从血液中分离、分化和定量人抗体分泌型B细胞：ELISpot作为体液免疫的功能性检测方法

摘要

人外周血常用于体液免疫应答的评估。本文描述了从人外周血中分离B细胞、在体外培养中将人B细胞分化为抗体（Ab）分泌细胞（ASCs），以及通过ELISpot实验定量总IgM和IgG抗体分泌细胞的方法。

摘要

体液免疫的特征是产生功能性抗体分泌细胞（ASCs），这些细胞合成并分泌针对特定抗原（Ag）（如病原体）的抗体（Abs），用于宿主防御。为了定量评估个体体液免疫应答的功能状态，通常将血清抗体和循环中的ASCs作为功能性读数进行检测。在人类中，外周血是最方便且易于获取的样本，可用于测定由宿主B细胞引发的体液免疫应答。不同的B细胞亚群，包括ASCs，可通过使用谱系特异性抗体偶联微珠进行分选，或通过流式细胞术进行细胞分选，直接从外周血中分离获得。此外，纯化的初始B细胞和记忆B细胞可在体外培养中被激活并分化为ASCs。ASCs在抗体分泌中的功能活性可通过ELISpot进行定量，该方法结合了酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹技术，能够在单细胞水平上对单个ASCs进行计数。在实际应用中，由于ELISpot能够方便地处理大量血液样本，其在评估疫苗效力方面的应用日益广泛。从人外周血中分离B细胞的方法，以及B细胞向ASCs分化的方案 体外，本文将描述采用ELISpot法对总IgM和IgG抗体分泌细胞（ASCs）进行定量的方法。

引言

B细胞在体液免疫的发育过程中发挥核心作用。它们最初在骨髓中发育，并以初始B细胞的形式进入血液循环，进而迁移至脾脏、淋巴结和扁桃体等淋巴组织，进行进一步发育。当遇到抗原（Ag）后，部分初始B细胞迁移至淋巴滤泡，在生发中心分化为记忆B细胞以及浆母细胞（PBs）/浆细胞（PCs）。大多数PBs/PCs进入血液循环，而少数最终定居于骨髓，并进一步终末分化为长寿浆细胞。¹循环中的B细胞具有异质性，在稳态下，外周血中浆母细胞/浆细胞（PBs/PCs）较为罕见²由于存在谱系特异性表面标志物，流式细胞术已成为外周血中B细胞亚群鉴定与表征的常用方法。流式细胞术的进一步应用是结合细胞分选功能，可实现对特定B细胞亚群的高纯度分离与富集。根据不同发育阶段特异性表面受体的表达情况，人类外周血B细胞通常被分为三个主要亚群：初始B细胞（CD19⁺CD27^-CD38^-)，记忆B细胞（CD19⁺CD27⁺CD38^-)，以及浆母细胞/浆细胞（CD19⁺CD27⁺CD38⁺)^3-4 (图1）。初始B细胞天生未接触过抗原（Ags）。然而，它们可分化为IgM⁺CD27⁺ 记忆B细胞。尽管初始B细胞在表达B细胞抗原受体（BCR）相关分子方....

方案

必须在知情同意的前提下从健康供者获取人外周血，且血液样本的使用须符合各机构审查委员会批准的指导原则。本研究中使用人血样本进行流式细胞术结果（图1）和ELISpot实验（图3）演示的方案，已获得中国台湾大学医院机构审查委员会的批准（方案编号：201307019RINB）。

1. 人外周血B细胞的分离与纯化

1. 使用含K₂EDTA（1.5至2.0 mg/mL血液）的15 mL离心管，从肘前窝的肘正中静脉抽取约10 mL血液，并立即反复倒置离心管数次，以防止凝血。
2. 向装有新鲜血液样本的离心管中加入35 mL经高压灭菌（121 °C，15分钟）的红细胞（RBC）裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃和1 mM EDTA；pH 7.4）（体积比≥3:1），并在室温（RT）孵育不超过5分钟。
   注意：当可见光线透过管壁时，表明红细胞裂解已完成。
3. 在室温下以600 × g离心5分钟。确保沉淀呈白色。
4. 用10 mL高压灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS，137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄和1.47 mM KH₂PO₄；pH 7.4）重悬沉淀，然后按步骤1.3进行离心。

