黑质多巴胺能神经元胞体树突区的亚细胞膜片钳记录

摘要

亚细胞膜片钳记录技术为研究树突的功能特性提供了可能。然而，由于树突结构细小，难以接近。本文所述方案旨在促进从脑片中多巴胺能神经元树突获取稳定且可靠的记录 体外.

摘要

多巴胺能神经元的树突接收并传递突触输入，支持动作电位的逆向传播以及神经递质的释放。理解这些基本功能将有助于阐明这些神经元中的信息传递机制。树突膜片钳记录技术使得直接检测树突的电学特性及其依赖电压门控的离子通道成为可能。然而，由于树突结构细小，膜片钳电极难以顺利进入。本报告介绍了一种在急性脑片中对多巴胺能神经元树突进行稳定且可靠记录的逐步操作流程。电生理测量结合了post hoc细胞形态学的重建。实验成功的关键在于优化脑片制备、溶液与电极的配置、光学系统的适当调节，以及电极与记录结构接触时的稳定性。虽然体细胞膜片钳记录的标准原理同样适用于树突记录，但电极操作需更加轻柔。这些灵活的技术可广泛应用于研究树突可兴奋特性的多种科学问题。

引言

神经元主要通过树突接收突触信息。兴奋性和抑制性突触信号从其产生部位传播到整合部位，在该部位动作电位（APs）被诱发，作为输出信号。在传播过程中，突触电位受到树突结构以及被动膜特性与活性膜特性之间相互作用的共同影响。这些高度可变参数的组合增强了神经元的计算能力 ^1,2。然而，树突直径微小，阻碍了对其电学特性的研究。在过去几十年中，膜片钳技术的持续发展³、光学技术的进步⁴以及脑片制备方法的优化⁵，使得对非常细薄（0.7 - 3 µm Ø）的树突进行记录成为可能^6,7。这些方法过去被广泛使用，至今仍被大量用于研究多种神经元中树突的兴奋性⁸。直接树突记录对于确定离子通道在不同神经元区室中功能特性的分布^9-19及其差异^20-22至关重要。这些数据是对利用免疫组织化学结合光学显微镜和电子显微镜检测到的离子通道分布的必要补充^23,24。双体树突记录技术已被用于探索动作电位^{9,13-15,21,22,25-27}和突触电位^13,16,18在神经元胞体-树突区域的传播过程，建立详细的被动电缆模型^28-30，以及研究神经元整合的时间分辨率³¹。

黑质（substantia nigra, SN）是位于中脑的一个区域，参与多种功能，如运动控制、奖赏编码以及习惯性行为。由于黑质内多巴胺能（DA）神经元特异性丢失导致多巴胺减少，与帕金森病患者所表现出的运动障碍密切相关³²。黑质神经回路主要由两类细胞组成：多巴胺能神经元和GABA能神经元。有趣的是，这些神经元具有多种特异性特征，使其区别于其他神经元。大部分DA神经元以及部分GABA神经元的轴突起源于树突部位，表明其树突分支具有异质性（即存在带轴突和不带轴突的树突）^25,26,33。因此，这类神经元的形态结构不同于典型的神经元组织模式——即遵循卡哈尔提出的动态极化定律：信息传递从树突开始，经胞体，最终到达轴突³⁴。此外，DA神经元还被证实能够通过树突释放多巴胺³⁵，产生簇状放电活动³⁶，以及NMDA受体可塑性³⁷。若无法在这些活动起始的位点进行直接记录，相关机制的研究将十分困难。为了深入理解离子通道在黑质神经元树突中的精确定位与其功能特性之间的关系，及其在树突兴奋性和信息传递中的作用，直接的树突记录是首选方法。

