昼夜节律钟调控约三分之一的拟南芥转录组，但反馈到生物钟调控中的基因所占比例仍不清楚。本文展示了一种利用原生质体中瞬时表达的生物钟报告基因进行发光成像，以快速评估任意拟南芥突变体株系昼夜节律表型的方法。
本文内容
摘要
摘要
植物的生物钟能够预判环境的每日变化。这种预判有助于植物应对在时间上可预测的生物和非生物胁迫。相反，生物节律的紊乱会严重损害植物健康，并降低农作物产量。因此，我们必须深入了解植物生物节律的复杂调控机制，包括影响转录钟本身运转的各种因素。
在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana，简称拟南芥）中检测昼夜节律缺陷的传统方法通常涉及将特定的突变品系与一个携带萤火虫荧光素酶报告基因的品系杂交，该报告基因受昼夜节律钟基因启动子驱动而呈节律性表达。这种方法费时费力，且如果突变体并无昼夜节律表型，则可能徒劳无功。本文所介绍的方法可实现对昼夜节律表型的快速初步评估。从突变体和野生型拟南芥中分离原生质体，转染一个节律性表达的发光报告基因，并在持续光照条件下连续成像5天。所获得的发光信号轨迹将直接显示突变体植物的自由运行周期是否与野生型植物不同。该方法的优势在于，可高效地对任意拟南芥品系进行筛选，而无需在该突变体背景下构建稳定遗传的发光节律标记转基因品系。
引言
大多数生物体具有内源性生物钟，以帮助其高效应对环境的日常变化。这种生物钟即昼夜节律钟，可调控生物体代谢和生理的诸多方面，以预测外界环境中的可预期变化。例如在植物中，对时间上可预测的病原体或食草动物侵袭的提前响应能显著降低整体易感性1-4。淀粉代谢受到昼夜节律钟的严密调控，以确保无论在长日照还是短日照条件下，淀粉储备均可维持至黎明5。事实上，与昼夜节律周期与24小时环境不匹配的植物相比，其节律与24小时环境相匹配的植物表现出更高的生长速率、碳固定速率和存活率6。昼夜节律对上述所有过程的广泛影响，在很大程度上源于其对拟南芥总转录组中多达三分之一基因的节律性调控7。这些具有节律性的基因产物参与了包括代谢通路、激素信号传导和应激反应在内的多种细胞过程7。此外，通过节律性调控磷酸化修饰，昼夜节律可直接调节蛋白质功能8，并且很可能还通过其他翻译后修饰（PTMs）实现调控。
驱动这一日常转录重编程的生物钟核心是一个转录/翻译反馈环路（TTFL）网络，其中包括早晨表达的基因 昼夜节律相关蛋白1（CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1, CCA1） 和 LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) 抑制傍晚基因的表达 TIMING OF CAB 1 (TOC1)，GIGANTEA (GI) 以及晚间复合物（EC）的成员； LUX ARRHYTHMO（LUX），EARLY FLOWERING 3（ELF3） 和 ELF49-11。连同 假反应调节因子-基因（PRR3、5、7 和 9), TOC1 抑制 CCA1/LHY 表达，而内皮细胞则作为正向调节因子12-14除了反馈机制外，转录后和翻译后对TTFL网络组分的调控在调节昼夜节律中也发挥着重要作用。迄今为止，在生物钟蛋白上鉴定出的最丰富的翻译后修饰是磷酸化。15. 酪蛋白激酶2（CK2）对CCA1的磷酸化影响其与靶启动子的结合能力16 并且对生物钟的温度补偿具有重要意义17PRR蛋白在昼夜节律周期中被差异性地磷酸化，而TOC1的磷酸化会影响其与负性调控因子、即夜间相位的生物钟组分ZEITLUPE（ZTL）的相互作用。18这些实例说明了翻译后修饰和蛋白质-蛋白质相互作用如何调节TTFL网络，使其成为一个24小时的转录振荡器。有关转录钟网络及其调控的更详细介绍，可参阅近期发表的优秀综述（例如 参考文献15).
