该果蝇成虫盘瘤模型:基因的表达与肿瘤侵袭性的可视化和定量遗传马赛克

摘要

该协议将演示如何生成的果蝇眼睛/触角成虫盘（EAD）荧光标记，基因定义克隆肿瘤。它介绍了如何从第三龄幼虫，以及如何处理它们的可视化和量化基因表达的变化和肿瘤的侵袭性解剖EAD和大脑。

摘要

黑腹果蝇已成为一种强大的实验系统，用于在整个生物体的背景下对肿瘤发展和进展进行功能和机制研究。生成遗传嵌叶的复杂技术有助于诱导被正常组织包围的视觉标记、遗传定义的克隆。可以通过不同的分子、细胞和组学方法分析克隆。本研究描述了如何使用带有可抑制细胞标志物 （MARCM） 技术的马赛克分析在果蝇幼虫的眼睛/触角假想盘 （EAD） 中生成不同恶性的荧光标记克隆肿瘤。它描述了如何从幼虫中恢复嵌合体 EAD 和大脑的程序，以及如何处理它们以同时对荧光转基因报告基因进行成像和抗体染色。为了促进马赛克组织的分子表征，我们描述了一种从 EAD 中分离总 RNA 的方案。解剖程序适用于从任何幼虫阶段恢复 EAD 和大脑。假想盘的固定和染色方案适用于许多识别果蝇蛋白的转基因报告基因和抗体。RNA 分离方案可应用于各种幼虫器官、整个幼虫和成蝇。总 RNA 可用于使用候选或全基因组方法分析基因表达变化。最后，我们详细介绍了一种量化克隆性肿瘤侵袭性的方法。虽然这种方法的用途有限，但其基本概念广泛适用于必须避免认知偏差的其他定量研究。

引言

癌代表了最遗传异质组疾病，其发病率和死亡率的显着提高，特别是在老年人全世界之一。癌症从逃脱固有的抑癌机制，并把失控的肿瘤启动细胞克隆起源。遗传病变共同促进生长，增殖和迁移，同时抑制死亡和分化的逐渐积累转化的初始良性增生为高度恶性，转移性和致命的肿瘤。它已成为明显的是，除了遗传改变，肿瘤进展需要在肿瘤和多种细胞类型（ 例如 ，成纤维细胞，免疫细胞和内皮细胞）在其微环境之间的周围的基质和串扰的改变。理解的分子原理恶变底层包括肿瘤 - 基质的相互作用是非常重要的发展防止措施灰和早期筛查策略，以及新的和有效的治疗方法，以打击癌症转移和耐药性。

果蝇果蝇已成为癌症研究^1-4由于其快速产生时间一个有吸引力的系统，信令苍蝇和人类的促进几乎任何基因操纵在先进遗传工具有限遗传冗余和财富之间节点的显着的保护一个暂时和空间限制的方式。不同的恶性肿瘤的遗传背景明确肿瘤可在果蝇通过使用MARCM技术⁵在另外的野生型组织中祖细胞的一个子集引入GAIN-和丧失功能的突变再现地工程化。该MARCM工具结合FLP / FRT（FLP重组/ FLP识别目标）介导的有丝分裂重组⁶ FLP出⁷和Gal4的/ UAS（上游激活序列^）8靶基因表达系统^9。与任何基于UAS - 转基因的这种方法的表达，包括原癌基因或荧光蛋白的cDNA或倒置DNA重复对的dsRNA诱导的基因沉默，将被限制到细胞的克隆已经失去一个特定基因座和一个Gal4的阻遏由于重组（ 图1A）。标有绿色荧光（GFP）或红色荧光蛋白克隆补丁（ 例如，RFP，红色荧光蛋白，mCherry）可以很容易地在整个发展，孤立和分析跟踪。重要的是，它们的行为可以直接比较到相邻的野生型组织。因此，问题相关的所述细胞的遗传病变的自主性和非自主效应可以方便地研究。类似于哺乳动物，只有克隆，其中多个致癌病变被组合成为在果蝇恶性和概括哺乳动物癌细胞的关键特点。他们overproliferate，逃避凋亡，诱发炎症，成仙INVA西伯，最终杀死宿主^10-17。

