Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

摘要

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。

摘要

Drosophila melanogaster 已成为在完整生物体背景下研究肿瘤发生与进展功能及机制的有力实验体系。复杂的遗传嵌合体技术可诱导产生具有可视标记、遗传定义明确的克隆，其周围被正常组织包围。这些克隆可通过多种分子、细胞及组学方法进行分析。本研究描述了如何利用带有可抑制细胞标记的嵌合体分析技术（MARCM），在 Drosophila 幼虫的眼/触角成虫盘（EAD）中生成具有不同恶性程度的荧光标记克隆性肿瘤。文中详细说明了从幼虫中分离嵌合体EAD和脑组织的操作流程，以及如何对样本进行处理，以同时实现荧光转基因报告基因成像和抗体染色。为便于对嵌合组织进行分子表征，我们提供了一种从EAD中提取总RNA的实验方案。该解剖程序适用于从任何龄期的幼虫中获取EAD和脑组织。针对成虫盘的固定与染色方案可兼容多种识别 Drosophila 蛋白的转基因报告基因和抗体。RNA提取方案亦可应用于多种幼虫器官、整只幼虫以及成虫果蝇。所获得的总RNA可用于通过候选基因或全基因组范围的方法分析基因表达变化。最后，我们详述了一种量化克隆性肿瘤侵袭性的方法。尽管该方法应用范围有限，但其核心理念广泛适用于其他需要避免认知偏差的定量研究。

引言

癌症是遗传异质性最高的一类疾病，其发病率和死亡率在全球范围内，尤其是老年人群中急剧上升。癌症起源于一个逃逸了固有肿瘤抑制机制并失控分裂的肿瘤起始细胞，呈克隆性发生。随着促进生长、增殖和迁移的遗传损伤逐步累积，同时抑制细胞死亡和分化，最初的良性增生被逐步转化为高度恶性、可转移且致命的肿瘤。现已明确，除了遗传改变之外，肿瘤进展还需要其周围间质发生改变，并依赖肿瘤与其微环境中多种细胞类型（例如，成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞）之间的相互作用。深入理解包括肿瘤-间质相互作用在内的恶性转化的分子机制，对于制定癌症预防和早期筛查策略，以及开发应对癌症转移和耐药性的新型有效治疗方法具有重要意义。

果蝇 黑腹果蝇 已成为癌症研究中一个颇具吸引力的体系 ^1-4 由于果蝇具有快速的世代周期、在信号通路关键节点上与人类高度保守、遗传冗余度低，以及拥有丰富的先进遗传工具，可实现对几乎任何基因进行时空特异性操控。因此，能够在遗传学上明确定义、并可重复地构建出不同恶性程度的肿瘤模型 黑腹果蝇 通过在野生型组织中的部分前体细胞中利用MARCM技术引入功能获得性和功能缺失性突变 ⁵MARCM 技术结合了由 FLP/FRT（FLP 重组酶/FLP 识别靶位点）介导的有丝分裂重组 ⁶ 使用FLP-out ⁷ 以及 Gal4/UAS（上游激活序列） ⁸....

方案

注意：本研究采用 eyFLP1; act>y⁺>Gal4，UAS-GFP；FRT82B，tub-Gal80 MARCM 82B 绿色测试品系 ¹¹将MARCM 82B绿色测试品系的处女蝇与如下品系的雄蝇杂交： w；UAS-a；UAS-b^RNA干扰，FRT82B c^突变 基因型将产生子代，其3号染色体右臂之间会发生有丝分裂重组^rd 同源染色体。通过这种方式，获得针对该基因的纯合突变克隆 c 位于FRT82B位点远端的克隆将在EAD和脑神经上皮中产生。这些克隆将表达GFP和转基因 a 和用于基因的 dsRNA b (图1A已在果蝇研究领域建立了多种用于X、2L、2R、3L和3R染色体重组的eyFLP-MARCM测试品系，这些品系可在果蝇研究群体中获得。

1. 果蝇操作、杂交与发育阶段确定

1. 在室温下通过同时接种多个培养瓶来扩增合适的MARCM测试品系。每2-3天将成虫转移至新鲜培养瓶中，以便收集足够数量的处女蝇用于后续杂交实验。
   注意：收集 virgin 时，应避免长时间暴露于 CO₂ 因为这会降低雌性的繁殖力。
2. 根据实验规模，使用至少10只MARCM测试用处女蝇和4只雄蝇在试管中设置果蝇杂交

结果

为了展示 eyFLP-MARCM 技术在生成具有特定基因型的 GFP 标记细胞克隆中的潜力 果蝇 EAD，诱导出三种类型的克隆：（1）仅表达GFP的对照组，（2）表达小G蛋白Ras的致癌形式（Ras^V12在肿瘤抑制基因纯合缺失的背景下 涂鸦 (scrib¹，以及（3）过度生长但非侵袭性 ras^V12scrib¹jnk^DN 克隆，其中通过表达其显性失活形式使 Jun 氨基末端激酶（JNK）失活（图4, 表1 （用于基因型）已证明其侵袭性 ras^V12scrib¹ 克隆性肿瘤需要JNK信号通路及其下游转录因子的异常激活 ^10,12,23,24此外， ras^V12scrib¹ 肿瘤在体内引.......

