体外记录小鼠空肠和结肠节段肠系膜传入神经活动

摘要

肠系膜传入神经将来自胃肠道的信息传递至大脑，涉及正常的稳态以及病理生理状态。通过将带有附着传入神经的离体肠段固定于器官浴槽中，分离神经并记录基础状态及刺激条件下的神经放电活动，可评估胃肠道传入神经的活性。

摘要

传入神经不仅传递有关正常生理功能的信息，还向中枢神经系统传递来自外周的各种器官系统的稳态失衡及病理生理过程的信号。因此，肠系膜传入神经活动增强或“敏化”在内脏高敏感性和腹痛综合征的病理生理机制中被认为具有重要作用。

肠系膜传入神经活动可被测量 体外 在固定于特制器官浴槽中的离体肠段中，分离出内脏神经，使研究人员能够直接评估邻近胃肠道节段的神经活动。可在标准化条件下记录基础状态下的神经活动，也可在肠段扩张期间或经腔内或浆膜侧给予药理学化合物后进行记录。该技术使研究者能够便捷地研究作用于外周神经系统的药物在对照样本中的效应；此外，还可提供关于疾病状态下神经元活动如何改变的重要信息。然而需要注意的是，传入神经元放电活动的测量仅构成复杂神经信号级联过程中的一个中继环节，研究者应谨记不可忽视其他层面的神经元活动。例如， 背根神经节、脊髓或中枢神经系统，以全面阐明健康与疾病状态下的复杂神经元生理学机制。

常用的应用包括研究给予脂多糖后神经元活动的变化，以及在肠易激综合征动物模型中研究传入神经的活动。在更具转化意义的研究中，可将分离的小鼠肠段暴露于肠易激综合征患者的结肠上清液中。此外，最近研究表明，该技术的一种改良方法已可应用于人类结肠组织标本。

引言

感觉信号传导与疼痛感知是一个复杂的过程，源于传入神经、脊髓神经元、上行与下行促进及抑制通路以及多个不同脑区之间 intricate 的相互作用。因此，在疾病状态下，这些层次中一个或多个环节的变化可能导致感觉信号传导异常和内脏疼痛。为了研究感觉信号传导的各个方面，已开发出多种技术，范围从单细胞实验（例如， 神经元钙成像）到整体动物模型（例如， 行为反应（如内脏运动反应）。本文所述技术可使研究人员特异性地评估传入神经活动 体外 从小鼠或大鼠分离的小肠或结肠节段记录内脏传入神经放电。简言之，将一段分离的胃肠道组织（通常为空肠或结肠）置于特制的记录 chamber 中，并以生理 Krebs 溶液灌流。游离腹腔神经丛并将其连接至电极，以记录腹腔或盆腔传入神经的传入性神经放电活动。可记录基础状态下的神经放电，也可在腔内压力逐步升高和/或应用药物化合物的条件下记录放电变化；药物可通过直接加入记录 chamber（浆膜侧）或经腔内灌流液（黏膜侧）施加，以评估其对传入神经放电的影响。 关键词：传入神经放电，胃肠道，空肠，结肠，Krebs 溶液，腹腔神经，盆腔传入神经，腔内压力，药物干预，浆膜侧，黏膜侧 ^1-6值得注意的是，内脏神经除了感觉传入纤维外，还包含传出纤维和内脏外传入纤维。其中一个主要优势是 离体 内脏神经记录的优势在于，研究人员可以在不受中枢神经系统调节或输入影响的情况下量化神经活动，从而能够研究局部施用化合物对神经活动的直接作用。此外，与使用....

方案

以下所述的所有动物实验均经安特卫普大学医学伦理与实验动物使用委员会批准（文件编号 2012-42）。

1. 空肠和结肠传入神经的组织制备

1. 空肠传入神经的制备
   1. 对实验前已获当地伦理委员会批准的青春期或成年啮齿类动物实施安乐死例如，终末镇静后进行心脏穿刺、颈椎脱位， 等等。).
      注意：我们采用颈椎脱位法处死动物，因此后续实验无需额外麻醉或术后护理，组织可直接进行后续处理 体外.
      注意：年龄已被证明会减弱肠系膜传入机械感受功能 ³⁰因此，我们建议研究人员在单个实验过程中严格遵循特定的年龄组。
   2. 将处死的实验动物置于仰卧位，使用手术刀沿腹壁正中线切开皮肤和腹肌层，切口从剑突延伸至耻骨联合。
   3. 用冰冷的Krebs溶液灌洗腹腔，以防止腹腔内组织干燥（Krebs溶液成分：120.03 mM NaCl，6.22 mM KCl，1.57 mM NaHCO₃）₂PO₄，15.43 mM NaHCO₃₃，1.21 mM MgSO₄₄，11.52 mM D-葡萄糖和1.52 mM CaCl₂).
   4. 使用锋利的剪刀迅速切除整个空肠，从十二指肠空肠曲远端起始处开始，切除约20 cm的小肠段，....

