pHluorin在芽殖酵母内吞作用的定量、动力学及高通量分析中的应用

摘要

准确量化囊泡运输事件通常可为特定蛋白质的功能及突变效应提供关键见解。本文介绍了利用对pH敏感的GFP变体——超 ecliptic pHluorin，结合定量荧光显微镜和流式细胞术，在活细胞中定量内吞事件的方法。

摘要

绿色荧光蛋白（GFP）及其变体是研究活细胞中蛋白质定位以及细胞骨架重塑、囊泡运输等动态过程的常用工具。针对多种应用已开发出利用GFP融合蛋白的定量方法；然而，GFP对蛋白水解具有一定的抗性，因此其荧光在溶酶体/液泡中仍可持续存在，这可能干扰对内吞途径中货物运输的定量分析。一种用于量化内吞作用及内吞后运输事件的替代方法利用了超灵敏pHluorin（superecliptic pHluorin），这是一种对pH敏感的GFP变体，在酸性环境中荧光会被淬灭。将pHluorin与跨膜货物蛋白的胞质端融合形成嵌合蛋白，当货物被纳入多泡体（MVBs）并运送至溶酶体/液泡腔时，其荧光信号随之减弱。因此，液泡荧光的淬灭有助于对内吞作用及内吞途径早期事件进行定量分析。本文介绍了利用pHluorin标记的货物蛋白，通过荧光显微镜进行内吞作用定量的方法，以及基于群体分析的流式细胞术检测方法。

引言

囊泡运输在维持真核细胞细胞器的身份和功能方面起着重要作用，同时也是调控各个细胞区室中蛋白质和膜组成的关键机制。在质膜上，分泌囊泡的融合将新的蛋白质和膜运送至细胞表面，而通过内吞作用形成的囊泡则从细胞表面移除膜和蛋白质，随后进行再循环或靶向输送至溶酶体。因此，内吞作用对于营养物质的摄取以及对外部环境的响应具有重要意义。胞吐作用与内吞作用相互平衡，以调控质膜的表面积，并实现受损蛋白质的更新替换。

在酵母和哺乳动物细胞中的研究已鉴定出大量参与内吞作用的蛋白质，以及多种促进特定货物分子内化或响应不同环境条件的内吞途径。其中研究最为深入的是网格蛋白介导的内吞作用（CME），在该过程中，网格蛋白与胞质辅助蛋白组装成包被结构，以稳定新生的内吞囊泡。对出芽酵母Saccharomyces cerevisiae进行的实验，揭示了许多内吞相关蛋白质招募的动态过程及其顺序^1-3。值得注意的是，CME机制在进化过程中高度保守，酵母中大多数与CME相关的蛋白质在人类中均有同源物；因此，出芽酵母已成为理解高等真核生物中保守的内吞机制的重要工具。例如，利用出芽酵母的研究发现，CME结构（在酵母中称为皮层肌动蛋白斑块）的形成与成熟涉及多种蛋白质的有序招募：首先招募网格蛋白及结合货物的衔接蛋白，随后招募其他内吞辅助蛋白，激活Arp2/3介导的肌动蛋白聚合，并进一步招募参与囊泡断裂的蛋白质^1,2。CME机器各组分向皮层肌动蛋白斑块的招募是一个高度有序且....

方案

1. 溶液与培养基

1. 准备以下储备液、培养基和培养板：
   1. 配制10x YNB：将67 g缺乏氨基酸的酵母氮源基础培养基（yeast nitrogen base lacking amino acids）溶解于1 L水中，用0.22 µm硝酸纤维素滤膜过滤除菌。
   2. 使用1x YNB（来自10x母液）、2%葡萄糖（来自无菌的50% w/v母液）和1x氨基酸/营养混合物（来自100x母液，见步骤1.1.4）配制YNB液体培养基。用于质粒筛选时，根据需要省略特定的氨基酸或营养成分；为诱导Mup1表达，还需从氨基酸/营养混合物中省略甲硫氨酸。
   3. 使用1x YNB（来自10x母液）、2%葡萄糖（来自无菌的50% w/v母液）、0.7 g/L氨基酸/营养混合物（见步骤1.1.5）和2.5%琼脂配制YNB平板培养基。制备方法：在860 ml水中加入25 g琼脂和0.7 g氨基酸/营养混合物，高压灭菌。待培养基冷却至55 °C后，加入100 ml 10x YNB和40 ml 50%葡萄糖。每10 cm培养皿倒入约30 ml培养基，室温下静置使其凝固，随后于4 °C保存。
   4. 配制100x氨基酸/营养母液（用于液体培养基）：将以下成分溶于100 ml去离子水中：L-甲硫氨酸0.1 g、L-亮氨酸和L-赖氨酸各0.3 g、L-组氨酸、L-色氨酸、腺嘌呤和尿嘧啶各0.2 g（可根据特定菌株需要添加其他氨基酸或营养成分）。如需可轻微加热助溶，经0.45 µm....