讨论

产生遗传嵌合体的技术 黑腹果蝇 是分析和操控基因功能的最先进工具之一 ³³. eyFLP-MARCM 系统已被证明具有强大且稳健的性能，因其能够以空间受限的方式诱导出视觉可标记且遗传学定义明确的克隆， 即，在那些组织中 无眼 增强子具有活性 ^9,18这一点在同一个细胞中组合多个遗传损伤时尤为重要。尽管这些高度异常的细胞克隆在仅局限于胚胎前肠（EAD）和脑神经上皮时仍允许幼虫发育，但当它们在幼虫体内广泛分布时（例如由热激调控的FLP（hsFLP）克隆），则可能导致致死效应。值得注意的是，在果蝇EAD上皮中诱导克隆，使激活的癌基因与抑癌基因的丢失相结合，可重现某些人类实体上皮性肿瘤的发生与进展过程。然而，该系统也存在一定的局限性，下文将简要讨论。由于昆虫具有开放的循环系统，因此不会出现人类癌症中所见的真正意义上的转移。因此，转移性播散这一复杂过程无法被真实地建模于 果蝇然而，诸如EAD肿瘤之类的 ras^V12scrib¹ 克隆确实表现出恶性特征，因为它们会破坏围绕E.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Gewürzmühle Brecht，埃根施泰因，德国	00262-0500	果蝇培养基配方：制备20 L果蝇培养基，包含160 g琼脂、360 g酵母、200 g大豆粉、1.6 kg黄玉米粉、1.2 L麦芽提取物、300 ml淡色玉米糖浆、130 ml丙酸和200 ml 15%尼泊金。果蝇培养基应在85℃加热煮制1小时。 °C.
玉米糖浆	德国迈肯海姆，格拉夫沙夫特·克劳特法布里克约瑟夫·施密茨有限公司	01939
丙酸	卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄	6026.1
玉米粉	ReformKontor GmbH，德国萨伦廷	4010155063948
麦芽提取物	CSM Deutschland GmbH，德国不来梅	728985
大豆粉	Stockmeier Food GmbH，德国黑尔福德	1000246441010
酵母	Werner Ramspeck 公司，德国施瓦巴赫	210099K
对羟基苯甲酸甲酯 / 尼泊金甲酯	Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬	H5501	用70%乙醇配制15%的储备液
果蝇培养管	Kisker Biotech，德国施泰因富特	789008
小瓶塞	K-TK e.K.，德国雷茨塔特	1002
果蝇培养瓶	Greiner Bio-One，德国弗里肯豪森	960177
瓶塞	K-TK e.K.，德国雷茨塔特	1002 S
聚乙烯醇 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich，德国德意志豪芬	81381	封片剂配方：将6 g聚乙烯醇4-88溶解于39 毫升 Millipore H2O，6 ml 1 M Tris（pH 8.5）和12.5 ml甘油。50℃下搅拌过夜 °C并离心20 min，5,000 rpm。向 supernatant 中加入 DABCO，使其终浓度为 2.5%。将分装样品于 -20 ℃ 保存 °C.
1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷 / DABCO	Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬	9002-93-1
磷酸盐缓冲液／PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 和 1.8 mM KH2PO4，用 Millipore H 调至 pH 7.42O
PBST			PBS 中含 0.1% Triton X-100
多聚甲醛 / PFA	Sigma-Aldrich，德国德意志豪芬	158127	4% PFA固定液配方：溶解4 g PFA 在 80 ml Millipore H2在55℃加热的磁力搅拌器上 °C. 逐滴加入 1 M NaOH，直至所有 PFA 颗粒完全溶解。加入 10 ml 10x PBS，并用 1 M HCl 调节 pH 至 7.4。混匀后加入 100 µl Triton X-100，并用 Millipore H₂O 定容2O至100 ml。将分装样品储存在-20 °C. 避免反复冻融。（注意：PFA 具有高毒性。应在通风橱中配制 PFA 固定液，佩戴自给式呼吸器、手套和防护服。避免接触皮肤、眼睛或黏膜。）
牛血清白蛋白/BSA	Sigma-Aldrich，德国德意志豪芬	A3059	封闭液配方：将 0.3% BSA 溶于 PBST 中
荧光标记的鬼笔环肽	Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄，Molecular Probes	A12379, A22283, A22284	鬼笔环肽储备液：将粉末（300 U）溶于1.5 ml甲醇中。置于-20℃保存。 °C. 染色时，将 A12379 和 A22283 以 1:250 的比例稀释于 PBST 中，A22284 以 1:100 的比例稀释于 PBST 中。
4’6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 / DAPI	卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄	6335	DAPI 染色液：用 Millipore H₂O 配制 5 mg/ml 的储存液2O，并在 4℃ 下分装保存 °C. 在 PBST 中以 1:1,000 的比例稀释使用。
小鼠抗H2抗体	Kurucz 等，2003		在封闭液中以1:500的比例稀释使用
Cy5标记的驴抗小鼠IgG（H+L）亲和纯化二抗	杰克逊免疫研究实验室，萨福克，英国	715-175-151	在封闭液中按1:500比例稀释使用
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools，德国海德堡	11295-10
玻璃胚胎培养皿（30 mm	赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国	E90
钨针	Fine Science Tools，德国海德堡	10130-20
镀镍针头夹持器	Fine Science Tools，德国海德堡	26018-17