在这里，我们描述了一个协议，使用MARCM技术产生果蝇幼虫的眼睛/触角和脑组织基因定义克隆肿瘤。该方法依赖于一个MARCM仪股票其表达无眼增强剂^{（eyFLP）18,19}的控制下的酵母FLP重组酶。以这种方式，在EAD的两个peripodial和柱状上皮和脑的整个胚胎和幼虫期（ 图1A，B和参考^20）的神经上皮产生GFP标记的克隆。克隆可以轻松跟随直到成年的EAD发展到成人的眼睛，天线和头壳而神经上皮产生了产生差异化的视叶神经元的神经细胞。

为了方便马赛克组织，我们去的大量分子，功能和表型特征隶从三龄幼虫EAD和大脑的解剖协议，并概述了如何处理它们三个不同的应用程序:（一）检测转基因荧光记者和染色，（二）肿瘤侵袭和（三）分析量化基因表达的变化使用定量实时PCR（QRT-PCR）或高通量的mRNA测序（的mRNA-SEQ）（ 图1C）。

免疫染色协议可以用于可视化的任何感兴趣的蛋白质的特异性抗体。转基因荧光转录记者提供对特定信号传导途径的活性方便和精确的时空信息。细胞谱系特异性记者，另一方面，反映镶嵌组织内和不同的基因型的肿瘤中的细胞群体的定性和定量的变化。的入侵行为有利于量化基因型与肿瘤恶性的比较秒。最后，描述用于RNA分离镶嵌EAD的收集和处理的协议，适用于小型和大型的下游应用如逆转录随后分别定量RT-PCR和基因组范围内的mRNA-SEQ。从这些分析得到的定性和定量的数据提供新的见解克隆肿瘤的社会行为。此外，它们产生用于对各个基因，遗传网络和在不同阶段肿瘤微环境和肿瘤发生的各方面的作用，功能研究了坚实的基础。

方案

注:该作品利用eyFLP1;法> Y ^+> Gal4的，UAS-GFP; FRT82B，浴缸，GAL80 MARCM 82B绿线测试仪^11。穿越MARCM 82B绿测试处女的菌株如W的男性; UAS-A; UAS-B ^{的RNAi，FRT82BÇMUT}基因型将产生在有丝分裂重组将^第三同源染色体的右臂之间发生的后代。以这种方式，克隆对于位于远离FRT82B站点C基因纯合的突变体将在EAD和脑神经上皮内产生。这些克隆将表达绿色荧光蛋白，转基因的和双链RNA为基因B（ 图1A）。在X，2L，2R，3L和3R重组各种eyFLP-MARCM测试线路已建立并是飞社区内可用。

1.飞处理，十字架，和分期

1. 扩大在室温下适当MARCM测试仪的库存通过填充多个波ttles同时。翻转大人到新鲜瓶每2-3天，以便有足够的处女可以收集后续十字架。
   注:当收集处女，避免长时间暴露于CO _2，因为这损害了女性的生育能力。
2. 根据实验的规模，成立了使用至少10 MARCM仪处女和4的男性（ 例如 ，荧光记者和免疫成像）或与至少30处女和10名男性（ 例如 ，瓶小瓶飞十字架RNA分离和侵袭的定量）。
3. 经过漫长的一天16小时/ 8小时的光暗周期下筹集到25℃后代。翻转父母到新的小瓶/瓶，每24小时，以方便幼虫可重复的分期，以防止过度拥挤。
   注:在开始产蛋（AEL）后的第6天，晚三龄幼虫控制摄食停止，开始徘徊，进入pupariation。与此相反，幼虫-蛹过渡的开始可以被去奠定或不存在于幼虫EAD轴承增生或恶性克隆肿瘤。

