一种基于聚苯胺的核酸传感器

摘要

核酸是评估生物系统的常见分析物；然而，酶学操作可能引入偏差，令人担忧。本文介绍了一种使用聚苯胺进行核酸无标记检测的方法。这种灵敏且成本效益高的传感器技术能够区分分子间单个核苷酸的差异。

摘要

核酸检测是当前研究和临床诊断技术的核心。这些技术所采用的标准方法依赖于酶促修饰，可能引入偏差和假象。下一代检测平台的一个关键要素将是直接的分子传感，从而避免扩增或标记的需要。先进的纳米材料可能提供合适的化学特性，以实现无标记传感器。共轭聚合物非常适合生物传感，因其具有与生物分子相容的特性，并对局部环境变化表现出高灵敏度。本文介绍了一种利用导电聚合物聚苯胺检测核酸的方法。与目标核酸互补的简单DNA“探针”寡核苷酸通过静电作用固定在聚合物上，构建出能够区分目标分子中单个核苷酸差异的传感器系统。该技术不仅具有高度特异性和无偏倚的特点，而且成本效益极高。

引言

共轭聚合物为分子传感器提供了多种选择，包括荧光、电子和比色响应¹。已有大量研究致力于将共轭聚合物应用于核酸传感器中。然而，大多数系统需要二级检测，限制了传感方式的选择²。最近，我们报道了一种基于聚苯胺（PANI）的共轭聚合物传感器平台，该平台利用了这种聚合物的特性，构建出一种无需标记的检测系统³。PANI 是一种高度共轭的电活性聚合物，具有荧光和电阻等适合用于生物体系检测的性质⁴。其结构中的激子不局限于局部，导致正电荷在单体单元之间具有迁移能力。这形成了一个灵活的正电荷支架，可与DNA的带负电骨架发生相互作用^5,6。重要的是，通过静电作用结合的DNA具有特定取向，使得含氮碱基能够参与碱基配对。DNA的结合会改变PANI的电子特性，而这一效应可通过紫外照射进一步增强（图1）³。利用该系统，可将与目标核酸互补的寡核苷酸固定在PANI上。多项研究表明，在发生杂交后，由于构象转变为双链DNA结构，原本通过静电吸附在PANI或其他阳离子基质上的寡核苷酸会从基质上解离^3,5,7。

在探针结合可调控共轭聚合物性质的传感器系统中，杂交事件的转导无需对探针或目标核酸进行标记或酶学修饰。共轭聚合物在检测方法上具有高度灵活性，其中一种方法是荧光检测。通过监测聚苯胺（PANI）的荧光信号，可检测低至10^-11 M（10 pM）的目标核酸浓度³。该检测方法快速，在杂交发生后15分钟内即可完成；同时具有高特异性，能够区分目标分子中单个碱基的错配³。

PANI传感器的制备过程简便直接。采用标准合成方法，以苯胺单体、表面活性剂以及可控添加的氧化剂进行反应，可制备出高分子量且在水中分散性良好的PANI。产率可非常高，通过水洗可去除未反应的氧化剂，从而确保PANI不再继续生长。PANI与探针的结合在混合后可自发进行，适度的紫外照射有助于促进复合物的形成。杂交反应可立即进行，短时间孵育后即可检测PANI荧光的变化。该技术的简便性使其易于被众多实验室所采用。

方案

1. 可加工聚苯胺的合成

1. 在250 ml圆底烧瓶中，将苯胺（1 ml，11 mmol）完全溶解于60 ml氯仿中。以600 rpm搅拌5分钟，并用冰浴冷却至0–5 °C，通常需要15–20分钟（图2A）。
2. 在圆底烧瓶中，于600 rpm搅拌条件下，将十二烷基苯磺酸钠（NaDBS）（7.44 g，21 mmol）加入苯胺溶液中。
3. 将过硫酸铵（APS）（3.072 g，13.5 mmol）溶解于20 ml水中，并在30分钟内逐滴全部加入，以避免反应过热。
4. 在0–5 °C下反应24小时，随后让反应体系在室温下继续放置24小时。
5. 观察反应混合物的颜色变化：15分钟后变为乳白色，2小时后变为深棕色，24小时后最终变为深绿色（图2B–F）。
6. 使用布氏漏斗过滤PANI-NaDBS溶液。将滤液转移至分液漏斗中，加入80 ml氯仿和120 ml水进行混合（图2G）。
7. 室温下静置24小时，从分液漏斗中收集深绿色的PANI，未反应的NaDBS和APS则保留在水相上清液中。

2. PANI探针混合与紫外照射

1. 用氯仿-水（1:3 v/v）将PANI溶液稀释10倍，并在微量离心管中将200 µl稀释后的PANI与6.4 µmol探针DNA寡核苷酸通过轻轻摇动混合15分钟。
2. 将PANI-DNA溶液置于交联仪中，以1,200 µJ/cm²的紫外线照射2分钟。紫外线照射必须严格控制在指定剂量内；过量照射会损害PANI的荧光变化，可能是由于PANI与DNA发生共价交联所致。
3. 在17,000 × g离心6分钟以沉淀复合物，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。再次离心后，将沉淀重悬于PBS中。

