一种简便且环保的制备具有梯度孔径聚乳酸支架的方法

摘要

本研究采用熔融共混与选择性浸出相结合的方法制备了聚乳酸/聚乙二醇（PLA/PEG）支架。该方法可精确调控孔隙率和孔径，从而构建出具有三层结构的支架。同时，在生理环境中评估了其力学性能。

摘要

近年来，功能梯度支架（FGS）在组织工程器械制造中发挥了关键作用。这一生物材料研究新兴领域的重要性在于，需要开发出能够模拟各种组织复杂功能的植入物，包括从一种结构或成分连续过渡到另一种结构或成分的能力。在这一背景下，一个备受关注的研究课题是骨-软骨界面组织的适宜支架设计。本研究通过熔融共混聚乳酸（PLA）、氯化钠（NaCl）和聚乙二醇（PEG）制备了具有梯度孔径的三层支架。通过调控NaCl的粒径分布和PEG的溶解性，实现了对孔径分布的控制。对支架的形貌和力学性能进行了表征，发现制备方法、孔结构与压缩力学行为之间存在相关性。采用自行设计的界面强度测试方法，定量评估了层间界面的粘附强度。此外，为了模拟人体生理环境，还在37 °C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中进行了力学测试。本文所提出的方法能够高度调控孔隙率、孔径分布及力学性能，从而提供了一种简单且环境友好的途径，用于制备具有定制化特性的三层支架。

引言

近年来，由于人们对塑料废弃物以及减少使用不可再生资源的日益关注，可生物降解聚合物在学术界和工业界的重要性不断上升^1-7。特别是，生物相容性和可生物降解的合成聚合物已广泛应用于多个生物医学领域，如药物控释^8,9、可吸收缝合线^8,10、生物过程强化¹¹和组织工程¹²。

组织工程致力于开发能够恢复和维持病变或受损组织正常功能的装置。大多数天然组织由不同类型的细胞和细胞外基质（ECMs）以特定的空间层级结构组成。例如，关节软骨（AC）包含多个区域，其胶原纤维和胶原结合蛋白的类型与取向各不相同。此外，软骨与骨具有显著不同的层级结构。在此背景下，制备每层具有工程化特性的多层支架，可综合考虑这些复杂系统的各个局部微环境，从而实现对异质性组织的替代^13,14。

根据支架的细胞/生物学和（或）物理化学特性，组织工程采用的主要策略可分为单相、双相和三相。双相和三相方法（BTA）采用两种或三种不同的孔隙结构、材料或填料来制备多层功能性装置。此外，只要能够在其物理特性上形成梯度，也可使用单一材料来实现双相或三相装置¹²。

细胞迁移在形态发生、炎症反应、伤口愈合以及肿瘤转移过程中发挥关键作用。当材料表面至核心存在化学-物理特性的梯度时，可促进细胞的迁移行为。因此，满足上述要求的生物材料有助于研究细胞迁移。除了可触发细胞迁移的化学梯度（趋化性）外，细胞培养基底的力学特性也可诱导细胞运动（力学趋化性）¹⁵。

通过改变特定层的面积或载药量，多层结构还可实现聚合物基质中特定药物的可调控释放。

近十年来，为了开发具有孔隙率或孔径等形态学特性梯度（离散或连续）的支架，已提出多种方法^16-31。最近的研究主要集中在采用以下方法制备BTA：颗粒沥滤^12,28,32、气体发泡法¹⁶、静电纺丝^17-19、逐层浇铸法²⁰、快速成型技术^21,22、热致相分离法（TIPS）²²、离心冷冻干燥^24,25、三重周期性极小曲面（TPMS）²⁶以及冷冻铸造^27-30。

在本研究中，我们提出了一种快速且简便的方法，通过熔融共混、压缩成型和盐沥滤相结合的技术，制备基于聚乳酸（PLA）的三层多孔支架（TLS）。与目前常用的大多数支架制备技术不同，本文所采用的策略可被视为完全环保，因其无需使用任何对环境以及活细胞和组织具有潜在危害的有毒溶剂³²。通过对所制备器件的形貌特征和力学性能进行分析，本研究建立了基本的“加工-结构-性能”关系，为未来设计具有特定目标性能的多功能梯度支架提供了指导。