本报告描述了一种详细的实验流程，可用于从黑质神经元的树突获取单细胞和双细胞膜片钳记录，并进行相应的post hoc生物胞素标记。对胞体膜和树突膜进行膜片钳操作的基本原理非常相似。然而在实际操作中，与胞体记录相比，树突记录需要进行特定的优化。成功的树突记录依赖于脑片的质量、光学系统的最佳调节、膜片钳电极的轻柔操作以及记录的稳定性。

方案

此处描述的所有实验程序均遵循机构和国家指南、欧盟动物保护指令以及欧洲实验动物科学协会联合会的指南。

1. 溶液的配制

1. 标准人工脑脊液（ACSF；表1）
   1. 使用高纯度盐类 ³⁸ 并使用经双蒸水冲洗过的洁净玻璃烧杯配制新鲜溶液。所有细胞外液和细胞内液的配制均应使用高纯度的双蒸水。
   2. 取一个 2 L 烧杯用于溶解 NaHCO₃₃ 在500 mL 水中溶解，并另配一溶液溶解其他盐类，以防止二价离子沉淀 ³⁹ 根据 表1用双蒸水系统清洗刮勺，取盐前将其干燥。使用磁力搅拌器使溶解均匀。将两个烧杯中的溶液转移至适当的容量瓶中，并定容至所需体积。
   3. 确保最终的细胞外液完全透明，无任何沉淀痕迹。
   4. 使用由95% O₂和5% CO₂组成的混合气体₂ 和 5% CO₂ （carbogen气体）与玻璃微孔滤烛（Ø 13 mm）20 - 30 分钟 在灌注切片之前 ^38,40. 使用渗透压计仔细控制人工脑脊液（ACSF）的渗透压（进行2-3次连续测量），确保其在最佳范围（314 - 325 mOsmol/L）。配制完成后，将剩余溶液于4℃保存 °C，并在3天内使用。
2. 切割液（蔗糖-ACSF；表2） ^5,13
   1. 配制 3 L 新鲜溶液。使用 1 L 溶液用于制备一只动物的脑切片。将剩余溶液在 4 ℃ 保存 °C，并在3天内使用。
      注意：高 Mg²⁺ 和低 Ca²⁺ 使用这些浓度以减少突触传递，并用蔗糖部分替代氯化钠以保护组织 ^5,40.
3. 细胞内溶液
   1. 提前准备 100 mL 用于双全细胞记录的溶液（表3).
   2. 包含甲基硫酸盐 ^13,15,21 以获得良好的细胞形态回收。加入生物胞素（0.1 - 0.4%) 以用于后续观察神经元形态。加入荧光染料（例如，Alexa 594 或 Sulforhodamine 101 ⁴¹）以在记录过程中追踪树突的延伸情况（可选）。
   3. 提前准备 100 mL 用于细胞贴附记录的电极溶液（表 4）。在这种情况下，内液为高钾溶液⁺ 旨在分离宏观超极化激活的阳离子电流的溶液（I_h并含有其他电压门控离子通道的阻断剂。
   4. 将细胞内液以2 mL分装，于-20℃保存 °C. 每次新的记录实验均应使用新的分装样品。每次解冻后须使用渗透压计仔细检测分装样品的渗透压，若渗透压与初始值不符，则应更换新的分装样品。
   5. 将分装的溶液转移至一支3 mL注射器中，注射器顶部装有0.22 µm 无菌注射器滤器。记录过程中将注射器置于冰上，以减少其化合物（ATP、GTP 或磷酸肌酸）的降解。