显微镜载玻片	VWR，德国达姆施塔特	631-1553
22 x 22 mm 盖玻片（#1 Menzel-Gläser	VWR，德国达姆施塔特	631-1336
盖玻片 24 x 50 mm（0.13–0.16） mm	赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国	1076371
Kimtech Science 精密擦拭纸	赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国	06-677-70
体视显微镜	奥林巴斯，德国汉堡	SZX7（DF PLAPO 1X-4 日本）
荧光体视显微镜	奥林巴斯，德国汉堡	SZX16（SDF PLAPO 0.8X 日本）配 DP72 CCD 相机	配备用于GFP及其他蓝色激发荧光染料的窄带蓝色带通滤光片组（激发滤光片BP460-480 nm，阻断滤光片BA495-540 nm），以及用于RFP及其他绿色激发荧光染料的窄带绿色激发和长通阻断滤光片（激发滤光片BP530-550，阻断滤光片BA575IF）。软件：Olympus cellSens Standard 1.11
共聚焦显微镜	Olympus，德国汉堡	FV1000	配备倒置 IX81 显微镜。物镜：20× UPlan S-Apo（NA 0.85），40× UPlanFL（NA 1.30）和60× UPlanApo（数值孔径 1.35）。激光器：紫外激光二极管 LD405（50 毫瓦（mW），氩离子激光器，多谱线 457/(476)/488/515（40 毫瓦），黄/绿激光二极管 LD560（15 毫瓦）和红色激光二极管 635（20 毫瓦（mW）。软件：Fluoview 2.1c 软件
果蝇冷却培养箱	Ewald Innovationstechnik GmbH，德国巴特嫩多夫	Sanyo MIR553
冲洗瓶	VWR，德国达姆施塔特	215-8105
BD Clay Adams 旋转混匀仪	VWR，德国达姆施塔特	15172-203
ELMI 数字摇床	VWR，德国达姆施塔特	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA 裂解试剂	VWR，德国达姆施塔特	2302700	该方案适用于其他基于TRIzol的试剂， 例如，Sigma公司的TRIreagent（货号：T9424），Thermofisher公司的TRIzol试剂（货号：15596）。
焦碳酸二乙酯/DEPC	Sigma-Aldrich，德国德意志豪芬	D5758	将DEPC用Millipore H₂O按1:1,000比例稀释2O，搅拌过夜并高压灭菌。
超纯苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）	赛默飞世尔科技，英坦科技，德国卡尔斯鲁厄	15593-031
氯仿	默克，德国达姆施塔特	102445
TURBO DNase（2 U/μL）µl)	赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国	AM2238
Invitrogen UltraPure 甘油	赛默飞世尔科技，英坦科技，德国卡尔斯鲁厄	10-814-010
三水合乙酸钠	VWR，德国达姆施塔特	27652.232	用 DEPC-H₂O 配制 3 M 醋酸钠溶液2O 并调节 pH 至 5.2
2-丙醇	默克，德国达姆施塔特	109634
乙醇	默克，德国达姆施塔特	100983	用DEPC-H₂O配制75%乙醇溶液2O.
UV/Vis分光光度计 NanoDrop ND-8000	赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国	ND-8000
Eppendorf 微型离心机（制冷型）	赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国	5417R
Experion RNA StdSens 分析试剂盒	伯乐生命科学有限公司，Mü德国南肯	7007103
Experion 自动化电泳工作站	伯乐生命科学有限公司，Mü德国南肯	7007010
SuperScript III 逆转录酶	赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国	18080044
寡核苷酸dT引物	Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶		制备100 µDEPC-H2O 中的 M 储存液2O，并在 -20 保存 °C
dNTP混合物	Takara Bio Europe/Clonetech，法国圣日耳曼昂莱	4030	储存25的等分试样 µl，置于 -20°C
CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统	伯乐生命医学产品（上海）有限公司，Mü德国南肯	1855195
iQ SYBR Green Supermix	伯乐生命科学有限公司，Mü德国南肯	170-8882
96孔硬壳PCR板，薄壁	伯乐生命科学有限公司，Mü德国南肯	HSP9601
Microseal 'B' 薄膜	伯乐生命科学有限公司，Mü德国南肯	MSB1001
rp49 上游引物	Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶		5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 反向引物	Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶		5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 上游引物	Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶		5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 反向引物	Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶		5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'