结果

PBMCs 经去除红细胞和贴壁细胞（步骤 1.2 至 1.7）。取一份样品（2 x 10⁶) 的细胞进行流式细胞术分析，以显示外周血中初始B细胞、记忆B细胞以及浆母细胞/浆细胞的群体分布情况图1）。在此供体的PBMC中，约有10%的淋巴细胞为CD19⁺ B细胞。在B细胞区室中，CD19阳性细胞的比例⁺CD27^- 初始B细胞的比例约为50%。另一方面，约50%的CD19⁺ B 细胞为 CD27⁺ 记忆B细胞^{7, 25-26}值得注意的是，CD27⁺ 记忆B细胞可通过加入IgD进一步分离⁴循环浆细胞的表型可通过其表面CD20表达水平较低或缺失（CD19）来更准确地界定⁺CD27^+/hiCD38⁺CD20^lo/-)^2,30-31

讨论

人外周血B细胞的分离与纯化

通常情况下，红细胞可被裂解缓冲液有效裂解并清除（步骤1.2）。PBMC与红细胞裂解缓冲液的孵育时间不应超过5分钟，因为氯化铵可能影响细胞活力。 alternatively，可通过以下方案同时去除红细胞和血小板。

将新鲜全血与酸-柠檬酸盐-葡萄糖（ACD）缓冲液（39 mM 柠檬酸、75 mM 柠檬酸钠和 135 mM 葡萄糖；pH 7.4）按 9:1 的体积比（血液:缓冲液）混合。在室温下以 250 × g 离心 10 分钟。注意观察分层现象，以判断分离效果。吸除并弃去上层液体，该层含有血小板和富血小板血浆（呈黄色）。小心移取中间薄层界面处的物质，即外周血单个核细胞（i.e.，白膜层）。避免吸取底层的红细胞（深红色）。向 PBMCs 中加入裂解缓冲液以去除残留的红细胞，随后进行步骤 1.2 至 1.19。

分离B细胞可采用两种方法：阳性选择和阴性选择²¹负选择法（步骤1.1至1.19）用于获取未受干扰且功能完整.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 mL 离心管
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	无内毒素
0.5% 台盼蓝溶液	Biological Industries	03-102-1B
IMag 人 B 淋巴细胞富集试剂盒	BD Biosciences	558007
生物素标记 CD27 单克隆抗体	Biolegend	302804	克隆号 O323
链霉亲和素磁性微珠	BD Biosciences	9000810
15 mL Falcon 管	BD Falcon	352196
蓝色尼龙网细胞筛，40 μm	BD Falcon	352340
抗人 CD19-APC	Biolegend	302212	克隆号 HIB19
抗人 CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	克隆号 O323
抗人 CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	克隆号 HIT2
抗人 CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	克隆号 HIT2
抗人 CD45-FITC	Biolegend	304006	克隆号 HI30
抗人 CD45-FITC	BD Biosciences	555482	克隆号 HI30
抗小鼠/大鼠/人 CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	克隆号 LG.3A10
抗人 CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	克隆号 L128
抗人 CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	克隆号 LT19
抗人 CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	克隆号 LT19
抗人 CD20-FITC	BD Biosciences	555622	克隆号 2H7
生物素标记抗人 CD27 抗体	Biolegend	302804	克隆号 O323
生物素标记抗人 CD27 抗体	eBioscience	13-0279-80	克隆号 O323
7-氨基放线菌素 D（7-AAD）	BD Biosciences	559925
CpG（ODN 2006）	InvivoGen	tlrl-2006	B 型 CpG
重组人 IL-2	PeproTech	200-02
重组人 IL-10	PeproTech	200-10
重组人 IL-21	PeproTech	200-21
重组人 sCD40L	PeproTech	310-02
S. aureus Cowan（SAC）的蛋白 A	Sigma-Aldrich	82526
商陆有丝分裂原（PWM）	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen 滤膜板，0.45 µm 孔径	Merck Millipore	MSIPS4510	无菌、透明 96 孔滤膜板，含疏水性 PVDF 膜
BCIP/NBT 溶液	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT 单试剂，碱性磷酸酶底物	Merck Millipore	ES006
人 IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
人 IgG Fc 片段	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
山羊抗人 Ig（IgG + IgM + IgA）的 F(ab')2 片段	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
山羊抗人 IgG-碱性磷酸酶，特异性识别 Fcγ 片段	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
山羊抗人 IgM-碱性磷酸酶，特异性识别 Fcµ 片段	Jackson ImmunoResearch	109-055-043
山羊抗人 IgG-辣根过氧化物酶，特异性识别 Fcγ 片段	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
山羊抗人 IgM-辣根过氧化物酶，特异性识别 Fcµ 片段	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC 底物试剂盒	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot 分析仪	C.T.L.