我们描述了一种用于显微镜检测的标准化抗体染色方案，用于确定静息和活化的人类初始CD4+ T细胞中神经节苷脂的膜表达及定位。此外，还介绍了使用<40,000个细胞进行的实时PCR实验，该实验无需额外的低输入RNA试剂盒。
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摘要
摘要
本文所述方法用于激活初始CD4+ 悬浮状态下的T细胞及其在盖玻片上的黏附，可用于共聚焦显微镜分析，以实现对参与CD4功能的神经节苷脂进行空间定位与可视化观察+ T细胞活化，以及通过流式细胞术、蛋白质印迹或实时PCR等方法进行的补体表达谱分析实验。利用具有高亲和力和特异性的抗神经节苷脂抗体，可通过流式细胞术定量检测神经节苷脂的表达水平，并通过显微镜观察其细胞内定位。然而，对悬浮细胞进行适当处理时，需对培养板进行相应处理，以促进细胞贴附，满足荧光或共聚焦显微镜成像的需要。在本研究中，我们描述了一种用于检测初始CD4⁺ T细胞中GD3和GD2神经节苷脂的表达及其与TCR共定位的实验方案。+ T细胞活化。此外，使用实时PCR实验 <40,000个细胞即可用于GD3及GM2/GD2合酶基因的分析，表明基因分析实验可在细胞数量较少的情况下进行，且无需额外使用低输入量RNA试剂盒。
引言
CD4+ T 细胞通过其效应功能协调免疫应答，该过程由抗原呈递细胞激活后启动1。研究激活过程中被调控的细胞机制，有助于深入了解免疫功能的基本过程。然而，对初始型 CD4+ T 细胞的研究可能较为复杂，因为它们在外周血中仅占极小的细胞群体2。
已有多个研究报告利用荧光显微镜研究了参与CD4+ T细胞活化的不同分子的定位，主要集中在与质膜相关的蛋白质3。神经节苷脂是一类含唾液酸的鞘糖脂，尽管其在神经细胞中含量丰富且已被广泛研究，但其他细胞（如免疫细胞）也表达具有重要生物学功能的神经节苷脂4,5。我们先前报道过，在人初始CD4+ T细胞活化过程中，α2,8-唾液酸转移酶ST8Sia 1（GD3合成酶）和GM2/GD2合成酶表达上调，导致细胞表面显著新生表达GD2神经节苷脂，并上调GD3神经节苷脂的表达6。进一步研究GD3、GD2及其他神经节苷脂在免疫细胞中的作用，有助于补充仅基于蛋白质视角的免疫功能认识。
通常，神经节苷脂表达的研究依赖于薄层色谱法（Thin Layer Chromatography, TLC）7等技术，但该方法无法实现神经节苷脂在质膜或亚细胞区室中的空间定位，从而限制了生物学分析。
本研究中，我们描述了一种通过抗体介导的方法，在抗CD3/抗CD28激活后，对人初始CD4+ T细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）中的GD3和GD2神经节苷脂进行鉴定与定位的实验方案。该方案还可用于分析悬浮状态下少量细胞中神经节苷脂的基因及分子表达水平，并能够获得高质量的图像6，尤其考虑到淋巴细胞体积较小（9 µm）的特点。
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方案
在获得知情同意并经莫雷洛斯州立自治大学细胞动力学研究中心生物伦理委员会批准后，采集了健康男性供体的外周血。
1. 人初始CD4+ T细胞的分离与活化
- 在知情同意下采集健康人类供体的外周血2 ml，加入2 ml无菌PBS-EDTA（1×磷酸盐缓冲液（PBS），2 mM EDTA，pH 7.4）稀释。将稀释后的血液缓慢加至3 ml密度为1.077的蔗糖溶液上层，操作方法同前文所述。8.