2. 制备和填充膜片钳电极

1. 拉制
   1. 使用水平电极拉制仪和厚壁硼硅酸盐玻璃管。进行全细胞和细胞贴附记录时，使用外径2 mm、内径1 mm的玻璃管。确保玻璃管绝对清洁³⁸。
   2. 若不满足清洁要求，先将玻璃毛细管浸入有机溶剂（例如乙醇），然后浸入双蒸水中。用本生灯短暂加热毛细管末端。或者，可直接从制造商处订购已清洗并加热处理的玻璃管（见材料列表）。
   3. 进行双体树突记录时，确保细胞体电极在填充细胞内液后电阻为6–10 MΩ^6,11，树突电极电阻为8–19 MΩ（表3）。为在神经元胞体-树突区域获得可比结果，应将细胞贴附记录电极的电阻标准化为10 MΩ^16,18,42,43。
   4. 每次记录前（每天）或封接前立即制备新鲜电极，并在拉制完成后5–8 h 内使用³⁹。将电极存放于带盖的玻璃容器中，以防灰尘污染及尖端堵塞。
2. 抛光
   1. 使用显微抛光仪检查并热抛光每个电极尖端，以获得与细胞膜更佳的封接。使用显微抛光仪前，先在铂金加热丝上熔化一小块玻璃。为保持一致性，应每天更换铂金丝上的玻璃涂层（Peter Jonas，个人通讯）。
      注意：用于细胞贴附记录的电极可在热抛光前进行涂层处理，以降低背景噪声。涂层可使用绝缘材料，如熔融牙科蜡^22,44或硅酮弹性体³⁹。

3. 脑切片的制备

1. 使用16至19日龄的健康Wistar大鼠。避免使用不健康、低体温或脱水的动物。在开始制备脑片前，将动物置于安全且安静的环境中。制备动物时，实验室内不得有其他动物。操作动物时应轻柔。
2. 将蔗糖-ACSF倒入两个400 mL聚丙烯（PP）烧杯中，并置于-80 °C冷冻45分钟。混合溶液以获得均匀的冰冻液体/冷冻溶液，并将烧杯置于冰上。使用微孔滤烛通过碳酰气（carbogen）对蔗糖-ACSF溶液进行供气Ø 13 mm）于每个 PP 烧杯中。
3. 准备切片机和孵育室
   1. 使用高质量的组织切片机，其垂直振动需极低 ^5,38 尽可能减少对切片表层的损伤。在切片机上安装一把新鲜且完整的剃刀刀片。
   2. 每次切割时使用新的剃刀刀片。避免弯曲剃刀刀片。不要去除剃刀刀片表面的脂肪膜（Josef Bischofberger，个人交流）。
   3. 如有条件，可使用制造商提供的振动探针检测垂直振动；或者使用自制的振动探针 ⁵. 尽量减小刀片的垂直振动，使其尽可能接近 0 µm
   4. 准备一个150 mL的储备室 ^45,46 如参考文献第201页所示的切片制备方法 ³⁹将标准人工脑脊液（ACSF）倒入储备室，并将其置于水浴中。使用微孔滤烛通过碳合气（carbogen）为储备室中的溶液供气。Ø 6 mm）。确保碳合气体产生的气泡尽可能微小。
      注意：为保持脑片质量稳定，需每2至3个月新建一个储备室。
4. 切片
   1. 在安静且实验人员不会受到干扰或压力的房间内，使用手术剪（长150 mm）于颈髓水平处将动物断头。
   2. 用手术刀从动物头部鼻部向尾部方向切开头皮，并向两侧剥离移除。使用精细剪刀从头部尾侧向鼻侧剪开颅骨顶部，并将颅骨的两部分向两侧移除。用薄刮勺取出脑组织，小心地放入盛有冰冻（0 - 4 ℃）人工脑脊液的聚丙烯烧杯中。 °C) 蔗糖-ACSF 溶液用碳合气平衡 ³⁸.
      注意：该步骤序列需在尽可能短的时间内完成，但同时必须细致严谨（<<1 分钟，约 40 秒。
   3. 将脑组织保留在PP烧杯的溶液中约2至 5 分钟。调节碳氧混合气体压力以避免脑组织移动。若碳氧混合气体气泡过大，应更换新的微滤芯。
   4. 将脑组织置于一个直径为9 cm的培养皿中，培养皿内底部覆盖有一层约0.5 cm厚的Sylgard层 ³⁸提前准备好此培养皿。
   5. 用冰冻的蔗糖-ACSF 溶液包围脑组织，确保部分液态的 ACSF-蔗糖溶液浸没脑组织。对于冠状切片，使用解剖刀或剃须刀片在冠状面上切除脑的前部。通过冠状切割去除小脑。
   6. 在样本托盘上涂抹氰基丙烯酸盐胶水（面积约1 cm²）²）。将脑组织块粘贴至切片台上，使其额叶部分朝向切片阶段。使用玻璃巴斯德吸管的宽口端，小心地将蔗糖-ACSF溶液滴加到已固定的脑组织表面，随后缓慢浸没切片机的切削室。调整标本托盘，使切削面（即，最先接触刀片的组织为脑的腹侧表面 ⁴⁰.
   7. 使用弯曲的玻璃微孔滤器蜡烛通入碳酰气（carbogen）Ø 6 mm）移至切片室（可选）。
   8. 将剃刀刀片调整至约15°的角度° 参照水平面 ⁵. 切取冠状脑切片 ~500 µm，方向由尾侧至鼻侧，到达黑质前将厚度减小至300 - 350 µm厚的含有目标区域的切片。
   9. 使用连接在注射器上且与剃须刀片边缘平行的极细灌注针，从组织块中分离切片。将针头弯曲成90度角。° 针头与注射器之间。从组织块上取下切片时，确保不对剃刀刀片施加任何压力。
5. 保存切片
   1. 使用玻璃巴斯德移液管（连接橡胶吸头）的最大开口将切片转移至储存室。待所有切片转移至储存室后（Christoph Schmidt-Hieber，个人交流），将水浴温度升至34 °C。 °C，0.5 - 1 小时。
   2. 关闭水浴，将脑片置于室温下。调节碳合气压力，以避免脑片在储存室中移动。在开始记录前，再静置脑片10至20分钟。
   3. 切片操作结束后，用双蒸水仔细且彻底地清洁设备和微滤烛式滤器。

