛血清白蛋白 (BSA) 溶液。所有溶液均使用超纯过滤的去离子水配制。将每种溶液分装为 50 ml 等份，于 20 °C 保存，最长可保存六个月。实验前立即取出单份等份溶液解冻，并于 4 °C 保存，最长可保存一周。
2. 通过将 NaCl 和 CaCl₂ 溶解于超纯过滤的去离子水中，配制 50 ml 的 10 mM NaCl 和 1.8 mM CaCl₂ 适应溶液（表1）。室温保存，最长可保存六个月。
3. 用移液器将弹性蛋白酶分装为每管 4.75 酶活性单位 (U) 的等份，置于微量离心管中。4 °C 保存，最长可保存三个月。
4. 用移液器将胶原酶-蛋白酶混合酶以 375 μg/管的量分装至微量离心管中（溶剂为超纯 H₂O）。-20 °C 保存，最长可保存三个月。
5. 制备两根火焰抛光的巴斯德移液管，一根用于组织转移（最终开口直径约 1.5 mm；图1Aiv 和 图1C），另一根用于组织解离（直径约 2 mm；图1Aiii 和 图1C）。
   1. 使用玻璃切割器在巴斯德移液管上划痕，并沿划痕折断，使开口略大于所需尺寸。将每根移液管的切割端置于本生灯的低温火焰上灼烧约 30–60 秒进行火焰抛光，形成厚实光滑的管壁和所需直径的开口。确保火焰抛光后的开口无裂纹或毛刺。
6. 通过向每个 100 mm 培养皿中加入约 25 ml 按制造商说明配制的硅胶弹性体，制备两个解剖皿（图1Ai 和 图1B）。室温下固化 48 小时。
7. 仅用于培养时：按 表2 配制 25–50 ml 的铺板培养基和维持培养基。4 °C 保存，最长可保存两周。

2. 准备细胞分离当天使用的溶液

注意：以下用量适用于从小鼠中分离窦房结心肌细胞。

1. 向三个小型圆底培养管中各加入 2.5 ml 低 Ca²⁺/Mg²⁺ Tyrode 液（pH 6.9）。将培养管置于 35 ± 1 °C 水浴中。
2. 向一个大型圆底培养管中加入 2.5 ml 低 Ca²⁺/Mg²⁺ Tyrode 液。向该管中加入一份数量（4.75 U）弹性蛋白酶和一份数量（375 μg）胶原酶-蛋白酶混合酶。轻轻旋转混匀。将培养管置于 35 ± 1 °C 水浴中。
3. 向另外三个小型圆底培养管和一个大型圆底培养管中各加入 2.5 ml KB 培养基。将培养管置于 35 ± 1 °C 水浴中。
4. 向一个大型圆底培养管中加入约 7 ml BSA 溶液。将该管置于室温下。
5. 在 50 ml 烧杯中加入 20–40 ml 完全 Tyrode 溶液（图 1Aii）。加入 10 USP/ml 肝素，轻轻旋转混匀，并将烧杯置于 35 ± 1 °C 水浴中。

3. 准备培养细胞所需的其他溶液和材料（急性分离细胞可跳过这些步骤）

1. 在无菌细胞培养操作台中，将每只小鼠的两片12 mm圆形玻璃盖玻片分别放入24孔板的各个孔中。
   注意：使用24孔板是因为其孔径大小合适，有助于限制后续病毒感染所需的液体体积。
2. 用移液器将约200 µl以无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释成100 ng/ml的小鼠层粘连蛋白（laminin）溶液滴加到每片盖玻片上。
3. 将盖玻片置于37 °C培养箱中，与层粘连蛋白共同孵育整个分离过程时间（至少1小时）。
4. 将接种培养基和维持培养基（见步骤1.7和表3）预热至37 °C。