注意：由于密度差异，离心过程中不同成分的沉降速度不同，可导致红细胞完全沉淀，而密度较低的单个核细胞则在上层形成一层。2 ml 外周血可获得约 0.5 x 106 初始CD4+ 纯化步骤后的T细胞 - 在21 °C下以250 × g离心30分钟（使用适用于圆底管、固定角度为30 mm的转子），无制动，以形成外周血单个核细胞（PBMCs）的密度梯度。离心后，PBMCs可清晰呈现为白色环状层。用移液器收集PBMCs，转移至无菌管中进行洗涤。
- 在 PBS-EDTA 溶液中以 250 × g 离心洗涤 3 次，每次 10 分钟后，进行初始 CD4+ T细胞。可使用分选方法或多种类型的纯化试剂盒来实现此目的。建议使用 >1 × 107 用于纯化的外周血单个核细胞（PBMCs）
- 纯化初始CD4+ 通过磁珠负向筛选法分离T细胞。使用抗CD45RO、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD56、CD123、抗TCRγ/δ、抗HLA-DR和CD235a（glycophorin A）抗体进行负向筛选。通过流式细胞术检测CD4+CD45RA+细胞比例，评估纯度。
注意：可选择将PBMC在37 °C和5% CO₂条件下孵育过夜2 密度为 1 x 106 细胞/ml，加入10 ml补充培养基以促进单核细胞贴壁，随后继续进行初始CD4+ T细胞纯化。高效回收初始CD4+ 外周血T细胞的纯化在很大程度上依赖于所采用的纯化系统。
- 纯化初始CD4+ 通过磁珠负向筛选法分离T细胞。使用抗CD45RO、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD56、CD123、抗TCRγ/δ、抗HLA-DR和CD235a（glycophorin A）抗体进行负向筛选。通过流式细胞术检测CD4+CD45RA+细胞比例，评估纯度。
- 在24孔细胞培养板中，每孔加入250 µl含5 µg/ml抗CD3单克隆抗体的PBS，37 °C孵育至少2小时。
注意：当从初始CD4细胞获取较少数量时，可使用96孔板。+ T细胞被用于（例如， 2 × 104-1 × 105). - 从24孔板或96孔板中移除抗CD3抗体稀释液，并用无菌1×PBS洗涤板孔两次。
- 稀释初始CD4+ T细胞 >纯度95%（CD4+CD45RA+），密度为1 x 106 细胞数/ml，置于添加有3%胎牛血清（或含10%血清的RPMI）的改良RPMI 1640培养基中，同时补充2 mM谷氨酰胺及抗生素（1 U/ml青霉素，1 µg/ml链霉素）。
注意：如果需要在PBMCs中进行神经节苷脂定位，请按照下述相同的稀释和刺激方案进行操作。 - 向24孔板中的抗CD3包被孔及未包被孔（对照细胞）各加入500 µl细胞稀释液。或者，向96孔板的孔中各加入100 µl细胞稀释液。
- 完成初始 CD4 的刺激条件+ 通过添加1 µg/ml抗CD28抗体至抗CD3包被孔中，处理T细胞。
- 保持静息的 CD4+ 未包被孔中的T细胞作为对照，不添加抗CD28抗体。将静息和活化的CD4+ T细胞在37 °C和5% CO₂的标准条件下培养0至72小时2.
- 通过流式细胞术检测静息和活化的初始CD4+ T细胞在激活后16小时的早期活化标志物CD69表达，或在激活后48小时的晚期活化标志物CD25表达，以确认活化是否充分。+ 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育的 T 细胞2 在无或有抗 CD3/CD28 抗体的情况下9,10.