2.收集三龄幼虫

1. 对于免疫染色，收集有关20晚三龄幼虫（徘徊在墙上的那些可比的车身尺寸从食物）。使用镊子轻轻地从小瓶或瓶子挑幼虫，并将其转移到充满磷酸盐缓冲盐水（PBS）的胚胎的玻璃盘。
   1. 对于RNA分离和侵袭的定量，收集至少80晚三龄幼虫（徘徊在墙上的那些可比的车身尺寸从食物）。用喷瓶喷到PBS到含有幼虫飞瓶，直到表面被覆盖。
   2. 软化食品的顶层用刮刀和倾含有幼虫食物醪到培养皿。使用镊子，轻轻一挑幼虫，并将它们转移到装有PBS胚胎玻璃盘。
2. 幼虫洗净用PBS UNT金正日剩余的全部食品被删除。检查8荧光体视显微镜下的幼虫16X放大放弃所有的"豹仔"携带整个幼虫体内随机GFP阳性斑点（ 图2A，2B和见讨论部分 ）。
   注:对于RNA分离包括在70％乙醇1分钟倒数第二个洗涤步骤。
3. 将含有幼虫选择在PBS冰上直到解剖菜。 30分钟内处理的幼虫，避免感冒和饥饿的不利影响。

3.幼虫解剖

1. 解剖立体显微镜下的EAD，使用一对镊子轻轻按压在玻璃皿底幼虫的中间部分。随着第二个镊子，抢幼虫口钩，和他们拉从身体（ 图2C）的距离。
   注:该拉力通常足以打破连接EAD PAI视神经秆R将脑叶。如果脑或其部分保持附着到EAD和它们的存在是不希望用于进一步的应用，削减光学秸秆与两对镊子的帮助。对于浸润性肿瘤（ 如 RAS ^V12 scrib ^1）EAD和脑叶之间的连接变得越来越多地与时间由长满并迁移克隆细胞遮蔽。
   1. 以制备具有完整腹神经索（VNC）（ 图2D）的EAD /脑复杂，使用镊子切割幼虫在主体的中间。丢弃后半部。
   2. 保持一个镊子的尖端之间的幼虫体的前半部分，通过在口钩与第2钳子的前端推压，并通过与所述第一钳对滚过它角质层翻转幼虫内向外。
2. 使用镊子小心地取出所有多余的组织（如唾液腺，脂肪体，和内脏），同时使EAD对或连接口钩的EAD /大脑复杂。解开上覆角质层口钩。通过切断延伸到身体的肌肉和表皮（ 图1B，2C，2D）的轴突突起释放VNC。
   注:口钩允许用钳子组织的安全操作和清洗过程中促进组织的更有效的下沉，易于识别。在PBS保持不固定的，当解剖EAD变化形态比较快的。限制清扫时间以20-30分钟。
3. 为了转移组织，涂层吹打其余主体上的P20的微量移液器尖端胴体几次上下。要传输更大的EAD /脑复合物，用剪刀剪的P20枪头。
   注:涂布程序是至关重要的，以防止传输过程中粘附并解剖组织的损失。一个微管P20使用最小PBS转移到固定液，限制不必要的稀释。
   1. 对于免疫染色，转移解剖EAD到0.5毫升管装有400微升4％多聚甲醛（PFA）固定液。应用1.5毫升管1毫升PFA较大EAD /脑复合意味着侵袭的得分。
      注意:PFA有剧毒。戴防护手套和防护服。避免皮肤，眼睛或粘膜接触。
   2. 对于RNA分离转移解剖EAD到充满冷PBS一个新的玻璃盘。使用镊子从环和淋巴结清扫EAD，以尽量减少样品污染。
   3. 通过切割使用镊子（ 图2E）的天线的光盘和口钩之间的连接分离从口挂钩EAD。为了避免RNA降解和基因表达的文物，限制了清扫时间为30分钟。继续执行步骤7。
      注:一个有经验的研究者可以在需要的幼虫收集和洗涤30分钟时间除外解剖约60幼虫。总RNA的产量取决于EAD大小基因型和developmenta之间变化升阶段。从晚第三龄幼虫80-100控制EAD对解剖应该产生5-8微克总RNA。