然而，尚不明确的是，节律性调控的过程以及其他细胞代谢方面在多大程度上会反馈到生物钟机制本身。对拟南芥突变体进行广泛的钟表缺陷筛选，有助于进一步理解哪些机制或信号通路可能参与了从TTFL网络产生24小时节律的过程。为此，Kim和Somers先前发表了一种突破性方法，可用于高效快速地分析任意拟南芥品系的生物钟功能19。该方法基于原生质体中的瞬时表达，避免了构建稳定转基因品系或与发光生物钟标记品系杂交的需要。本文中，我们展示了一种高产率的原生质体分离方法20，并结合优化后的实验流程，利用96孔板读数仪通过瞬时表达的发光生物钟标记物成像来筛选昼夜节律缺陷。
我们将比较野生型Col-0拟南芥与已充分表征的生物钟突变体，以验证本文所述方法能够成功检测到节律的改变。从这些品系中分离原生质体，并转染携带节律性CCA1启动子驱动萤火虫荧光素酶表达的报告载体；即CCA1pro:LUC19。荧光素酶催化多步反应，使荧光素转化为电子激发态的氧荧光素，从而发光21，通过随时间成像检测发光信号，以评估这些原生质体中转录节律的周期、振幅和相位。
该实验方案包含三个主要步骤：原生质体的分离、用报告质粒转染原生质体，以及发光成像。这三个步骤应在同一天内完成，并使用 freshly prepared 缓冲液和试剂。植物的培养以及足量报告质粒的纯化应提前完成，本方案中不展示这些过程。
方案
注意：本实验方案中所述的试剂及体积均以每种测试的拟南芥品系为单位，每种基因型将产生六个重复孔。当分析多个品系时，需根据待分析品系的数量对材料用量进行相应倍数的放大。在本视频中，野生型拟南芥将与昼夜节律钟突变品系 ztl 进行比较（尽管后续还将提供其他品系的代表性实验结果）。
| 酶解液 | |
| 纤维素酶 | 0.5% (w/v) |
| 果胶酶 R10 | 0.25% (w/v) |
| D-甘露醇 | 400 mM |
| CaCl2 | 10 mM |
| KCl | 20 mM |
| 牛血清白蛋白 | 0.1% (w/v) |
| MES, pH 5.7 | 20 mM |
| W5 溶液 | |
| NaCl | 150 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5.7 | 2 mM |
| 葡萄糖 | 5 mM |
| MMg 溶液 | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| D-甘露醇 | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| PEG 溶液 | |
| PEG4000 | 40% (w/v) |
| D-甘露醇 | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| 成像溶液 | |
| W5 溶液 | 加至终体积 |
| 胎牛血清 | 5% (v/v) |
| 荧光素 | 1.2 mM |
| 氨苄青霉素 | 50 mg/ml |
表1：溶液列表。
1. 材料与缓冲液的准备
- 植物材料
- 将拟南芥Col-0种子置于1.5 ml离心管中的水中，在4°C避光条件下放置4天。用移液器将种子转移至花盆土壤中，并在长日照条件（16小时光照/8小时黑暗）下于21°C培养7天。前3天保持花盆加盖，以确保高湿度。将6株幼苗移栽至新的8 cm × 13 cm × 5 cm花盆中，并在相同条件下继续培养21天。确保土壤始终保持湿润。
- 报告基因质粒
- 按照制造商说明，使用DNA提取试剂盒从细菌培养物中提前纯化CCA1pro:LUC报告基因质粒19。
注意：一次转染需要20 µg报告基因质粒（10 µl，浓度为2 µg/µl，溶于dH2O中）。
- 按照制造商说明，使用DNA提取试剂盒从细菌培养物中提前纯化CCA1pro:LUC报告基因质粒19。
- 溶液
注意：本实验方案需要以下五种溶液：酶解溶液、W5洗涤液（Wash 5）、甘露醇-镁（Mannitol-Magnesium, MMg）溶液、聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）溶液和成像溶液（表1）。在进行原生质体分离步骤前，请预先配制好这些溶液。- 根据表1配制10 ml酶解溶液，最后加入酶，并使用0.22 µm针头滤器过滤除菌。