3. PANI-探针的杂交

1. 向 200 µl PANI-探针复合物中加入 8 µl 100 µM 的互补 DNA 寡核苷酸或目标核酸。
2. 在 40 °C 下轻轻摇动反应液 15 分钟，进行杂交反应。
3. 在 17,000 x g 离心 6 分钟，沉淀 PANI 复合物，用 PBS 洗涤后重悬于水中。

4. 发射稳态荧光测量

1. 将不同处理的PANI加入96孔微孔板中，在250 nm激发波长下测定270-850 nm范围内的发射荧光。PANI的发射峰应在约500 nm处出现。

5. 杂交双链的荧光显微镜检测

1. 将PANI涂覆液滴加到硼硅酸盐玻璃盖玻片上，在40 °C下干燥48小时。
2. 在干燥的PANI薄膜上加入探针（8 µl，100 µM），并用紫外光（1,200 µJ/cm²）照射2分钟。
3. 用PBS洗涤PANI-探针薄膜，并在40 °C下干燥48小时。
4. 加入靶核酸进行15分钟杂交反应，靶核酸可以是生物样品或对照寡核苷酸（8 µl，100 µM），随后用PBS洗涤。
5. 使用500 nm长通滤光片，在40倍放大下获取荧光图像。

结果

图2A 记录聚合反应开始时的反应体系设置， 即，APS 添加之前。胶束形成是反应过程的初始步骤——聚苯胺（PANI）在胶束界面处合成。 图2B 5分钟后呈现乳白色溶液。加入APS 30分钟后，反应液变为微棕色。 图 2C 显示与寡聚体形成相关的颜色变化。 图 2D 4小时后呈现深棕色，表明存在高浓度的短链PANI，与反应极为缓慢一致。最终在48小时后，可观察到高分子量PANI形成的深绿色溶液，分散于氯仿-水体系中图2E). 图2F 在分液漏斗中显示出分散良好、均匀的PANI溶液，无相分离现象。

核酸的检测可在乳液中（图2）或滴涂薄膜表面（图3）进行。聚苯胺（PANI）...

讨论

基于聚苯胺（PANI）的核酸传感器需要将聚合物溶于水中，以实现与DNA和RNA的相互作用。PANI在水中的分散通过使用表面活性剂形成胶束来实现，如先前报道所述⁸。除本实验所用的NaDBS外，其他阴离子表面活性剂（如4-磺基苯二酸十二酯）、非离子型表面活性剂（如壬基酚聚氧乙烯醚）或阳离子表面活性剂（如十六烷基三甲基溴化铵）也可用于可加工性PANI的合成^9,10。本方法的合成起始于将阴离子表面活性剂NaDBS以2:1的摩尔比加入单体苯胺中。NaDBS具有较高的亲水-亲油平衡值（HLB），可在氯仿-水体系中通过在胶束状聚合物油滴与水相之间建立平衡，促进苯胺单体的乳液聚合。随后以1:1.5的摩尔比加入氧化剂APS，生成不断增长的PANI胶束，其中内部核心起到成核剂的作用。这促使单体以头尾相连的方式连接，同时使PANI与周围溶剂保持动态平衡^11,12。反应以受控方式进行，直至形成高分子量的聚合物¹³。本方案所制备的颗粒尺寸范围为50 nm至1,500 nm³。实现PANI缓慢生长但仍保持可溶性的关键在于缓慢加入氧化剂APS、低温条件以及避...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苯胺	Fisher Scientific	A7401-500	ACS级，液体，冷藏
过硫酸铵	Fisher Scientific	A682-500	ACS级，结晶状
十二烷基苯磺酸钠	Pfaltz & Bauer	D56340	95% 固体
氯仿	Fisher Scientific	MCX 10601	液体
DNA引物	MWG operon	n/a	定制DNA序列，约20 bp
微孔板	USA Scientific	1402-9800	96孔，聚丙烯材质（因其对氯仿无反应性）
微孔板密封膜	USA Scientific	2920-0000	减少孔间污染、样品溢出和蒸发
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-544-D	在经紫外照射的盖玻片上涂覆聚苯胺（PANI）
紫外交联仪	UVP	HL-2000	能量：X100 μJ/cm2；时间：2分钟
杂交炉	VWR	01014705 T	温度：400 °C；振荡15分钟
玻璃器皿	Fisher Scientific		三颈圆底烧瓶用于反应；滴液漏斗、塞子、冷凝管、分液漏斗
显微镜	Leica Microsystems	Leica IMC S80	放大倍数20X；伪彩色536 nm；曝光时间86毫秒；增益1.0x；伽马值1.6
微孔板读数仪	Molecular Devices	89429-536