本研究描述了一种在小鼠中诱导加速动脉粥样硬化的侵入性操作方法。与使用电损伤或冷冻损伤的其他方法相比，机械性损伤更接近人类血管重建治疗后发生再狭窄的病理状况，因此非常适合用于研究相关分子机制。
本文内容
摘要
摘要
动脉粥样硬化是一种在动脉壁内发展的增生性纤维炎症性疾病，可导致血流减少或中断。此外，由于血管壁缺陷处发生破裂，动脉粥样硬化可诱发闭塞性血栓形成，这是心肌梗死或中风的主要原因，也是最常见的死亡原因。尽管心血管领域已取得诸多进展，但仍有许多问题尚未解决，进一步的基础研究对于加深我们对动脉粥样硬化过程中分子机制及其影响的理解至关重要。由于临床研究有限，亟需建立能够模拟动脉粥样硬化条件的代表性动物模型，例如支架植入、球囊血管成形术或内膜剥脱术后新生内膜的形成。由于小鼠具有多种优势，且是研究分子过程最常用的模型，本研究提出一种侵入性内皮剥脱手术，即导丝损伤模型，该模型可较好地模拟人类血管再通术后动脉内新生内膜形成的病理状态。
引言
动脉粥样硬化是心肌梗死或脑卒中等心血管事件背后的主要病理基础。引发急性心血管综合征的主要机制包括斑块破裂、表层侵蚀以及血栓形成。与斑块发展相关的多种临床情况包括：原发性动脉粥样硬化斑块、内膜剥脱术后再狭窄，以及球囊血管成形术（无论是否植入支架）后的再狭窄1。动脉损伤后，抑制炎症反应2,3以及内皮细胞室的修复对于预防进一步并发症至关重要1。由于伦理考量、成本限制以及对基本机制认识的不足，临床研究通常仅限于组织和血液样本。因此，有必要利用动物模型来研究分子机制4-6，以重现临床状况。我们建立的在动脉粥样硬化背景下加速新生内膜形成的动物模型，是在小动物中长期实施此类模型经验积累的结果7-11。小鼠模型因其操作简便、饲养成本低可实现大样本量实验，以及存在多种转基因和基因敲除品系，成为最具吸引力的研究模型。
小鼠模型的主要缺点是易受动脉粥样硬化疾病影响的主要动脉（如颈动脉、主动脉和股动脉）尺寸较小，这需要具备专业资质的外科技术和操作技能，才能对血管进行操作并侵入性地诱导动脉粥样硬化斑块的形成。因此，本文提出了一种用于模拟内膜切除术或支架植入术后再狭窄背景下加速新生内膜形成的模型，并提供了逐步操作指南和建议，以帮助感兴趣的人员更顺利地开展该实验。另一个缺点是，血管内皮剥脱是在正常的动脉壁上进行的，因此与临床实际情况相比，新生内膜的形成程度较为有限。载脂蛋白E基因敲除（Apoe-/-）小鼠在高脂饮食诱导下可达到较高的血浆胆固醇水平，从而形成新生内膜形成所必需的促炎性环境。
手术在体视显微镜下进行。通过颈部腹侧正中切口暴露颈总动脉。尽量减少对颈总动脉上方及周围解剖结构的操作，以降低术后炎症反应。暴露颈总动脉分叉处。为了诱导快速的内膜增生，需准备颈内动脉和颈外动脉以阻断血流，随后对颈总动脉进行去内膜处理。总之，该方法易于掌握，操作人员只需具备基本的动物手术经验即可学会。
方案
本文所述实验均依据德国法律及欧洲动物护理指南进行。动物饲养于德国亚琛大学医院实验动物科学研究所的动物设施内，由 Prof. Dr. R. Tolba 和 Dr. A. Teubner（动物福利官员）负责监督。
1. 动物护理
- 将小鼠饲养在专用的护理单元中，确保其能够正常获取食物，并接受专业的兽医监控和治疗。若动物由外部转移或购自第三方，请在进行实验操作前确保有一周的适应期。