方案

1. 支架制备

1. 在实验室搅拌机中研磨 NaCl 20 分钟，并在 100 °C 的加热器上干燥。
2. 将干燥后的 NaCl（每次 45 g）放入筛分机中，在不发生共振的最高可用频率下筛分 30 分钟。收集六种盐的粒径分级：500 µm 至 1000 µm（M 500）；300 µm 至 500 µm（M 300）；100 µm 至 200 µm（M 100）；90 µm 至 100 µm（M 90）；45 µm 至 65 µm（M 45）；最后为粒径小于 45 µm 的 M 10，如图 1所示。
3. 将所有材料真空干燥过夜，以避免加工过程中发生水解断裂。针对每种材料选择适当的温度，以最大化干燥程度，同时对于聚合物而言不得超过其玻璃化转变温度。因此，PLA 选择 T = 90 °C，PEG 选择 T = 25 °C，NaCl 选择 T = 105 °C。
4. 将 PLA、PEG 和 NaCl 按质量百分比 20/5/75 配比加入密炼机中，在 T = 190 °C 和转速 n = 60 rpm 下混合，持续加工直至扭矩达到恒定值，通常约需 10 分钟。随后迅速收集所得物料。
5. 使用在 210 °C 下运行的实验室压机制备单层样品，将共混物置于直径为 10 mm、高度为 3 mm 的圆柱形模具中，在常压下保持 60 秒，随后在 180 bar 压力下保持 3 分钟。之后在维持 180 bar 压力的条件下冷却至室温。
6. 通过压缩成型组装三层结构
   1. 以与步骤（1.5）相同的方式制备每一单层，但使用不同的模具，即直径为 10 mm、高度为 1 mm 的模具。最终获得 6 个直径为 10 mm、高度为 1 mm 的圆盘，分别含有六种不同粒径的盐：M 500、M 300、M 100，
   2. 为组装三层支架 A（TLS A），将 M 500、M 300 和 M 100 在圆柱形模具内依次堆叠，并在 210 °C 的实验室压机中进行压缩成型：先在常压下保持 60 秒，再在 180 bar 压力下保持 3 分钟，随后在维持 180 bar 压力的条件下冷却至室温。
      注：通过在相同模具中依次堆叠 M 90、M 45 和 M 10 制备 TSL B，并采用与 TLS A 相同的程序进行压缩成型操作。
7. 从圆柱形模具中取出圆盘，放入沸腾的去离子水浴中，不搅拌。3 小时后，从水浴中取出所得多孔结构，并在化学通风橱中于室温下干燥 12 小时。

2. 形态学分析

1. 通过扫描电子显微镜评估支架的形貌。
   1. 在液氮中将样品破碎，然后使用导电碳胶带将样品固定在铝制样品台上。最后，在氩气氛围下溅射镀金90秒，再进行成像，以避免测试过程中发生静电放电。

3. 支架孔径大小

1. 使用能够识别支架孔径分布的图像处理软件，对通过扫描电镜（SEM）分析获得的图像进行详细分析。
   注意：本研究中，孔径分布分析采用基于 MATLAB 的软件完成，该软件此前已有描述³³

4. 孔隙率

1. 在浸出前称量样品，并根据以下公式计算理论孔隙率：
   
   注：m_NaCl、m_PEG 和 m_PLA 分别为 NaCl、PEG 和 PLA 的理论质量，假设为均相混合物。NaCl、PEG 和 PLA 的密度（ρ）分别为 2,16 g/cm³、1,12 g/cm³ 和 1,24 g/cm³。
2. 浸出并干燥后称量样品，以测定样品的表观密度（ρ_scaffold），然后利用公式（2）通过支架表观密度与非多孔 PLA 密度之比的倒数来计算实际孔隙率。
   注：该比值表示支架空隙体积与支架总体积（空隙 + 实体）之比。
   