4. 窦房结隔离

1. 在化学通风橱中，将一只小鼠放入双室盒的一个隔间内，通过棉签向另一隔间引入约200 μl液态异氟烷进行麻醉。通过脚趾夹捏法确认麻醉效果（通常在约30–60秒内）。采用颈椎脱臼法处死小鼠。
   注意：可使用一个空的1 ml移液器吸头盒制作双室盒；将盒内的支架倒置，以形成独立的隔间来放置异氟烷，防止小鼠直接接触。
2. 用剪刀去除胸部的毛发，并使用外部组织镊子剪开肋骨 cage 以暴露胸腔图1Aviii）和解剖剪（图1Avix用移液管将约 2 ml 加热的含肝素完全台氏液冲洗胸腔。
   注意：必要时继续灌注胸腔，切勿使标本干燥。
3. 在解剖显微镜下，使用内用剪刀小心地剥离肺和胸腺（图1Avi）和解剖镊（图1Avii).
4. 用内用解剖镊轻轻夹住心脏心尖，用内用剪刀小心剪断下腔静脉和主动脉，将心脏从胸腔中取出。将心脏转移至一个硅胶解剖皿中，并用移液管加入约4 ml温热的含肝素完全台氏液浸泡。
5. 将心脏调整至后部血管朝上且可见的位置，使动物的右心房位于实验者右侧，左心房位于实验者左侧。调整方向后，用大头针穿过心尖固定于硅胶解剖皿中，以固定心脏。
6. 定位心室与心房之间的沟槽（心室上方的透明环状结构）).
7. 使用解剖剪在沟槽处进行切口，切口位置应靠近心室而非心房。根据需要，用额外加温的含肝素完全台氏液冲洗沟槽及切口，以清晰暴露心房和瓣膜。沿沟槽继续剪切，将心房与心室完全分离。
8. 将心房组织转移至第二个硅胶解剖皿中，并用约3 ml温热的含肝素完全台氏液浸泡。
9. 将组织摆放至动物的右心房位于实验者左侧，左心房位于右侧的位置。
   注意：右心房较为透明，而左心房则呈较深的暗红色。
10. 通过下腔静脉和上腔静脉以及左右心耳固定组织，轻轻拉伸标本。清除残留的脂肪或其他组织，以获得清晰的视野（注意不要切到心房壁，因为窦房结非常脆弱，容易受损）。
11. 剪开腔静脉处的心房前壁。根据需要调整大头针位置，以充分暴露房间隔。
12. 沿房间隔剪开以去除左心房。重新固定标本，轻轻拉伸。
13. 切除右心耳，并沿界嵴切开以游离窦房结，界嵴呈一条深橙色条带，位于心耳边缘。
14. 重新固定结节组织，并沿横向（垂直于终嵴）切割，制成三条大小相等的条状组织。

5. 窦房结消化

1. 使用窄口火焰抛光移液管（图1Aiv），将三段窦房结组织转移至第一个盛有2.5 ml低Ca²⁺/Mg²⁺ Tyrode's溶液的小型圆底管中，该管置于35 ± 1 °C水浴中。孵育5分钟。
2. 用同一支窄口移液管将组织条转移至第二个盛有2.5 ml低Ca²⁺/Mg²⁺ Tyrode's溶液的小型圆底管中，该管同样置于35 ± 1 °C水浴中。通过轻轻旋转管子或用窄口移液管轻柔吹打，洗涤组织条。切勿倒置管子。
3. 将组织条转移至第三个盛有2.5 ml低Ca²⁺/Mg²⁺ Tyrode's溶液的小型圆底管中，并重复步骤5.2中所述的洗涤操作。
4. 将组织条转移至盛有2.5 ml含酶（弹性蛋白酶加胶原酶-蛋白酶混合物）的低Ca²⁺/Mg²⁺ Tyrode's溶液的大圆底管中，置于35 °C水浴中。确保三段组织条均在管内。在35 ± 1 °C条件下孵育10–15分钟，每隔5分钟轻轻旋转混匀一次。切勿倒置管子。

6. 窦房结心肌细胞分离

1. 酶消化后，使用窄口火焰抛光的移液管将组织条轻柔地转移至第一个含有 2.5 ml KB 溶液（35 ± 1 °C）的小型圆底管中。通过轻轻旋转管子清洗组织。
   注意：此时组织条可能呈现半透明状，并可能发生聚集。酶消化后需极其轻柔地操作，以避免细胞丢失。
2. 将组织转移至第二个含有 2.5 ml KB 溶液（35 ± 1 °C）的小型圆底管中。轻轻旋转以进行清洗。
3. 将组织转移至第三个含有 2.5 ml KB 溶液（35 ± 1 °C）的小型圆底管中。轻轻旋转以进行清洗。
4. 将组织转移至含有 2.5 ml KB 溶液（35 ± 1 °C）的大型圆底管中。
5. 使用较大的火焰抛光移液管（图 1Aiii 和 图 1C），在约 0.5–1 Hz 的频率下持续吹打 5–10 分钟，使大型圆底管中的细胞解离。操作时需注意将解离管保持浸没在 35 ± 1 °C 的水浴中，并避免将气泡引入溶液。
   注意：吹打时间取决于解离移液管的直径和吹打力度。应调整时间，使解离结束时残留的组织碎片变得细薄、透明且呈丝状。若组织仍带有颜色，则解离可能不完全。吹打频率（0.5–1 Hz）由手动控制。
6. 将含有已解离 SAMs 的圆底管从水浴中取出，在室温下平衡 5 分钟。