4.固定，免疫染色，与安装

1. 固定在PFA固定剂的样品25分钟，同时在室温下章动。固定时间可以延长至60分钟，而不会改变组织形态和蛋白质的抗原性。
2. （含有0.1％的Triton X-100的PBS）三次除去用PBST固定液和洗涤样品用于使用章动器10分钟。使用PBST的足够的体积为每个清洗步骤（400微升/ 0.5毫升管）。
   注:固定EAD /脑复合意味着侵袭的得分不需要染色。 GFP信号保持固定后清晰可见。继续执行步骤4.4的最后清扫。
   1. 对于免疫染色，在200μl封闭液（PBST用0.3％BSA）中进行20分钟，温和搅拌在室温下的块组织。
      1. 与拘谨孵育进制抗体在4℃下稀释在100μl封闭溶液过夜，同时轻轻地摇动。请参阅第一抗体数据手册或发表的文献为推荐的抗体稀释。
         注:初级抗体的稀释可能需要进行优化。
      2. 以下在PBST 5 10分钟洗涤后，用荧光二级抗体染色的组织在阻断溶液稀释，同时轻轻搅拌2小时，在室温下或在4℃下在黑暗中振摇过夜。
      3. 洗样品三次10分钟在PBST中。
3. 用500微升的DAPI染色解决方案替换PBST。标记F-肌动蛋白，添加鬼笔环肽缀合至荧光染料DAPI染色溶液。 15分钟垂头在黑暗中后，10分钟用PBST洗涤组织一次。
   注:F-肌动蛋白标记可以独立DAPI染色的条件下进行。
4. 对于最终夹层步骤中，使用1毫升圆周率转移组织放回PBS的填充的玻璃皿佩特。使用两对镊子夹断口钩。
   1. 分离，将通过切割视柄作为杂草丛生EAD可能妨碍分析用于侵袭性的量化从EAD的大脑。
5. 将安装介质上的目标幻灯片的下降（15微升为22毫米×22毫米盖玻片）。用钳子提示的帮助下，介质分配到的薄层。 EAD转移，大脑或EAD /脑复合物与一个P20微量的安装介质。
6. 使用镊子尖端或钨​​棒分发组织拉直VNC上的幻灯片。
7. 以避免形成而安装的气泡，第一触摸盖玻片到安装介质的一个边缘，然后慢慢地降低到与钳的帮助下安装培养基。使用小片滤纸或组织的擦拭吸收周围盖玻片边缘多余的安装介质。
   注:DABCO /聚乙烯醇（PVA）4-88安装介质变硬在一个小时内4℃。幻灯片可存放在4℃下个月。

5.共焦成像

1. 获得使用配有20X，40X和60X的石油目标的共聚焦显微镜单焦部分和堆栈。
2. 防止像素的饱和度。使用相同的图像采集参数包括图像分辨率，激光输入功率，增益，偏移，帧平均，在一个Z系列的步长，并保持所有基因型这些设置以允许不同基因型^21,22之间的像素强度的比较。
   注:EAD /大脑复杂的可视化，产生最大的预测和各自的缝合，相邻的图像。对于最终图像的准备，后期使用图像处理软件面板组件，并调整亮度和对比度。