- 根据表1配制其余溶液，体积分别为：15 ml W5溶液、10 ml MMg溶液、1 ml PEG溶液和1.5 ml成像溶液。
注意：PEG溶液需至少提前1小时配制，以确保PEG完全溶解。成像溶液需通过0.22 µm针头滤器过滤除菌。
图1：原生质体分离。 成年拟南芥植株的叶片（A）被固定在高压灭菌胶带（autoclave tape）上，下表皮朝上（B）。（C）用15 ml锥形管的管尖将魔术胶带（magic tape）轻轻按压到下表皮层上。（D）移除魔术胶带，以暴露叶肉细胞（E）。（F）将附有叶片的高压灭菌胶带条漂浮在含有纤维素酶和果胶酶的酶解液中，使原生质体释放到溶液中。（G）酶解后，叶骨架残留在高压灭菌胶带上并被丢弃，原生质体则保留在酶解液中（H）。（I）最终获得的叶肉原生质体（比例尺 = 50 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 原生质体分离
- 标记一个培养皿，并加入 10 ml 过滤除菌的酶溶液。
- 在干净的实验台面上固定四条粘性面朝上的高压灭菌指示胶带，并在胶带上标记培养皿的尺寸。
- 剪取4周龄植株的叶片（图1a），并将上表皮按压到高压灭菌胶带（autoclave tape）上（即 下表皮朝上（图1b)).
- 使用15 ml离心管将魔术胶带轻轻按压在叶片下表皮表面，注意不要压碎叶片组织。图 1c）。小心地撕下魔术胶带，以剥离下表皮（图1d）以暴露叶肉细胞（图1e).
- 将高压灭菌指示胶带剪成适合培养皿的大小，用镊子将胶带放入培养皿中，使其漂浮于酶溶液上图1f），叶片朝下。在摇床平台上以60 rpm转速振荡60分钟，期间原生质体会释放到溶液中。
- 使用镊子取下并丢弃灭菌指示胶带条图1g）并用移液器吸取含有原生质体的溶液（图1h) 转移至一个50 ml离心管中。使用宽口吸头（例如P5000吸头或剪去末端的P1000吸头）。
- 在 100 × g 条件下离心原生质体 3 分钟，温度为 4 °C 用移液器吸弃上清液。注意操作，因为沉淀物非常松散。
- 加入10 ml W5溶液至原生质体中，轻轻晃动离心管以重悬。
- 将原生质体置于冰上静置 30–60 分钟。在此步骤中，使用血细胞计数板计数原生质体以评估产量（图1i).
- 通过离心以 100 x g 离心 3 分钟收集原生质体 4 °C 用移液器吸弃上清液。注意操作，因为沉淀物非常松散。
- 将原生质体重悬至浓度为 5 x 105 原生质体/ml，置于MMg溶液中。
3. 原生质体转染
- 取10 µl 报告质粒（2 µg/µl）加入至15 ml 圆底离心管中。
- 向管中加入400 µl 原生质体。
- 加入一倍体积（410 µl）PEG 溶液，轻轻翻转管子12次以混匀，从而转染原生质体。
- 室温孵育8–15分钟后，用四倍体积（1640 µl）W5 溶液稀释原生质体-DNA-PEG 混合物，并轻轻翻转管子6次混匀。
- 在室温下以100 × g 离心2分钟收集转染后的原生质体，用移液器吸除上清液。注意操作轻柔，因为沉淀非常松散。
- 将原生质体重悬于1,250 µl 成像溶液中。
- 将200 µl 悬液分装至96孔板的六个重复孔中，在空孔中加入W5 溶液，并用适用于发光成像的透明粘性封板膜密封。
4. 成像
- 将培养板转移至适用于植物成像的任意发光成像设备中。转移后10-15分钟更换培养板的粘性盖子，以避免孔间产生冷凝和压力差异，随后开始成像。在室温下每约45分钟读板一次（每孔3秒），持续五天。
注意：读板频率及每孔读取时间可能因成像设备的不同而有所调整。
5. 数据分析
- 使用任意分析软件（例如，Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)22）分析发光结果。将突变系与野生型对照进行比较，以揭示昼夜节律缺陷。
结果
将野生型拟南芥的原生质体与已知的生物钟突变体 cca1/lhy（短周期突变体2）、ztl（长周期突变体23）以及过表达株系 CCA1-OX（无节律性24）进行比较。所有样本均通过瞬时转染 CCA1pro:LUC 报告基因，并在持续光照条件下，利用酶标仪连续成像5天。
此处我们显示，在 cca1/lhy 突变体中，受昼夜节律调控的基因表达的自由振荡周期缩短（图2a），这与通过稳定转基因表达发光节律标记物所发表的周期分析结果一致2,9。在 ztl 突变体的原生质体中，昼夜节律振荡的周期比野生型更长（图2b），这与先前在幼苗、细胞悬浮培养物及原生质体中发表的结果相符19,23,25。