4. 黑质神经元中的双体细胞和体树突记录及生物胞素填充

1. 参照《Axon 手册》及参考文献中所述，组装用于脑片的膜片钳装置。 ^39,40,47有关膜片钳更基础方面的信息见参考文献。 ⁴⁸.
2. 准备记录室
   1. 在记录室中加入1-2 mL双蒸水，检查是否漏水。将记录室置于可移动的x-y平移台上。
   2. 通过无氧渗透性灌流管路系统（聚四氟乙烯）向记录室灌注标准人工脑脊液（ACSF）。将记录室内的灌流速度稳定在 4 - 5 mL min⁻¹。^-1将连接盛有ACSF的烧杯与记录室的管路长度保持在尽可能短的范围内（1 m）。
   3. 从储存室中选取一个脑切片，使用玻璃巴斯德吸管的最大开口将其转移至记录室。用铂金丝环覆盖切片，将其固定在记录室底部，如参考文献第201页所示。 ³⁹. 使用一个扁平的铂金环（Ø 1.5 cm）并平行粘贴尼龙线（间距 >2 mm）于其上。
3. 调整并优化光学系统
   1. 使用红外（IR）视频显微镜观察切片 ^4,47,49,50调整科勒照明 ⁵¹ 并优化微分干涉差（DIC）对比度 ⁵¹ 光学或斜射照明（Dodt梯度反差 - DGC） ^52,53. 有关该实验步骤的更多细节参见参考文献。 ^40,49.
   2. 检查切片质量。仅保留表面光滑均匀、对比度不过强、仅有少量分散小凹坑的切片。
   3. 用细胞内液填充2支全新且未使用过的膜片钳电极（尖端开口）表3使用含有电极内液的0.5 mL离心管，通过毛细作用将电极尖端充满溶液。对于无 filament 的电极，可将连接注射器的管路对电极末端施加负压，以加快尖端填充速度。
4. 将移液管置于切片表面的上方
   1. 检查银丝（浴液参比电极和膜片电极）上是否存在氯化层（具体细节参见 The Axon Guide 及参考文献） ^39,54).
   2. 依次将移液管插入移液管架中，并使用连接移液管架、三通阀和压力计的管路系统施加正压（约70 mbar）。 ⁴⁰将移液管放入记录室的灌流液中。
   3. 检查压力计上的压力值在约1 - 2分钟内是否保持恒定。如果压力下降，请检查管路或移液管 holder 内部的密封 O 形圈。
   4. 将移液管尖端置于视频监视器中央，并确保其未被遮挡。在对移液管施加或释放压力时，确保移液管尖端不发生移动。
   5. 通过在显示器中心精确位于移液管尖端位置处绘制一个小十字，检查移液管尖端的漂移和振动情况，并观察尖端在5分钟内可能发生的移动。
   6. 施加一个电压阶跃（5 mV）以在示波器上监测移液管电阻。将膜片钳放大器的保持电位设置为 0 mV。调节移液管偏移电位，使放大器表头显示的移液管直流电流为零。 ^39,51.
   7. 将移液管下移至切片并保持在其表面之上。
5. 选择并膜片钳制具有长树突的神经元
   1. 在黑质内选择一个具有较长树突的健康神经元，其树突可在近似同一平面上追踪较长距离图1A 和 1B) 使用红外-Dodt梯度反差（IR-DGC）技术。选择表面光滑且均一的细胞体。避免切片表面对比度过强的两个细胞图1C 以及 1D），因为难以形成穿孔，并且难以长时间维持稳定的记录条件（稳定的串联电阻）。选择那些胞体位于10 - 30 µ位于切片表面下方。