6.定量肿瘤侵袭的

1. 定义一个评分系统，将表征不同层次的肿瘤invasivenes的Ş考虑入侵的空间格局和GFP阳性细胞扩散到大脑和VNC量。准备评价表的文档（ 图3A）。
2. 安装至少80固定在使用40微升每24毫米×50毫米的盖玻片安装介质的一个滑动每个基因型完好大脑。
   1. 为了让公正打分，问一个中立的一方匿名的幻灯片，让记分程序是公正的。评估由独立两名实验人员匿名幻灯片。公开点票完成后才会基因型。
3. 评估配备了GFP过滤器设置荧光体视显微镜下恶性由安装大脑盲目得分的程度。使用标记标记已被视为已为避免重复计算（ 图3B）的大脑。
4. 计算大脑落入每个每基因型限定侵入类别的百分比。确定统计小号ignificance用卡方检验（ 图3C）。

7. RNA提取，DNA酶处理和质量检查

注意:在下面的步骤中使用的所有试剂（溶液，塑料器具）应无RNase活性。一定要穿戴手套和使用有机溶剂的工作化学罩。

1. 用涂P20枪头转移干净EAD到1.5mL管中。
2. 让组织沉到试管底部，小心地取出PBS中，用100μl的RNA裂解试剂（足够用于多达140 EAD）代替它。
3. 裂解组织涡旋。此时，样品可以是深度冷冻在液氮中，并储存在-80℃或用标准的RNA分离协议直接处理。
   注:从多个夹层轮类似基因型的样品可一旦RNA裂解试剂汇集。
4. 填写样本量0.9毫升RNA裂解试剂。增加±毫升氯仿和vigoro混合样品usly 15-20秒。
5. 以下2至3分钟，在室温下培养，离心样品以10,000 xg离心在4℃下15分钟。
6. 无色转移上含有RNA的水相到一个新的试管，而不会干扰相间。远离相间远，因为它含有蛋白质和基因组DNA。
   注:将回收的体积应是RNA裂解试剂的用于均质化的体积的约60％。
7. 加入0.5ml异丙醇沉淀RNA。涡旋并在室温下孵育样品10分钟。
8. 离心样品以10,000 xg离心在4℃下15分钟。
9. 弃去上清液并用600μl的75％乙醇洗一次RNA沉淀。短涡和离心（在4℃万XG 7分钟）后丢弃所有的乙醇，并让RNA沉淀风干5-10分钟将开管放在一个干净的纸巾擦拭。
   注:RNA颗粒可能是作为一个微小的不透明/白色ST可见熟在管或无形的底部。剩余的乙醇滴可与P10枪头仔细清除。
10. 通过一个枪头涡旋或通过溶液几次溶解在50μlDEPC处理的水的RNA。
11. 以最小化与基因组DNA污染，通过添加50微升含有DNA酶的1微升（2U /微升）和10微升10×DNA酶缓冲液中于DEPC处理过的水的混合物的治疗用DNase总RNA。涡和自旋向下。
12. 在水浴或30至40分钟的加热块在37℃下孵育样品。孵育后，加入100微升DEPC处理过的水到每个样品。
13. 从DNA酶失活酶的酶活性和清洁的RNA，加入200微升酚:以10,000 xg离心在4℃溶液中，涡旋1分钟并离心样品进行7分钟的氯仿:异戊醇（1 25:24）。
14. 仔细含RNA的上层水相转移到新管。添加等体积（200微升）氯仿，混合和从上面重复离心步骤。
15. 小心收集上层相并通过加入1/10体积的3M乙酸钠沉淀RNA，pH值5.2中的100％乙醇DEPC H ₂ O和2.5体积制备。涡旋调匀。
    注意:添加0.5微升糖原（20微克/微升），以沉淀组合有助于以可视化的RNA沉淀。为了尽量减少损失RNA，使用硅化，低结合的1.5 ml离心管中。
16. 在-20℃沉淀RNA为至少1小时。
    注:潜伏期可能在一夜之间完成。样品可在-80℃放置为好。
17. 沉淀的RNA离心以10,000 xg离心在4℃下30分钟。洗净并按照7.9的说明干燥颗粒。
18. 在10-15微升DEPC处理过的水的溶解的RNA。在-80°C储存RNA。
19. 通过在230纳米，260纳米和利用分光光度计测量280nm处的OD确定RNA的数量和纯度。计算RNA合作通过应用该公约ncentration的1 OD在260纳米等于40微克/毫升RNA。
    注意:"纯"RNA的一个_260/280比等于2.0，而一个A _260/230比值应在2.0-2.2的范围内。与A _260/280比率1.7和2.0之间的RNA样品适用于下游应用，如cDNA合成。对于制备的mRNA-SEQ库RNA的质量和数量应使用自动电泳系统进行检查。的28S / 18S比率应大于1.8。

