从小鼠成年心脏窦房结分离、培养及功能表征心肌细胞的方法

摘要

本文演示了从小鼠成年个体中分离窦房结心肌细胞（SAMs）的方法，可用于膜片钳电生理学或成像研究。分离的细胞可直接使用，也可在培养中维持，以实现目的蛋白（如基因编码报告蛋白）的表达。

摘要

窦房结心肌细胞（SAMs）作为心脏的天然起搏细胞，通过产生自发性动作电位（APs）启动每一次心跳。这些起搏动作电位反映了多种膜电流与细胞内钙循环的协调活动。然而，驱动SAMs自发起搏活动的确切机制仍不明确。急性分离的SAMs是解析心脏起搏分子基础实验中的关键样本。然而，由于解剖结构不清晰、显微解剖复杂以及酶消化条件难以控制，急性分离SAMs尚未被广泛应用。此外，直到最近，尚无可行方法能够长期培养成年小鼠SAMs以用于蛋白质表达研究。本文提供了一种从成年小鼠分离SAMs的分步操作方案及视频演示，同时展示了一种维持成年小鼠SAMs长期培养的方法。 体外 以及通过腺病毒感染表达外源蛋白。采用这些方法制备的急性分离和培养的SAMs适用于多种电生理和成像研究。

引言

心脏窦房结中的起搏心肌细胞（窦房结心肌细胞，"SAMs"）可产生自发的节律性动作电位（AP），并由此在心肌中传播，启动每一次心跳。利用多种物种急性分离的SAMs进行的实验，对于阐明起搏活动产生机制至关重要。SAMs是一类高度特化的心肌细胞，在形态、功能和蛋白质表达方面均显著区别于心房和心室心肌细胞。SAMs中自发动作电位的典型特征是在舒张期出现自发性去极化，使膜电位达到阈值，从而触发下一次动作电位^1,2。这种"起搏电位"依赖于多种膜电流的协同作用，包括"起搏电流"（I_f）、T型和L型钙电流，以及由肌浆网释放Ca²⁺驱动的钠钙交换电流（I_NCX）^3,4。

尽管急性分离的小鼠窦房结（SAM）是研究起搏功能必不可少的实验材料，但从小鼠分离SAM的方法较难掌握，因为小鼠窦房结（SAN）解剖结构不明显且体积微小，需要精细的显微解剖操作，同时细胞的分离需结合酶消化与机械解离，并进行 careful optimization。

我们在此提供一个详细的视频演示，展示了一种已成功用于从成年小鼠分离SAMs以进行膜片钳记录的实验方案。^5-8据我们所知，目前尚无其他来源提供此类可视化演示。此外，本文还展示了一种新方法，可将成年小鼠分离的SAMs进行体外维持 ....

方案

所有动物实验均按照科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。以下标准方案已使用2-3月龄的雄性C57BL/6J小鼠进行优化。

1. 实验前预先准备溶液储备液和耗材

注意：所需设备和材料请参见材料表。

1. 按 表1 所示，分别配制 1 L 的以下溶液：完全 Tyrode's 溶液、低 Ca²⁺/Mg²⁺ Tyrode's 溶液、改良 Kraft-Brühe (KB) 溶液和牛血清白蛋白 (BSA) 溶液。所有溶液均使用超纯过滤的去离子水配制。将每种溶液分装为 50 ml 等份，于 20 °C 保存，最长可保存六个月。实验前立即取出单份等份溶液解冻，并于 4 °C 保存，最长可保存一周。
2. 通过将 NaCl 和 CaCl₂ 溶解于超纯过滤的去离子水中，配制 50 ml 的 10 mM NaCl 和 1.8 mM CaCl₂ 适应溶液（表1）。室温保存，最长可保存六个月。
3. 用移液器将弹性蛋白酶分装为每管 4.75 酶活性单位 (U) 的等份，置于微量离心管中。4 °C 保存，最长可保存三个月。
4. 用移液器将胶原酶-蛋白酶混合酶以 375 μg....