   2. 将胞体电极移至靠近胞体的位置（40 - 50 µm远处）以及将树突电极置于与树突相同距离的位置。使用2倍放大倍率（四倍转接器）来选择并封接树突的一段区域。在显示器上，不额外放大（1X）时获得2,100倍的绝对放大倍率，使用2X时获得5,500倍的绝对放大倍率  放大倍数
   3. 轻微释放胞体记录电极的负压，降低10 mbar。如有必要，调节树突和胞体电极的压力，以避免脑片内细胞结构（胞体和树突）发生位移。
   4. 将树突记录电极移至靠近膜的位置，以观察到轻微的膜凹陷。释放电极尖端的压力，同时监测电极电阻，对树突进行封接。在理想条件下，仅需极轻微的负压即可形成良好的封接。
   5. 保持树突电极在细胞附着模式。将胞体电极移近胞体膜并形成胞体膜封接。在破膜前，确保获得高封接电阻。> 1 GΩ) ³⁹. 将两根移液管从膜上略微回撤数微米 µm以避免细胞体和树突发生变形。
   6. 对于这两种移液管，应尽可能降低电流阶跃上方移液管电容瞬变的幅度，方法是使用高增益且滤波较少的电压脉冲。 ⁵¹ 以及示波器。先用树突电极进入全细胞模式，随后用胞体电极进入全细胞模式。
   7. 消除全细胞电容瞬变并补偿串联电阻。在实验开始时及实验过程中定期监测并记录接入电阻。如果串联电阻过高（>50 MΩ），更换另一支移液管重试。
   8. 采集红外差分干涉相衬图像（IR-DGC）图1A 和 1B）并使用视频图形打印机 ²⁵，高倍和低倍下的帧抓取器或数码相机。
      注意：记录过程中神经元的肿胀（图1E 和 1F）偶尔可被观察到，但当溶液的渗透压和pH值正确调节时，这种情况很少出现 ³⁹.
   9. 采用相同的方法获取双体细胞全细胞记录（胞体 - 胞体）图 2A).
6. 依次使用胞体和树突电极施加长时程（数百毫秒）递增的去极化电流脉冲，以诱发动作电位（APs）图2B, 3C 和 3D同时记录树突和胞体电极处的膜电位。
7. 检测人工兴奋性突触后电位（aEPSPs）在多巴胺能神经元中的传播
   1. 创建一个兴奋性突触后电流（EPSC）波形，用于在双电流钳记录期间作为电流指令注入图4A 和 4B）。为此，构建一个双指数函数，其幅度和时间过程参数对应于在目标神经元中测得的兴奋性突触电流（EPSCs）的实际值 ⁵⁵仔细控制构建的兴奋性突触电流（EPSC）和注入的 EPSC 波形的采样率，以保持其原始的时间进程。
      注意：在真实神经元中应用波形之前，先使用模型细胞进行测试。
   2. 依次通过树突和胞体电极注入波形，并同时记录胞体和树突电极所测得的电位。定期检查电极是否可能发生漂移。
8. 终止对神经元的记录
   1. 使用低倍镜（物镜：5X 或 10X）拍摄红外微分干涉差显微图像，记录神经元在脑片中的位置及电极的位置。
   2. 依次缓慢而轻柔地将树突和胞体记录电极从神经元膜上撤出，以使两个电极均形成外向-out膜片。通过一系列侧向-向上的移动移除电极 ³⁸最初应较短，随后逐渐增加时长。这种记录构型有利于细胞膜的正常闭合。
   3. 在电压钳模式下，通过施加 5 mV 电压脉冲，监测电容电流的减小（访问电阻的增加），同时撤回电极。
   4. 一旦膜与移液管尖端形成封接，立即将其完全移出记录浴槽。将物镜移出浴液。将脑片保留在记录浴槽中 15 - 20 分钟 在标准ACSF中孵育，以使记录神经元内的生物胞素（来自细胞内液）达到平衡。
   5. 使用巴斯德移液管的宽口端将切片轻轻转移至一个含有标准ACSF的25 mL广口棕色玻璃瓶中。用瓶盖密封瓶口。固定步骤见第6段。