2. 高脂血症诱导
- 在手术前一周开始，给6至8周龄、体重18至20克的雌性（可选）ApoE-/-小鼠喂饲致动脉粥样硬化饮食（21%脂肪、0.15%胆固醇、19.5%酪蛋白，重量/重量），并持续喂养至进行动脉粥样硬化斑块分析为止。
3. 手术准备
- 根据体重，通过腹腔注射每千克100 mg的氯胺酮和每千克10 mg的赛拉嗪来麻醉小鼠。在手术前通过检查反射消失和胡须无运动来确认麻醉效果充分。在眼部涂抹少量无菌眼膏，以减少干燥。
- 在手术过程中使用无菌材料和器械，确保维持无菌条件，以避免感染。
- 剃除小鼠颈部腹侧区域的毛发。切口前用聚维酮碘对皮肤进行消毒。在颈部区域中线、气管上方做1 cm长的皮肤切口。
- 分离两侧脂肪体，以充分暴露气管区域。使用牵开器固定肌层，暴露颈总动脉。如果存在覆盖颈总动脉的薄肌层，应进行钝性分离。
- 使用锐利的弯头镊子将颈总动脉与迷走神经和颈静脉分离，使内颈动脉和外颈动脉的分叉区域可见。在手术过程中使用0.9% NaCl溶液以防止组织干燥。
4. 导丝损伤
- 在颈总动脉靠近主动脉弓近端处，放置一根长7 cm的0/5丝线缝合线，形成一个开放环，以便随时可以结扎。
- 在颈外动脉上放置两根0/7丝线缝合线（每根长1.5 cm）：一根靠近分叉点，另一根尽可能远端。将它们均制备为开放环，以便随时可以结扎。
- 在颈内动脉下方放置一根1.5 cm长的0/7丝线缝合线，制备为开放环，以便随时可以结扎。
- 将小鼠手术台调整为小鼠头部朝向操作者，以确保去内皮过程中导丝插入时的正确位置（图1A）。
- 在显微镜下，用止血钳夹住并牵拉0/5丝线的两端，阻断颈总动脉的血流。
- 在结扎颈总动脉后，立即紧密结扎位于颈内动脉上的缝合环以及颈外动脉远端的缝合环（图1B）。
- 使用小剪刀在颈外动脉两个结扎环之间的远端进行小切口（动脉切开，约为血管直径的一半）（图1C）。如果切口过大，请参照故障排除说明（见讨论部分）。
- 使用 commercially polished 导丝，或由本单位专业人员自行抛光导丝。用酒精对14英寸抛光柔性导丝进行消毒，并将其浸入一滴0.9% NaCl溶液中以确保其在血管内顺利滑动。
- 通过颈外动脉的横向动脉切口将导丝插入颈总动脉（图1D）。通过沿血管推进并旋转导丝以实现内皮去内皮化。重复此操作三次。为提高可重复性，每只小鼠应保持相同的旋转幅度。
- 紧密结扎颈外动脉上的近端环。通过剪断颈总动脉和颈内动脉周围的缝合线，恢复颈动脉的血流。
5. 缝合与恢复
- 移除牵开器，并将肌层和两个脂肪体复位至生理位置。
- 若需进行超声心动图测量，用三针独立的6-0缝线关闭皮肤；若无需成像，可使用金属夹关闭皮肤。
- 将小鼠置于红外灯下，侧卧于左侧，直至其苏醒。在完全恢复之前，不得让动物无人看管，也不得与其他动物同处。
- 为便于后续识别，使用当地机构的系统对小鼠进行标记。请咨询所在机构的动物福利负责人。
6. 动脉粥样硬化斑块的分析
- 在实验终点，根据小鼠体重通过腹腔注射给予每公斤100 mg的氯胺酮和每公斤10 mg的赛拉嗪进行麻醉。通过反射消失和胡须无运动来确认麻醉效果。
- 通过眼球后或心脏穿刺进行放血，并收集血液以供进一步分析2.