结果

稳态下组成型内吞的胞吞作用货物蛋白 Ste3 的定位与定量

为了证明pHluorin标记的货物蛋白可用于活细胞中内吞作用的定量分析，本文比较了嵌合型GFP和pHluorin与酵母a因子信息素受体Ste3的胞质C端尾部融合蛋白的定位情况。Ste3是一种G蛋白偶联受体（GPCR），会持续转运至质膜，随后被内吞并靶向液泡进行降解²⁸。因此，在稳态条件下，大多数Ste3定位于液泡腔内，如表达Ste3-GFP的野生型（WT）细胞所示（图2A）。相比之下，缺失编码四种网格蛋白结合衔接蛋白Ent1、Ent2、Yap1801和Yap1802基因的细胞（ent1Δ ent2Δ yap1801Δ yap1802Δ，以下简称4Δ）无法在内吞位点稳定网格蛋白²⁹，在网格蛋白介导的内吞作用（CME.......

讨论

利用pHluorin对酵母细胞中内吞事件进行定量分析时，通常使用跨膜运输蛋白作为货物分子，其中荧光标签与蛋白的胞质端尾部融合（图1A）。在本文所述的检测中，当pHluorin标签暴露于中性环境时，货物分子具有强荧光信号；而当其进入酸性环境时，荧光则被淬灭。因此，带有pHluorin标签的内吞货物在质膜的胞质侧以及早期内体上易于被检测到，但一旦被整合至多泡体（MVB）腔内小泡或递送至液泡腔内，荧光即变为"弱信号"。通常情况下，新合成的内吞货物可能在GFP及其多数变体尚未完全成熟之前，便已离开内质网（ER）并抵达质膜；因此，尚未到达细胞表面的pHluorin标记货物预计无法被检测到，除非其从内质网或高尔基体的输出过程受到阻碍。

使用 pHluorin 标记的内吞货物（如 Ste3 和 Mup1）已促进了对酵母 CIE 通路中多种相关蛋白的鉴定与表征（图 1B）^8,18。具体而言，本文所述方法已被用于证明：在多种具有网格蛋白介导内吞（CME）缺陷的酵母突变体中，肌动蛋白调控 GTP .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺嘌呤	Sigma	A8626-25G	用于氨基酸混合物和储备液的配制
细菌琼脂	Fisher	BP1423-2	用于平板培养基的配制
BD Difco 酵母氮源基础（不含氨基酸）	BD	291920	用于液体和平板培养基的配制
刀豆蛋白A	Sigma	C5275-5MG	用于腔室载玻片的包被
葡萄糖	Fisher	BP350-1	用于液体和平板培养基的配制
L-组氨酸	Fisher	BP382-100	用于氨基酸混合物和储备液的配制
L-亮氨酸	Acros	125121000	用于氨基酸混合物和储备液的配制
L-赖氨酸	Fisher	BP386-100	用于氨基酸混合物和储备液的配制
L-甲硫氨酸	Fisher	BP388-100	用于氨基酸混合物和储备液的配制
L-色氨酸	Fisher	BP395-100	用于氨基酸混合物和储备液的配制
L-酪氨酸	Acros	140641000	用于氨基酸混合物的配制
Nunc Lab-Tek 八孔腔室盖玻片	Thermo Scientific	155411	用于Mup1-pHluorin内吞动力学及终点检测
尿嘧啶	Sigma	U0750-100G	用于氨基酸混合物和储备液的配制
Axiovert 200 倒置显微镜	Carl Zeiss	Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat 油浸物镜	Carl Zeiss		物镜应为100X，数值孔径1.4或更高
Sensicam	Cooke Corporation		相机应具有12位或更高的动态范围
X-Cite 120PC Q 光源系统	Excelitas Technologies
Slidebook 5 软件	Intelligent Imaging Innovations
ImageJ 软件	National Institutes of Health		http://imagej.nih.gov/ij/