CCA1 的过表达使生物钟停滞在早晨阶段，导致全局转录失去节律性24。与此一致，我们在 CCA1-OXprotoplasts 中未观察到 CCA1pro:LUC 表达的振荡现象（图 2c）。
图 2： 原生质体昼夜节律 对Col-0、cca1/lhy、ztl 和 CCA1-OX 的原生质体瞬时转染CCA1pro:LUC 构建体，并连续5天检测发光信号的昼夜节律（A–C）。（D）基于Col-0、cca1/lhy 和 ztl 中发光信号轨迹计算的昼夜节律周期估计值（A–B）。数据以均值±标准误（SEM）表示，n = 3–5，t检验 p 值如图所示。请点击此处查看该图的高清版本。
| 基因型 | 时期（原生质体） | 时期（转基因植株） | 检测方法： | 参考文献 |
| Col-0 | 23.0 ±0.21 | 24.4 ±0.09 | pCCA1:LUC in Col-0 | (2) |
| cca1/lhy | 20.6 ±0.13 | 19.9 ±0.11 | pCCA1:LUC in Col-0 | (2) |
| ~18 | RNA in Ler background | (9) | ||
| ztl | 25.1 ±0.12 | 27.4 ±0.5 | CAB2:LUC in C24 ecotype | (22) |
| CCA1-OX | 无节律 | 无节律 | pCCA1:LUC （仅LD数据） | (2) |
| 无节律 | RNA 和蛋白在 Col-0 背景中 | (23) |
表2：原生质体与转基因幼苗中昼夜节律的比较。 原生质体中 pCCA1:LUC 表达的昼夜节律周期，与该突变体首次报道的周期长度进行比较，若数据可用，亦与 Col-0 中 pCCA1:LUC 表达的周期进行比较。
讨论
本文介绍了一种快速检测拟南芥品系昼夜节律周期缺陷的实验方法，包括原生质体分离、转染及生物发光成像。通过CCA1pro:LUC报告基因的发光检测，计算了野生型拟南芥以及时钟突变体cca1/lhy、ztl和CCA1-OX的昼夜节律周期，结果与以往利用耗时较长的转基因方法在整株植物中获得的已发表数据一致（表2）。利用该方法筛选拟南芥突变体，可避免首先构建转基因发光品系的步骤，该步骤耗时较长 ，且可能最终仅发现某一特定突变体表现出野生型节律。本实验方案的一个显著优势在于，可在短时间内对任意拟南芥品系进行昼夜节律转录模式改变的筛查，有助于发现更多影响植物生物钟调控的基因。
分离原生质体可能是一项费力的工作，特别是当突变体品系表现出矮化表型时。先前报道的原生质体制备方法包括将叶片或幼苗切成细条，然后用酶溶液进行真空渗透，使酶能够到达细胞壁26,27。随后的消化过程至少需要在黑暗中孵育3小时，以将原生质体释放到酶溶液中。若不进行真空渗透，则建议孵育时间长达18小时。在本文所介绍的方案中，无需进行真空渗透，因为通过胶带去除了对酶不透的表皮细胞层。在通过切割植物材料制备原生质体时，消化后必须将原生质体与细胞壁碎片分离；这通常通过过滤溶液或在蔗糖梯度中纯化来实现27,26。而在本方法中，任何未消化的组织在消化后仍会留在高压灭菌胶带上，因此可省略原生质体的过滤和蔗糖梯度纯化步骤。长时间的原生质体制备过程所造成的应激可能影响细胞活力和昼夜节律钟。此处展示的基于胶带的原生质体制备方法20可获得大量原生质体；并且考虑到细胞在昼夜节律时间序列中的存活状态以及原生质体与完整幼苗相似的周期长度（表2），本文所述方法优于其他制备原生质体的方法。
转染步骤是影响原生质体活力的关键步骤。聚乙二醇（PEG）溶液能够将DNA导入细胞，其在该溶液中的孵育时间（步骤3.4）和PEG的浓度均需通过实验经验确定。标准浓度为20%，浓度过低会降低转化效率，过高则会降低细胞活力28。短至5分钟的孵育时间即可实现原生质体的有效转染27。
原生质体可以在任何发光成像平台上进行成像。在本视频中，我们使用了一台配备外部光源（红色和蓝色LED，波长分别为630 nm和470 nm，组合光强约为20 µE）的发光酶标仪，该设备支持高通量筛选和频繁测量。其他能够检测发光信号的成像设备，例如其他类型的酶标仪或基于电荷耦合器件（CCD）相机的成像系统，只要能提供用于光合作用的光照，也同样适用。使用安装在可控暗箱中的CCD相机的优势在于可以程序化控制光照和温度；其缺点是图像采集时间较长，会导致较长时间的黑暗，这不仅可能对原生质体造成胁迫，还可能干扰其内源生物钟的正常运行。无论选择哪种实验平台，与幼苗或成熟植株相比，均可能需要对成像参数进行调整。根据我们的经验，在转染过程中提高报告质粒的浓度和/或在成像缓冲液中增加荧光素（luciferin）的浓度，可能有助于解决初始实验中出现的节律不稳定或迅速衰减的问题。