2. 静息与活化初始CD4+ T细胞的黏附
- 将12 mm圆形盖玻片经高压灭菌并用紫外光照射至少15分钟以进行灭菌。
- 将盖玻片放入无菌的24孔细胞培养板中。
注意：对于细胞数量少于1 × 105的培养物，建议使用带有适配小孔的载玻片培养腔，以防止细胞在盖玻片上扩散。 - 用200 µl浓度为0.1%（w/v）的聚-L-赖氨酸溶液（分子量150–300 KDa）覆盖盖玻片（或载玻片培养腔），室温孵育5分钟，去除溶液后于室温干燥至少1小时。
- 轻柔混匀，从24孔板中收集静息和活化的初始CD4+ T细胞。计数细胞，并在必要时用新鲜的完全培养基调整浓度，将1 × 105个细胞转移至涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片上。于37 oC、5% CO2条件下孵育至少6小时。
3. 静息与活化初始CD4+ T细胞的收集与固定
- 小心移除培养的静息态和活化初始 CD4+ T 细胞中的培养基。
- 缓慢加入 500 µl 室温的无菌 PBS。
注意：向孔中添加或移除溶液时应小心操作，以防止细胞从盖玻片上脱落。 - 弃去 PBS，并加入另 500 µl PBS 以彻底清除残留的培养基。
- 通过加入 500 µl 过滤后的 4% 多聚甲醛固定细胞（过滤可去除可能干扰显微镜分析的微粒），在室温下孵育 30 分钟（推荐）或在 4 °C 下过夜。
警告：多聚甲醛是一种有毒且易挥发的化合物，已被确认为人类致癌物。操作时须遵循适当的安全规程，谨慎使用。 - 移除固定液，并在室温下用 PBS 至少洗涤两次。
- 继续进行下一步操作，或在 4 °C 下用 500 µl PBS 保存板孔数天，直至染色。
注意：此过程中的无菌操作有助于避免微生物生长。
4. 染色、封片及共聚焦显微镜观察
- 吸去孔中的 PBS，每孔加入 500 µl 冷封闭缓冲液（1× PBS，0.5% 标准级牛血清白蛋白，1% 胎牛血清，pH 7.4），冰上孵育 20 分钟。
- 小心吸去封闭缓冲液，缓慢加入用封闭缓冲液稀释至 2.5 µg/ml 的一抗（抗神经节苷脂 GD3 单克隆抗体 R24，抗 GD2 单克隆抗体 14G2a）、PE 标记的抗 CD25 抗体、APC 标记的抗 TCR 抗体以及同型对照抗体。
- 冰上孵育 2 小时，或 4 °C 过夜。
注意：建议采用缓慢的轨道振荡。 - 小心吸去抗体溶液，缓慢加入 500 µl PBS，重复洗涤两次。
- 加入用封闭缓冲液稀释至 0.1 µg/ml 的二抗（针对 R24 抗 GD3 的 FITC 标记抗 IgG3 抗体，针对 14G2a 抗 GD2 的 Alexa Fluor 488 标记或 Alexa Fluor 647 标记抗 IgG2a 抗体）。
- 避光、冰上孵育 1 小时，不振荡。
- 按步骤 4.4) 所述方法用 PBS 洗涤三次。保持孔内有足够 PBS，防止样本脱水。
- 加入用 PBS 稀释至 0.1 µg/ml 的 Hoechst 333258 染色液。
- 室温孵育 15 分钟后吸去染液，用 PBS 洗涤三次。
- 将载玻片置于纸巾上，每片加入 20 µl 封片液（含 50% 甘油的 PBS）或商用封片液，以防止样本荧光淬灭和褪色。
- 用精细镊子小心夹取盖玻片，将其覆盖在封片液上，确保盖玻片上贴有细胞的一面与封片液接触。用指甲油封固盖玻片边缘，随后使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行观察。
5. RNA 的提取
- 准备包被抗 CD3 抗体（5 µg/ml）的 96 孔板。每孔加入 4 × 104 个初始 CD4+ T 细胞，置于 100 µl 补充培养基中，并加入抗 CD28 抗体（1 µg/ml）以完成刺激。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 0 至 72 小时。
- 在不同激活后时间点，将细胞转移至微量离心管中。
- 加入 500 µl PBS，于室温下以 250 × g 离心 5 分钟。
- 移除上清液，加入 1 ml Trizol 试剂。
- 室温孵育 5 分钟，将样品于 -80 °C 保存至少 24 小时。根据需要进行 RNA 提取。
注意：样品在 -80 °C 保存至少 24 小时可提高 RNA 产量。同时，必须佩戴手套以防止 RNase 导致 RNA 降解。 - 将样品置于 37 °C 水浴中孵育 2 分钟以解冻。
- 加入 200 µl 氯仿，手动剧烈振荡 30 秒（避免使用涡旋振荡器以防止 RNA 过度剪切）。室温孵育 5 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
- 将水相转移至新的微量离心管中。
- 加入 500 µl 异丙醇，轻轻颠倒混匀 3 次。
- 室温孵育 10 分钟，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
- 通过倒置弃去上清液。
- 加入 1 ml 冰冷的 75% 乙醇，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
- 彻底弃去上清液，打开管盖使 RNA 沉淀自然干燥。
注意：此时沉淀通常不可见，但仍需继续操作。 - 将沉淀溶于 20 µl 分子生物学级水中。使用 Nanodrop 测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光度，计算核酸浓度和纯度。
- 按照任意常规逆转录酶试剂盒的说明书，小心进行 cDNA 合成。
注意：从 4 × 104 个初始 CD4+ T 细胞中通常可获得约 0.5–2 µg RNA。cDNA 可由 100 ng RNA 合成，并可直接用于实时 PCR 反应，无需使用低 RNA 输入专用试剂盒。