5. 细胞贴附记录

1. 选择一个具有在相同平面上延伸较长距离树突的神经元。确保目标树突可被追踪至结构清晰的胞体。
2. 用电极溶液填充膜片电极（patch pipette）表 4设计细胞贴附式记录溶液，通过加入特异性药理学试剂阻断其他离子通道，以记录目标电流。
3. 以细胞贴附模式对树突进行膜片钳制
   1. 可视化树突的一部分，并使用操纵器将记录电极移向树突。通过观察压力计将电极尖端的压力调节至70 - 80 mbar，以避免树突移位。按照4.5.4节所述方法对树突进行膜片钳制。
   2. 记录一些红外差分干涉相衬显微镜（IR-DIC）图像图 5A）。尽量获得尽可能大的封接电阻（>1 GΩ ³⁹），最好在 3 - 10 G 之间Ω 用于细胞贴附式记录 ¹⁸ (图 5B）。将移液管从膜上回撤数微米 µm以避免树突变形。
   3. 在细胞贴附模式下观察反映黑质神经元自发动作电位的动作电流。在ACSF中添加Ca²⁺ 和 Na⁺ 通道阻滞剂（CdCl₂ 以及TTX，以抑制动作电流。
   4. 从 0 mV 的钳制电位施加一个持续 2 秒、-90 mV 的电压阶跃至膜片，以诱发 I_h (图 5C）。请注意，在细胞贴附模式下，移液管电位与静息膜电位呈串联关系 ⁵⁶有关更多详细信息，请参见《Axon 指南》和参考文献。 ³⁹.
   5. 定期检查移液管是否可能发生漂移。
   6. 记录结束时，击破膜片以进入全细胞模式，并立即读取膜电位。按照第4.8.2和4.8.3节所述步骤回撤电极，以获得外向-out膜片。
4. 在全细胞模式下记录相应的胞体
   1. 沿树突观察并定位相应的胞体。使用高阻抗移液管（5 - 10 MΩ）。Ω) ^6,14,57 用 K 充满⁺-基于的细胞内溶液（表3对移液管尖端施加短暂的负压，以破裂膜从而进入全细胞记录模式。
   2. 通过施加长时间的超极化和去极化电流阶跃，在电流钳模式下检测神经元的身份特性图 5D）并让生物胞素沿树突扩散。施加短暂的去极化电流脉冲以观察动作电位的时间进程。
   3. 在 ≤10 分钟后，撤回电极以获得外面向外膜片，具体操作见第 4.8.2–4.8.3 节。使用巴斯德移液管的宽口端轻柔转移脑片，放入含有标准人工脑脊液（ACSF）的 25 mL 棕色玻璃瓶中。盖紧瓶盖。
   4. 或者，首先使用含有荧光染料的电极内液获得胞体全细胞记录，待染料扩散后，选择一段树突进行记录 ²⁶使用第二个移液管，以细胞贴附模式对树突进行膜片钳记录。如有条件，可使用共聚焦显微镜以增强荧光标记树突的可视化效果。 ^14,22.
   5. 在细胞贴附记录之外或同时，采用外向-out配置进行树突记录 ^10,22. 见从膜外面向外式膜片记录到的电压门控电流的一个示例，记录于 图5E 和 5F.