结果

在9只八周龄雄性OF-1小鼠中，测量了空肠传入神经在基础状态及梯度扩张刺激下的神经活动。动物以每笼6只为一组，在标准条件下饲养（温度20 - 22 °C，湿度40 - 50%，12小时光照-黑暗循环），可自由饮用自来水并摄食常规饲料。在管腔内压力为0 mmHg的基础状态下，小鼠空肠节段表现出不规则的自发性传入神经放电（平均自发活动为11.47 ± 3.31 次/秒）。

在进行梯度扩张至60 mmHg时，空肠传入神经活动增加。通常情况下，随着管腔内压力升高，传入神经活动的增加表现为双相反应（图5），即在管腔内压力达到20 mmHg之前，放电活动迅速增加，这主要归因于低阈值纤维放电频率的升高；随后进入平台期，之后从40 mmHg开始出现第二次放电活动增加，代表主要由高阈值纤维被激活所致。

讨论

本文所述方案介绍了一种可重复的实验室技术，用于研究啮齿类动物肠系膜传入神经活动，该方法已被本课题组及其他研究团队广泛应用^{3,4,7,8,12,20,21,31}。方案中的关键步骤包括组织的快速分离、将神经束吸入吸电极中，以及通过将周围脂肪组织吸入玻璃毛细管来实现毛细管与器官浴之间的有效“密封”。玻璃毛细管的开口直径应精确确定：开口过小会增加神经束吸入电极的难度，而开口过大则会影响毛细管与脂肪组织之间的“密封”效果，导致背景噪声增加，从而干扰信号分析（信噪比较低）。为了实现可靠的单单位分类，应将内脏大神经传入纤维分置于不同的神经束中，以减少记录中的单位数量。通常建议每次记录中最多包含4至5个单位。因此，研究人员应根据所关注的神经纤维类型及所使用的实验动物，调整毛细管的开口大小。

另一个关键点是实验装置必须具备充分的接地。为了最大限度地减少干扰神经元活动分析的电场，吸电极和记录室应充分接地，并用法拉第笼屏蔽；而所有其他设备，包括记录仪器、注射泵等，均应安装在屏蔽笼外。

通过在空肠或结肠附近记录传入神经活动，可以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠 (NaCl)	VWR Chemicals	27,810,295	复合克雷布斯溶液
氯化钾 (KCl)	Acros organics	196770010	复合克雷布斯溶液
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)	VWR Chemicals	1,063,461,000	复合克雷布斯溶液
碳酸氢钠 (NaHCO3)	Merck	1,063,291,000	复合克雷布斯溶液
硫酸镁 (MgSO4)	Merck	1,058,861,000	复合克雷布斯溶液
氯化钙 (CaCl2)	Merck	23,811,000	复合克雷布斯溶液
D-葡萄糖	VWR Chemicals	1011175P	复合克雷布斯溶液
蒸馏水			复合克雷布斯溶液
PVC管	Scientific Laboratory Supplies		肠段应固定在PVC管上
硅胶管	Scientific Laboratory Supplies		其余管路建议使用硅胶材质，便于清除管内碎屑
丝线	Pearsall Limited	10B15S220	将肠段固定于PVC管上
注射泵	Harvard Apparatus	55-2222	克雷布斯液腔内灌注
双目显微镜——目镜含10倍放大功能	Zeiss STEMI 2000		传入神经解剖过程中的最佳可视化
恒温毯控制单元	Harvard Apparatus	507214	器官浴槽加热
定制器官浴槽，底部覆盖Sylgard材料
Spike2软件			数据记录与分析
昆虫针，500支，不锈钢，直径0.2 mm	Austerlitz昆虫针 minutiens		传入神经解剖
杜蒙特#5镊子，不锈钢，11 cm	World Precision Instrument	500341	传入神经解剖
弹簧剪，14 cm	World Precision Instrument	15905	传入神经解剖
DB digitimer	NL 108T2/10		压力传感器
显微操作器	Narishige	M-3333	吸电极的三维操控
显微操作器	X-4旋转支架		吸电极的三维操控
显微操作器	GJ-8磁性支架		吸电极的三维操控
光源	Euromex Microscopes Holland EK-1		传入神经解剖过程中的最佳可视化
CED 1401记录装置			传入神经活动记录
Humbug 50/60 Hz噪声消除器	Quest Scientific Instruments		消除背景噪声
输注泵	Gibson Minipuls 2		对固定肠段的器官浴槽进行灌注
半电池微电极夹持器，1.5 mm	World Precision Instrument	MEH2SW	用于分离传入神经纤维的吸电极
硼硅酸盐玻璃毛细管，300支；外径/内径 1.5/0.84	World Precision Instrument	1B150-4	用于分离传入神经的毛细管