5. 机械性能

1. 使用配备1 kN力传感器的拉伸试验机，以压缩模式测试样品。设定恒定的应变速率为1 mm min^-1。
2. 为研究样品在生理环境中的力学性能，将测力计配备一个盛有磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）的水浴装置，并在37 °C下进行测试，测试设置与第5.1条所述相同。
   1. 每次在湿态环境下测量前，将样品置于真空烧瓶中用PBS浸泡5分钟，以确保PBS充分填充所有孔隙。随后，将支架在37 °C的PBS中静置15分钟，使其达到设定温度。
3. 采用文献^32,34中描述的方法，通过连接至力学试验机的定制界面强度测试装置，测定TL A层与TL B层之间的界面粘附强度（IAS）。
   1. 将支架固定在夹具上，确保其与试验机的力传感器和底座压板正确对齐。使用高黏性胶黏剂将支架样品固定在铝制样品台（aluminum test stubs）上，并将其放入测试设备中进行测试。
   2. 对于湿态条件下的测试，测试前需将样品在PBS中水化1小时。使用1 kN力传感器，在1 mm min^-1的应变速率下施加拉伸载荷。
      注：需注意，破坏可能发生在某一层的极限抗拉强度处，也可能由于界面处的分层所致。将应力-应变曲线的最大强度值作为界面粘附强度（IAS）进行评估。

结果

通过样品形貌观察和图像分析计算孔径分布，分别对NaCl颗粒尺寸对支架孔隙结构的定性和定量影响进行了评估。 图 2a-f 显示了通过沥滤含有不同NaCl颗粒尺寸的材料所得单层支架的扫描电镜显微照片。

更详细地说，M 500（图 2a）显示出平均直径为 500 µm 的孔隙，这可能是由于在熔融混合过程中直径大于 500 µm 的盐颗粒发生破碎所致。从同一图中可明显看出，孔隙结构特征为数量较少的不规则孔隙，连通性较差，周围由约 10 µm 厚的孔壁包围。图 2b 展示了 M 300 的形貌。在此情况下，孔隙的平均直径处于熔融混合过程中所填充盐颗粒的相同尺寸范围（300–500 µm），从而证实熔融混合过程中未发生颗粒破碎。与 M 500 层相比，M 300 的孔壁更薄（约 5 µm）。M 100（图 2c

讨论

第一个关键步骤是优化筛分效率。精确控制氯化钠颗粒的尺寸对于制备具有理想孔径分布的支架至关重要。另一个关键步骤是在样品从模具中取出时避免薄聚乳酸单层发生断裂。图像处理分析结果可能无法代表整个器件的整体情况。

在拉伸试验过程中，样品可能会从设备上撕裂脱落。

在筛分步骤之前，需确保盐已充分干燥，以便更好地控制氯化钠颗粒的尺寸。这一问题尤其对于最小的盐颗粒尺寸尤为重要，因其具有极强的吸湿性。在压缩成型步骤之前，应在模具表面涂覆一层薄薄的聚四氟乙烯（Teflon）喷雾涂层，以利于后续将样品从模具中取出。图像处理分析必须基于从支架不同区域拍摄的多张图像进行，以确保所选图像具有整体代表性的特征。最后，在进行拉伸测试之前（特别是在潮湿环境中进行的测试），应仔细检查粘合剂与样品之间的粘附情况。

该技术的主要局限在于无法获得连续的孔径梯度。事实上，此处所述方法仅能实现离散的孔径梯度，因其基于不同层的组装。在大多数情况下，结构明确的多层支架可能优于连续梯度支架，但并非总是如此。通过增加层数可在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乳酸	NatureWorks	PLA 2002D
聚乙二醇	Sigma	83797-1KG-F
氯化钠	Sigma	793566-5KG-D
磷酸盐缓冲液	Sigma	P5368-10PAK
实验室混合器	Brabender	PLE 330 - Plasticorder
实验室压片机	Carver
扫描电子显微镜	Phenom-world	ProX
万能材料试验机	Instron	3365 (UK)
BioPuls 浴槽	Instron, Norwood
筛分机	Endecotts	E.V.F.1.
真空烘箱	ISCO	NSV9035
精密天平	Sartorius	AX224