- 用聚维酮碘对皮肤进行消毒。打开胸腔，切除心脏的右心耳。通过左心室灌注磷酸盐缓冲液以清除血管中残留的血液，随后灌注4%多聚甲醛（PFA）以固定组织。
- 若无需固定，在清洗后立即取出颈动脉2,4,11进行标准实验操作及目标分析：石蜡包埋、冷冻切片、mRNA 或蛋白质分析等。
- 使用弯头镊子和小剪刀，尽可能靠近主动脉弓处，小心地完整剥离包括分叉部位在内的颈动脉，尽量减少操作，以用于形态测量。
- 将颈动脉按照标准包埋方案包埋于石蜡块中。进行横切时，将颈动脉以分叉处朝上直立放置。从分叉处开始连续切取厚度为5 µm的切片，并将所有切片收集至涂覆处理过的组织学载玻片上图2A).
- 每10个染色一次th 使用Movat染色法显示各层膜结构2,4,11在使用10倍物镜采集所有血管的显微图像后，使用专门设计的软件测量每张切片的管腔、内弹力膜和外弹力膜。2,4,11，如图所示 图2B计算血管的内膜增生和中膜面积。
- 使用常规免疫组织化学染色法在连续切片中分析平滑肌细胞和巨噬细胞含量，或内皮修复情况2 (图 2C).
结果
动脉粥样硬化斑块诱导手术耗时15 - 20分钟，死亡率极低，主要死亡原因是手术过程中发生的出血。术后，小鼠在20 - 25分钟内从麻醉中恢复。手术后未观察到任何身体功能障碍（如瘫痪）或进食异常。
导丝损伤可诱导内皮细胞脱落，模拟球囊剥脱或支架植入后发生的血管病变。损伤后立即暴露的血管壁将被一层血小板覆盖，从而介导并促进单核细胞的黏附12。来自中膜的活化平滑肌细胞将增殖并迁移至内膜区域，形成新生内膜。其他来源的平滑肌细胞前体细胞也会从血液中迁移而来（估计约占40%），参与新生内膜的生长。斑块形成过程通常在导丝损伤后约4周、内皮完全再形成时终止。
可采用Movat染色法评估新生内膜的形成。每个切片的斑块大小可通过软件进行计算，如图2B所示。总斑块面积（左侧颈总动脉）可在70,000 - 100,000 µm²之间变化，而对照血管面积（右侧颈总动脉）则在7,000 - 8,000 µm²之间变化。这些数值在很大程度上依赖于手术操作者。因此，我们强烈建议在同一项研究的实验过程中由同一手术操作者完成手术。
形成的斑块类似于 支架内 再狭窄主要由中膜来源的增殖和迁移的平滑肌细胞构成。通过免疫染色方法确定的细胞组成显示，平滑肌细胞约占新生内膜的30–40%，而巨噬细胞约占损伤血管新生内膜的15–25%。通过内皮细胞标志物染色后，可测量再内皮化程度，计算方法为染色周长占管腔总周长的百分比。通常情况下，术后3周再内皮化可达80–90%，术后4周时应基本完成（图 2C）。为了追踪斑块在发育过程中的生长情况，可根据研究兴趣和研究对象，在导丝损伤后的每个时间点重复进行相同的分析（参见 表1).