在未来的实验中，此处描述的方法可用于研究任何突变拟南芥品系的昼夜节律表型。经过少量修改后，该方法还可用于研究 例如 在此实验体系中可研究多种药物对生物钟的影响。此外，转染操作可进行调整，以引入人工微小RNA实现基因沉默19，进一步拓展了该方案的适用性。水稻原生质体的制备方案已较为成熟29 本文所述的成像方案也可用于深入理解具有重要经济价值的单子叶作物植物中的生物钟机制。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 David Somers 教授和 Jeongsik Kim 博士提供荧光素酶报告质粒及初始方法开发。Karen Halliday 教授慷慨提供了本研究中使用的所有昼夜节律突变体品系。本研究得到了皇家学会研究基金 RS120372 和 RS140275 的资助。GvO 是皇家学会大学研究学者（UF110173）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CELLULYSIN 纤维素酶，Trichoderma viride | Merck Millipore | 219466 | |
| 果胶酶 R10 | Sigma Aldrich | P2401 | |
| D-甘露醇 | Sigma Aldrich | M4125 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A4503 | |
| MES | Acros Organics | 327765000 | |
| NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
| 葡萄糖 | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| 聚乙二醇 (PEG) 4000 | Acros Organics | 434630010 | |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | F4135 | |
| 萤火虫D-荧光素 | Biosynth AG | L-8200 | 将荧光素粉末溶于0.1 M三磷酸缓冲液（pH 8.0），配制成50 mM浓度 |
| 氨苄青霉素 | Sigma Aldrich | A9618 | |
| Comply 蒸汽指示胶带 | 3M | 1222 | |
| Magic 胶带 | 3M | 819-1460 | |
| 培养皿 | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| 微孔板，96孔，平底，白色 | Greiner Bio-One | 655075 | |
| TopSeal-A，96孔板用粘性封板膜 | Perkin Elmer | 6050195 | |
| 注射器，10 ml，无针头 | BD Plastipak | 302188 | |
| 注射器滤器，0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| 生物节律分析软件系统 (BRASS) | 可在 amillar.org 免费下载 | ||
| QIAfilter Maxiprep 试剂盒 | Qiagen | 12262 | |
| 改良Fuch-Rosenthal计数板，双室 | Hawksley | AC6000 | |
| 明场显微镜 | Optika Microscopes | B-150POL-B | |
| LB942 TriStar2 多功能酶标仪，带发光检测模块 | Berthold Technologies Ltd | 57947/57948 |
参考文献
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