结果

本文所述方案此前已用于从成年小鼠中分离出自发性活动的窦房结细胞（SAMs），这些细胞适用于多种不同的膜片钳研究^5-8。此外，该方案还可获得可用于培养、并在体外维持长达一周的分离SAMs。通过腺病毒感染可实现外源基因向培养细胞的转导⁹。本节展示的结果来源于我们之前的研究工作，用以举例说明急性分离及培养的SAMs所具有的特性。

如图2所示，自发性活跃的窦房结细胞（SAMs）在培养中可维持长达6天。培养的细胞整体形态与急性分离的窦房结细胞非常相似，与急性分离的细胞相比，培养细胞的平均长度、宽度、横截面积或膜电容均无显著变化（图2B–E）。然而，随着时间推移，培养中存活的窦房结细胞数量有所减少。因此，若实验设计需要大量数据集，建议从多个动物来源的细胞混合后制备培养物。

讨论

本文介绍了从成年小鼠中分离和培养完全分化的窦房结心肌细胞的详细方案。该分离方案能够稳定地获得可自发产生电活动的小鼠窦房结细胞（SAMs），适用于立即进行电生理学分析或后续培养。其他多个研究团队也已报道过类似的方案（例如，参见参考文献）^{11,12,10,13-17}）。然而，我们维持成年小鼠SAMs的方案 体外 保持细胞的特征性形态、自发活动及电生理特性，并可实现腺病毒介导的蛋白质递送⁹.

在对实验方案进行修改和故障排查时，应注意几个关键步骤。第一个关键因素是消化酶（步骤 1.4）在不同批次间活性存在显著差异，这会极大地影响单个制备过程中分离得到的肺泡巨噬细胞（SAM）的数量和质量。这种变异性在弹性蛋白酶（elastase）中尤为明显，通常需要针对不同批次进行特异性优化，即在多次制备过程中（通常平行进行）对酶的浓度和作用时间进行梯度摸索，以最大化细胞数量并保证细胞活性。一些从不同物种分离 SAM 的方案使用单独的胶原酶和蛋白酶，而非本方案中使用的胶原酶-蛋白酶混合酶制剂。然而，这些单独酶制剂的批次间变异性也较高（与弹性蛋白酶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅胶/弹性体试剂盒	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
硼硅酸盐 9" 帕氏移液管	Fisher Scientific	13-678-20C
小型圆底培养管	Fisher Scientific	352059
大型圆底培养管	Corning	14-959-11B
弹性蛋白酶	Worthington Biochemical	LS002279
Liberase TM	Roche	5401119001	组织解离溶液
肝素	SAGENT Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10
小鼠层粘连蛋白	Corning	CB-354232
12 mm 圆形玻璃盖玻片	Fisher	12-545-80
24孔培养板	Fisher	08-772-1
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767
Ad-eGFP	Vector Biolabs	1060
塑料一次性转移移液管	Fisher Scientific
微型剪刀	Fisher Scientific	17-467-496
Dumont #4 镊子	Roboz Instruments	RS-4904
组织镊	Roboz Instruments	RS-8164
解剖虹膜剪	WPI, Inc.	501264
解剖针	Fine Science Tools	26002-20
NaCl	Sigma	71376
KCl	Sigma	60128
KH2PO4	Sigma	60353
HEPES	Sigma	54457
葡萄糖	Sigma	G0350500
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	C1016
牛磺酸	Sigma	T0625
BSA	Sigma	A2153
K-谷氨酸盐	Sigma	G1501
K-天冬氨酸盐	Sigma	A6558
MgSO4	Sigma	M7506
肌酸	Sigma	C0780
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
两性霉素B	Fisher Scientific	1397-89-3
异丙肾上腺素	Calbiochem	420355
Media199	Sigma	M4530
2,3-丁二酮单肟（BDM）	Sigma	B0753
胎牛血清（FBS）	Sigma	SH30071
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A5611
胰岛素	Sigma	I3146
转铁蛋白	Sigma	I3146
硒	Sigma	I3146
青霉素	GE Healthcare	SV30010
链霉素	Hyclone	SV30010