图 1. 手术操作的示意图。 (A) 在导丝损伤操作过程中，手术台相对于操作者的位置；(B) 在显微镜下以10倍放大观察到的颈总动脉及其分支的放大视图；(C) 在显微镜下以10倍放大观察到的颈外动脉切口大小；(D) 使用14英寸导丝进行导丝损伤操作的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 再狭窄斑块分析。（A） 颈总动脉在导丝损伤诱导后4周的斑块分析示意图。（B） 导丝损伤后4周新生内膜的形成情况，以及用于分析的主要参数示意图。内膜（绿色区域）为管腔（红色）与内弹性膜（绿色线）之间的区域。中膜（黄色区域）为外弹性膜（黄色线）与内弹性膜（绿色线）之间的区域。比例尺：100 µm。（C） 参与新生内膜形成的几种主要细胞类型的染色代表性图像。平滑肌细胞（平滑肌肌动蛋白——红色，比例尺：100 µm）、巨噬细胞（Mac 2——绿色，比例尺：100 µm）和内皮细胞（CD31——红色，箭头所示，比例尺：50 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 时间 | 血栓 | 斑块面积（µm²） | 巨噬细胞 （占斑块百分比） | 平滑肌细胞 （占斑块百分比） | 内皮再形成 （管腔周长百分比） |
| 1 天 | 存在 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 周 | - | < 30 000 | > 10 | < 50 | < 50 |
| 2 周 | - | < 50 000 | > 10 | < 50 | > 50 |
| 3 周 | - | < 70 000 | 15–25 | 30–40 | 80–90 |
| 4 周 | - | 70 000 – 100 000 | 15–25 | 30–40 | 完全 |
表1. 斑块的时间依赖性发育。
| 模型 | 动物 | 优点 | 缺点 |
| 饮食诱导的天然动脉粥样硬化 | 小型 |
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| 大型 |
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| 球囊扩张 | 小型 |
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| 大型 |
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| 导丝损伤 | 小型 |
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| 支架植入 | 小型 |
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| 大型 |
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表2. 现有动脉损伤模型的优点与缺点。
讨论
本文为即使缺乏动物手术经验的人员提供了执行导丝损伤手术的实用技巧。该手术有两个关键步骤：颈外动脉的切开和导丝的插入。颈外动脉切口应尽可能远离分叉处进行，以确保有足够的残留组织（图1C）。切口不宜过大，以免切断整个血管。第二个关键步骤是在动脉切开和导丝插入过程中，若血流未被有效阻断，则存在较高的出血风险。此外，若导丝未能正确进入血管腔，可能导致内皮剥脱不完全或动脉破裂。为避免此类情况，必须在手术前仔细打磨导丝表面。
为了优化实验方案，应将手术台调整至小鼠头部朝向术者的位置，以获得更好的视野、操作可及性和对导丝的精准控制。此外，为提高实验的可重复性，所有研究中应使用相同的导丝。由于导丝尺寸固定，因此必须通过选用相同性别、年龄和体重的小鼠来尽量减少个体间的差异。随后，伊文思蓝染色有助于术者判断去内皮处理的效率。合适的设备是手术成功实施的前提条件。10倍体视显微镜对于完成该操作至关重要。导丝的正确制备（例如对其进行抛光）极为关键。因此，我们强烈建议在有条件的情况下，由专业的技术人员完成导丝的制备工作。
本方案中有多个故障排除步骤。若在颈外动脉分叉附近进行切口，需在靠近分叉处仔细结扎颈外动脉，以防止出血。切割过程中无法看到颈外动脉，因此应以丝线缝合的位置作为分叉水平的参考。当丝线缝合的丝线消失时，开始收集切片。如果颈外动脉切口过大导致血管破裂，应确保颈总动脉和颈内动脉的血流被有效阻断，并尝试用镊子寻找血管开口。在引入导丝并进行内膜剥离后，应在靠近分叉处结扎血管。切割过程中，当缝合丝线开始消失时，开始收集组织。若在使用导丝进行内膜剥离时发生动脉破裂，需在显微镜下检查导丝是否已妥善抛光。