7. 窦房结钙再适应（在室温下进行）

注意：对于将用于培养实验的SAMs，以下部分的操作应在无菌细胞培养罩内进行。如果SAMs将用于急性实验，则无需在无菌环境中执行这些步骤。

1. 加入 75 µl NaCl/CaCl₂ 适应溶液（表 2），轻轻旋转混匀，于室温孵育 5 分钟。
2. 加入 160 µl NaCl/CaCl₂ 适应溶液，轻轻旋转混匀，于室温孵育 5 分钟。
3. 加入 390 µl BSA 溶液（表 2），轻轻旋转混匀，于室温孵育 4 分钟。
4. 加入 1.25 ml BSA 溶液，轻轻旋转混匀，于室温孵育 4 分钟。
5. 加入 4.37 ml BSA 溶液，轻轻旋转混匀，于室温孵育 4 分钟。
   注意：钙离子的终浓度为 1.8 mM。
6. 完成钙离子再适应后，将 SAMs 静置约 10 分钟（依靠重力沉降）或以约 2,000 × g 离心 3 分钟，收集细胞。
   1. 对于急性分离的细胞，使用玻璃巴斯德吸管轻柔移除并弃去约 5 ml 上清液，保留约 2 ml 体积的细胞悬液。将这些细胞于室温保存，最长可保存约 8 小时，用于膜片钳记录。
   2. 对于培养细胞，使用无菌玻璃巴斯德吸管尽可能移除上清液。将细胞沉淀重悬于 1 ml 预热至 37 °C 的铺板培养基（表 2）中。

8. 窦房结心肌细胞的铺板与培养（急性分离细胞可跳过此步骤）

1. 用巴斯德吸管从第 3.3 步的盖玻片上移除层粘连蛋白溶液。立即将 500 µl（约 50–100 个细胞）接种到每个涂有层粘连蛋白的盖玻片上（来自步骤 3）。
   注意：铺板培养基和培养基中均含有收缩抑制剂 2,3-丁二酮单肟（BDM），以防止细胞收缩，从而避免细胞丢失⁹。
2. 将含有新接种 SAMs 的 24 孔板放回培养箱，在 37 °C、95% 空气 / 5% CO₂ 的环境中继续培养。在铺板培养基（表 2）中孵育 4–6 小时，使细胞充分贴附于盖玻片。
3. 用无菌巴斯德吸管轻轻移除铺板培养基。每孔加入 500 µl 预热至 37 °C 的培养基（表 2）。

9. 成年窦房结心肌细胞培养物的腺病毒感染转导（急性分离细胞可跳过此步骤）

1. 在显微镜下观察视野中的细胞数量，并根据放大倍数进行调整，以估算每张盖玻片上的细胞数量（在接种腺病毒前立即进行）。计数时需包括所有细胞，而不仅限于SAMs。
2. 将腺病毒稀释于Medium 199培养基中，并根据病毒滴度调整稀释比例，使加入1–10 μl病毒液即可达到每个细胞100个病毒单位的感染复数（MOI）。以逐滴方式将腺病毒溶液直接加至培养板上的SAMs中。
3. 将细胞与含病毒的培养基共孵育过夜（约12–14小时），随后更换为新鲜培养基。将细胞继续置于培养箱中培养，每48小时更换一次培养基，直至获得所需的蛋白表达水平。

10. 急性分离或培养的SAMs的功能评估

注意：以下方案是使用两性霉素穿孔膜片钳技术记录同一细胞的自发动作电位和 I_f 电流，对分离的窦房结细胞进行功能评估的示例（参见参考文献⁹）。

1. 按照表3所述配制记录溶液。
2. 在记录当天新鲜配制20 mg/ml两性霉素B（amphotericin-B）的DMSO储备液。将储备液置于室温保存，并避光。使用前，将两性霉素B储备液用细胞内液稀释至终浓度为200 µg/ml。最终的移液管溶液需置于冰上，并避光保存。
   注意：含两性霉素B的移液管溶液应每小时新鲜配制，方法是取适量储备液加入细胞内液中，并涡旋混匀至少1分钟。
3. 将急性分离的SAM细胞悬液的一部分，或带有培养SAM的玻璃盖玻片碎片，转移至含有Tyrode溶液的记录浴槽中，溶液温度维持在35 ± 1 °C。在进行电生理记录前，用Tyrode溶液灌流细胞至少2分钟，以去除培养基中残留的BDM。
   注意：转移至Tyrode溶液后，应立即可见自发性收缩。用于记录的SAM可通过多种特征进行识别，包括自发性收缩活动、典型形态学特征（例如，图2）、无横纹、HCN4蛋白表达、I_f电流的存在、膜电容<50 pF，以及具有舒张期去极化相和缓慢上升支的自发动作电位波形。
4. 使用电阻为1.5–3.0 MΩ的硼硅酸盐玻璃移液管，先将尖端浸入不含两性霉素B的细胞内液中10–30秒以填充尖端，然后用含两性霉素B的溶液从后方填充移液管。应尽快形成吉欧姆（GΩ）级的细胞附着式封接。若封接困难，可延长尖端填充时间。
   注意：在形成细胞附着式封接后，应持续监测接入电阻，仅在接入电阻稳定于<10 MΩ时方可开始记录。
5. 记录自发性动作电位时，将放大器切换至快速电流钳模式，不施加电流注入。
   注意：如先前报道¹⁰，记录动作电位时，细胞外Tyrode溶液中应包含1 nM异丙肾上腺素，以稳定放电频率。