结果

为了证明eyFLP-MARCM技术产生在果蝇 EAD定义基因型的GFP标记的补丁的潜力，三种克隆的诱导:（1）控制只表达GFP的，（2）恶性肿瘤表达小的致癌形式在肿瘤抑制基因乱画的纯合损耗（scrib ^1）的背景G蛋白的Ras（RAS ^V12），和（3）过度增长，但非侵入ras基因^的V12 scrib ¹ JNK ^DN克隆，其中该君N-末端激酶（JNK）是由它的显性负形式（ 图4， 表1基因型）的表达失活。它已经显示，ras基因^V12 scrib ¹克隆的肿瘤的侵袭性要求JNK信号的异常活化及其下游转录因子^{10,12,23,24。}此外，RAS ^V12 scrib ¹ 果蝇幼虫强烈的炎...

讨论

该技术产生在果蝇遗传马赛克是用于分析和操纵基因功能的³³最复杂的工具之一。所述eyFLP-MARCM系统已被证明强大和健壮，因为它允许在视觉上标记，遗传背景明确克隆的诱导以空间受限的方式， 即 ，在组织中，其中无眼增强剂是活性^9,18。当多种遗传病变在相同的细胞结合，这是特别重要的。虽然这些高度异常的修补程序时只限于EAD和脑部神经上皮使幼虫发育，分散在幼虫体内的热休克控制FLP（hsFLP）克隆的情况时，他们可能会导致杀伤力。显著，在飞EAD上皮细胞克隆的诱导激活其中致癌基因结合了肿瘤抑制基因的丧失概括在某些人类癌症的出现和实体上皮肿瘤进展。何wever，该系统也有其局限性，这将简要讨论。鉴于昆虫有一个开放的循环系统，不发生如在人类癌症中观察到的真实转移。因此，转移性传播的复杂的过程，不能如实地在果蝇模型。然而，EAD肿瘤如RAS ^V12 scrib ¹个克隆做，因为他们打破围绕着EAD基底膜并侵入邻近脑^11,12,31显示恶性属性。肿瘤...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Gewürzmühle Brecht， Eggenstein， Germany	00262-0500	苍蝇食物食谱：用 160 克琼脂、360 克酵母、200 克大豆粉、1.6 公斤黄玉米粉、1.2 升麦芽提取物、300 毫升淡玉米糖浆、130 毫升丙酸和 200 毫升 15% 尼帕金制作 20 升苍蝇食物。苍蝇食物应在 1 小时下煮 85 小时 °C.
玉米糖浆	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG， 梅肯海姆， 德国	01939
丙酸	Carl Roth GmbH， 卡尔斯鲁厄， 德国	6026.1
玉米面	ReformKontor GmbH， Zarrentin， 德国	4010155063948
麦芽提取物	CSM Deutschland GmbH， 不来梅， 德国	728985
大豆粉	Stockmeier Food GmbH，德国赫尔福德	1000246441010
Yeast	Werner Ramspeck GmbH， Schwabach， Germany	210099K
4-苯甲酸甲酯/尼帕金	Sigma-Aldrich， Deisenhofen， Germany	H5501	用 70% 乙醇制备 15% 储备溶液
果蝇食品小瓶	Kisker Biotech， Steinfurt， Germany	789008
小瓶塞	K-TK e.K.， Retzstadt， Germany	1002
果蝇食品瓶	Greiner Bio-One， Frickenhausen， Germany	960177
瓶塞	K-TK e.K.， Retzstadt， Germany	1002 S
聚乙烯（乙烯醇） 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich， Deisenhofen， Germany	81381	封固剂配方：将 6 g 聚乙烯醇 4-88 溶于 39 中 ml Millipore H2O、6 ml 1 M Tris （pH 8.5） 和 12.5 ml 甘油。在 50 度下搅拌过夜 >C 并离心 20 最小值为 5,000 rpm。将 DABCO 添加到上清液中，得到 2.5% 的最终浓度。将等分试样储存在 -20 °C.
1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷/ DABCO	Sigma-Aldrich，德国戴森霍芬	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich，德国戴森霍芬	9002-93-1