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结果
本论文所述方案可获得高质量的培养后静息态和活化态人初始CD4+ T细胞（图1）。与静息状态相比（图1A），活化的CD4+ T细胞表现出典型的增殖特征（图1B）。通过共聚焦显微镜观察，CD25晚期活化标志物可用于评估72小时时的高效活化情况（图1C）。CD69标志物目前常用于流式细胞术或显微镜检测中的早期活化评估。静息态和活化态初始CD4+ T细胞在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上的贴附，有助于研究GD3和TCR的表达与定位，可通过抗GD3和抗TCR抗体双重标记实现（图2）。如我们先前报道，活化过程伴随细胞表面GD3和GD2神经节苷脂的重塑6。此外，从4 × 104个细胞中进行GD3及GM2/GD2合成酶的基因表达定量分析（图2和图3）...
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讨论
所述方案可用于在CD4细胞悬液中定位神经节苷脂或蛋白质+ T细胞或其他免疫细胞（例如，外周血单个核细胞（PBMCs）， 图5) 从少量细胞开始。由于T细胞体积较小且不具有贴壁特性，如果细胞未正确贴附，则荧光显微镜成像所获得的信息会较差或图像质量较低。
该方案若结合高质量的共聚焦显微镜分析，相较于薄层色谱等神经节苷脂检测技术具有显著优势，因其能够揭示治疗过程中神经节苷脂的空间定位与动态变化例如， T细胞活化），从而获得具有生物学意义的数据11,12,13此外，该方案允许从少量CD4开始评估神经节苷脂的表达+ T细胞（2 x 104) 可用于优化重复次数或不同检测的数量6.
黏附后在洗涤和抗体染色过程中的细致操作对于维持细胞数量和完整性至关重要。由于CD4+ T细胞与盖玻片的结合较弱，因此在添加和移除溶液时必须格外小心；否则将导致细...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 José Luis Daniotti 博士的评论。感谢 J. Arturo Pimentel 博士和墨西哥国立自治大学国家先进显微镜实验室在共聚焦图像采集方面提供的协助。I.M.-D. 和 T.M.V.C. 的研究得到了墨西哥国家科学与技术委员会（CONACYT）基金项目 157634 和 253596、拉丁美洲糖生物学学会（A.C.）的资助。T.M.V.-C. 获得了 CONACYT 提供的奖学金（245192）。我们还感谢 CONACYT（253596）糖科学与健康专题网络提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高级 RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | 添加 3% FBS |
| 小鼠抗人 CD3 抗体 | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 克隆 |
| 小鼠抗人 CD28 抗体 | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 克隆 |
| 小鼠抗人 GD3 抗体 | Abcam | ab11779 | R24 克隆 |
| 小鼠抗人 GD2 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a 克隆 |
| FITC 标记的抗小鼠 IgG3 抗体 | Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 标记的抗小鼠 | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a 抗体 | |||
| Alexa Fluor 647 标记的抗小鼠 | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a 抗体 | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol 试剂 | Invitrogen | 15596-026 | |
| 人初始型 CD4+ T 细胞分离试剂盒 II | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | 分选 | |
| Nunc Lab-tek 培养皿载玻片系统 | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 激光共聚焦显微镜 (Olympus) | Olympus | 直立式 BX61WI 和 IX81 | |
| GD3 合成酶正向序列引物 | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | 参考文献 7 | |
| GD3 合成酶反向序列引物 | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | 参考文献 7 | |
| GM2/GD2 合成酶正向序列引物 | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | 参考文献 7 | |
| GM2/GD2 合成酶反向序列引物 | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | 参考文献 7 |
参考文献
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