结果

本文所述方案此前已被用于从成年小鼠中分离出自发性活跃的窦房结细胞（SAMs），这些细胞适用于多种不同的膜片钳研究^5-8。此外，该方案还可获得可用于体外培养、维持长达一周时间的分离SAMs。通过腺病毒感染可实现外源基因向培养细胞的转导⁹。本节展示的结果源自我们先前的研究工作，用以举例说明急性分离及培养的SAMs所具有的特性。

如图2所示，自发性活跃的SAMs在培养条件下可维持长达6天。培养的细胞整体形态与急性分离的SAMs非常相似，与急性分离的细胞相比，培养细胞的平均长度、宽度、横截面积或膜电容均无显著变化（图2B–E）。然而，随着时间推移，培养过程中存活SAMs的数量有所减少。因此，若实验设计需要大量数据集，建议从多个动物来源的细胞混合后制备培养物。

讨论

本文介绍了从成年小鼠中分离和培养完全分化的窦房结心肌细胞的详细方案。该分离方案能够稳定地获得可自发产生电活动的小鼠窦房结细胞（SAMs），适用于立即进行电生理学分析或后续培养。其他多个研究团队也已报道过类似的方案（例如，参见参考文献）^{11,12,10,13-17}）。然而，我们维持成年小鼠SAMs的方案 体外 保持细胞的特征性形态、自发活动及电生理特性，并可实现腺病毒介导的蛋白质递送⁹.

在对实验方案进行修改和故障排查时，应注意几个关键步骤。第一个关键因素是消化酶（步骤 1.4）在不同批次间活性存在显著差异，这会极大地影响单个制备过程中分离得到的肺泡巨噬细胞（SAM）的数量和质量。这种变异性在弹性蛋白酶（elastase）中尤为明显，通常需要针对不同批次进行特异性优化，即在多次制备过程中（通常平行进行）对酶的浓度和作用时间进行梯度摸索，以最大化细胞数量并保证细胞活性。一些从不同物种分离 SAM 的方案使用单独的胶原酶和蛋白酶，而非本方案中使用的胶原酶-蛋白酶混合酶制剂。然而，这些单独酶制剂的批次间变异性也较高（与弹性蛋白酶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅胶/弹性体试剂盒	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
硼硅酸盐 9" 帕氏移液管	Fisher Scientific	13-678-20C
小型圆底培养管	Fisher Scientific	352059
大型圆底培养管	Corning	14-959-11B
弹性蛋白酶	Worthington Biochemical	LS002279
Liberase TM	Roche	5401119001	组织解离溶液
肝素	SAGENT Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10
小鼠层粘连蛋白	Corning	CB-354232
12 mm 圆形玻璃盖玻片	Fisher	12-545-80
24孔培养板	Fisher	08-772-1
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767
Ad-eGFP	Vector Biolabs	1060
塑料一次性转移移液管	Fisher Scientific
微型剪刀	Fisher Scientific	17-467-496
Dumont #4 镊子	Roboz Instruments	RS-4904
组织镊	Roboz Instruments	RS-8164
解剖虹膜剪	WPI, Inc.	501264
解剖针	Fine Science Tools	26002-20
NaCl	Sigma	71376
KCl	Sigma	60128
KH2PO4	Sigma	60353
HEPES	Sigma	54457
葡萄糖	Sigma	G0350500
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	C1016
牛磺酸	Sigma	T0625
BSA	Sigma	A2153
K-谷氨酸盐	Sigma	G1501
K-天冬氨酸盐	Sigma	A6558
MgSO4	Sigma	M7506
肌酸	Sigma	C0780
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
两性霉素B	Fisher Scientific	1397-89-3
异丙肾上腺素	Calbiochem	420355
Media199	Sigma	M4530
2,3-丁二酮单肟（BDM）	Sigma	B0753
胎牛血清（FBS）	Sigma	SH30071
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A5611
胰岛素	Sigma	I3146
转铁蛋白	Sigma	I3146
硒	Sigma	I3146
青霉素	GE Healthcare	SV30010
链霉素	Hyclone	SV30010