磷酸盐缓冲盐水/ PBS			137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4 和 1.8 mM KH2PO4， 在Millipore H2O
PBST			0.1% Triton X-100 在PBS
多聚甲醛/ PFA	Sigma-Aldrich，德国	158127	4% PFA固定剂配方：溶解4 在磁力搅拌板上加热至 55 的 80 ml Millipore H2O 中的 g PFA;>C. 滴加 1 M NaOH，直至所有 PFA 颗粒溶解。加入 10 ml 10x PBS，用 1 M HCl 将 pH 值调节至 7.4。混合在 100 µl Triton X-100 并加入 Millipore H2O 至 100 毫升。将等分试样储存在 -20 °C 下。避免反复解冻。（注意：PFA 具有剧毒。在通风橱中准备 PFA 固定剂。佩戴自给式呼吸器、手套和衣服。避免接触皮肤、眼睛或粘膜。
牛血清白蛋白/ BSA	Sigma-Aldrich，Deisenhofen，Germany	A3059	封闭液配方：将 0.3% BSA 溶解在 PBST
荧光标记的鬼笔环肽	Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国，分子探针	A12379、A22283、A22284	鬼笔环肽储备溶液：将粉末 （300 U） 溶解在 1.5 ml 甲醇中。储存在 -20 °C 下。对于染色，在 PBST 中以 1：250（A12379、A22283）和 1：100 （A22284） 稀释。
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二氢氯烷/ DAPI	Carl Roth GmbH，德国卡尔斯鲁厄	6335	DAPI 染色溶液：在 Millipore H2O 中制备 5 mg/ml 的储备液，并将等分试样储存在 4 °C。在 PBST 中以 1：1,000 的比例稀释。
小鼠抗 H2 抗体	Kurucz et al.， 2003		用于在封闭溶液中以 1：500 的比例稀释
Cy5 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG （H+L）Jackson	ImmunoResearch，萨福克，英国	715-175-151	封闭溶液中 1：500
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools，海德堡，德国	11295-10
玻璃胚胎皿 （30 mm）	Thermo Scientific，Schwerte，德国	E90
钨针	Fine Science Tools，德国海德堡	10130-20
镀镍针架	Fine Science Tools，德国海德堡	26018-17
显微镜载玻片	VWR，德国达姆施塔特	631-1553
盖玻片 22 x 22 mm （#1 Menzel-Gläser）	VWR，达姆施塔特，德国	631-1336
盖玻片 24 x 50 mm （0.13-0.16 mm）	Thermo Scientific，德国施韦尔特	1076371
Kimtech Science Precision Wipes	Thermo Scientific，德国施韦特	06-677-70
解剖立体显微镜	奥林巴斯，德国汉堡	SZX7（DF PLAPO 1X-4 日本）
荧光立体显微镜	奥林巴斯，德国汉堡	SZX16（SDF PLAPO 0.8X 日本）配备 DP72 CCD 相机	配备用于激发 GFP 其他蓝色可激发荧光染料的窄蓝色带通滤光片组（激发滤光片 BP460-480 nm，屏障滤光片 BA495-540 nm）和用于 RFP 和其他绿色可激发荧光染料的窄绿色激发和长通屏障滤光片（激发滤光片 BP530-550，屏障滤光片 BA575IF）。软件：Olympus cellSens Standard 1.11。
共聚焦显微镜	奥林巴斯，德国汉堡	FV1000	配备倒置 IX81 显微镜。目标： 20& 次;UPlan S-Apo （NA 0.85）， 40&次;UPlanFL （NA 1.30） 和 60×UPlanApo （NA 1.35）.激光器：紫外半导体激光管 LD405 （50 mW），氩激光器，多线 457/（476）/ 488/515 （40 mW）、黄/绿半导体激光管 LD560 （15 mW） 和红色半导体激光管 635 （20 mW 的 mW 的 S T软件：Fluoview 2.1c 软件