尽管导丝损伤模型与临床情况相似，但由于缺乏能够进行小型动物手术的 trained personnel，许多研究团队仍专注于小鼠的天然动脉粥样硬化模型，或选择在大鼠或兔子中采用侵入性动脉粥样硬化诱导方法，例如球囊血管成形术。尽管使用兔子/大鼠具有某些优势，e.g. 无需微型化设备，但在研究与新生内膜增生及支架内血栓形成相关的分子机制时，大鼠模型和兔子模型均无法提供多种不同的基因敲除品系。
目前用于研究小鼠支架内再狭窄的模型操作困难，需要高超的手术技巧，并且存在出血或瘫痪等并发症的高风险。例如，通过股动脉对胸主动脉进行机械性损伤或支架植入，常伴随较高的死亡率（35%），原因主要是后肢瘫痪或出血13-15。我们还曾描述过小鼠颈动脉支架植入的方法16。该操作过程类似，但组织处理分析较为复杂，并非所有实验室都能开展16。颈动脉不仅在手术操作上易于接触，也适用于现有的成像技术，如超声成像。在小鼠颈动脉中，还可使用电学设备诱导血管损伤17。该方法操作简便，且具有高度可重复性。然而，该方法会对血管所有层次造成损伤，与机械性损伤并不完全相同。球囊扩张技术具有一些优势，例如可根据血管直径进行调节，更贴近临床实践，并对病理结果产生显著影响。尽管已有适用于小鼠的球囊装置，但其价格昂贵，因此尚未广泛应用。目前，导丝损伤法是公认的标准方法，可有效模拟支架内狭窄。
去内膜手术是在具有动脉粥样硬化背景的正常动脉壁上进行的。因此，与临床情况相比，新生内膜的形成程度较轻。大量的临床前模型表明，目前尚无任何一种模型能够满足揭示人类病理生理过程中全部细胞和分子机制所需的所有标准（见表2）。
完成导丝损伤手术后，可进行其他生物学和分子分析，以鉴定细胞、蛋白质、mRNA、微小RNA（microRNA）、基因或其他生物标志物，这些标志物可作为治疗靶点，用于开发针对动脉粥样硬化、特别是血管损伤后新生内膜形成的新型治疗策略。如果有条件，可利用高频超声或其他高分辨率成像技术监测斑块的生长情况。此外，掌握该技术后，操作者可将其方案改进并应用于其他侵入性动脉粥样硬化诱导模型，例如套管放置、部分结扎，甚至支架植入。
披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本研究得到了亚琛工业大学医学院亚琛临床研究跨学科中心（IZKF Aachen）（资助E.A.L.的青年研究组）的支持。我们还感谢Roya Soltan女士在免疫组织化学染色方面的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 体视显微镜 | Olympus | SZ/X9 | - |
| 镊子 | FST, Germany | 91197-00 | 标准尖端，弯曲，0.17 mm |
| 止血钳 | FST, Germany | 13007-12 | 弯曲 |
| 剪刀 | FST, Germany | 91460-11 | 直型 |
| Vannas 剪 | Aesculap, Germany | OC 498 R | - |
| 牵开器 | FST, Germany | 18200-10 | 2.5 mm 宽 |
| 牵开器 | FST, Germany | 18200-11 | 5 mm 宽 |
| 氯胺酮 10% | CEVA, Germany | - | - |
| 赛拉嗪 2% | Medistar, Germany | - | - |
| Bepanthene 眼鼻霜 | Bayer, Germany | - | - |
| 硅胶管 | IFK Isofluor, Germany | 定制 产品 | 直径 500 µm |
| 切片厚度 100 µm | |||
| 聚四氟乙烯导管 | |||
| PROLENE 缝线 6/0 | ETHICON | 8707H | 聚丙烯单丝缝线，不可吸收，CC-1 针，13 mm，3/8 圆弧 |
| 7/0 丝线 | Seraflex | IC 1005171Z | - |
| Michel 缝合夹 | FST, Germany | 12040-01 | - |
| 缝合夹施加钳 | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”导管用金属丝 | Abbot | 1000462H | 使用硬端 10 cm 段，并对两端进行齐平处理 |
| 小鼠 | Charles River | 载脂蛋白 E -/- 小鼠，C57/Bl6 背景 | - |
参考文献
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