果蝇冷却培养箱	Ewald Innovationstechnik GmbH，德国巴特内恩多夫	Sanyo MIR553
喷瓶	VWR，达姆施塔特，德国	215-8105
BD Clay Adams 章动器混合器	VWR，达姆施塔特，德国	15172-203
ELMI 数字摇床	VWR，达姆施塔特，德国	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA 裂解试剂	VWR，达姆施塔特，德国	2302700	该方案与其他基于 TRIzol 的试剂兼容，例如 >
焦碳酸二乙酯/ DEPC	Sigma-Aldrich， Deisenhofen， Germany	D5758	在米利波尔 H2O 中以 1：1,000 稀释 DEPC，搅拌过夜并高压灭菌。
超纯苯酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1）	ThermoFischer Scientific， Invitrogen， Karlsruhe， Germany	15593-031
Chloroform	Merck， Darmstadt， Germany	102445
TURBO DNase （2 U/µl）	Thermo Scientific，德国 Schwerte	AM2238
Invitrogen UltraPure 糖原	ThermoFischer Scientific，Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄	10-814-010
乙酸钠三水合	VWR，德国达姆施塔特	27652.232 制备	含有 DEPC-H2O 的 3 M 乙酸钠溶液，并将 pH 值调节至 5.2
2-丙醇	默克，德国达姆施塔特
Ethanol	Merck，德国达姆施塔特	100983	用 DEPC-H2O 制备 75% 乙醇稀释液。
UV/Vis 分光光度计 NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific，德国 Schwerte	ND-8000
Eppendorf 微量离心机（冷冻）	Thermo Scientific，Schwerte，德国	5417R
Experion RNA StdSens 分析试剂盒	Bio-Rad Laboratories GmbH，München， 德国	7007103
Experion 自动电泳站	Bio-Rad Laboratories GmbH， München，德国	7007010
SuperScript III 逆转录酶	Thermo Scientific，德国 Schwerte 18080044	Oligo
d（T） 引物	集成 DNA 技术，比利时		Prepare 100 µ在 DEPC-H2O 中储存的 M 储备溶液，储存在 -20 °C
dNTP 混合物	Takara Bio Europe/Clonetech， Saint-Germain-en-Laye， France	4030	储存 25 和微量的等分试样;l 在 -20°C
CFX96 Touch 实时 PCR 检测系统	Bio-Rad Laboratories GmbH， München，德国	1855195
iQ SYBR Green 超混合液	Bio-Rad Laboratories GmbH，München，德国	170-8882
硬壳 PCR 板 96 孔，薄壁	Bio-Rad Laboratories GmbH，München，德国	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH，München， 德国	MSB1001
rp49 正向引物	Integrated DNA Technologies， 比利时鲁汶		5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 反向引物	Integrated DNA Technologies， 比利时鲁汶		5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 正向引物	Integrated DNA Technologies， 比利时鲁汶	5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'