6. 黑质神经元的生物胞素标记

1. 组织固定
   1. 如果可能，将切片记录和组织化学处理分别在不同的房间进行³⁸。
   2. 使用巴斯德吸管将人工脑脊液（ACSF）替换为含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）。始终使用新鲜配制的固定液（<< 1周内）。
      注意：由于多聚甲醛具有毒性，操作时必须佩戴合适的手套，并在组织学实验室的通风橱中进行。使用前请阅读该危险品的安全数据表，并查阅有关化学品安全的法规（如欧盟委员会《危险物质指令》(67/548/EEC)），因为该粉末被认为具有致癌性。其他细节见参考文献⁵⁸。
   3. 将切片置于4 °C过夜。避免多聚甲醛污染膜片钳装置或任何用于电生理实验的设备。
   4. 固定后，用PBS替换固定液。使用不同的巴斯德吸管分别移除固定液和加入PBS。在进一步处理前，将切片保存于4 °C的PBS中（1–2周）。在此期间，每周更换两次PBS。始终使用新鲜配制的PBS（<< 1周内）。
2. 组织染色
   1. 准备一个24孔细胞培养板用于染色步骤。使用洁净的器械转移切片。用新鲜PBS清洗切片，每次5分钟，共3次。
   2. 在4 °C下，用含Fluorescein Avidin DCS（Avidin D，细胞分选级；每毫升Triton X-100中含1 µL荧光素）和0.3% Triton X-100的PBS溶液孵育切片过夜。整个染色过程中需避光。作为荧光标记的替代方案，也可使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）对神经元进行标记，用于光镜或电镜分析^21,58。
      注意：Triton X-100具有危险性。使用前请阅读安全数据表及欧盟委员会相关指令。
   3. 用PBS清洗3次，每次30分钟 ，随后用PB（磷酸缓冲液）清洗，以避免切片表面形成结晶。
3. 将切片小心地贴附于标准载玻片上。用封片介质完全覆盖切片，避免封片介质中产生气泡。轻柔地加盖盖玻片，确保完全覆盖切片。在显微镜观察前，将载玻片室温下干燥过夜。
4. 观察后，将标记好的切片于4 °C保存。有关组织化学操作的实用技巧见参考文献^58,59。
5. 分别清洁用于组织化学和电生理实验的设备。切勿将组织化学与电生理实验设备混用。

7. 生物胞素标记神经元的事后 可视化

1. 使用共聚焦显微镜观察回收神经元的形态。
   1. 使用落射荧光显微镜在脑片中大致定位荧光标记的神经元。观察神经元的树突分支，识别轴突及轴突膨大（2 - 4 µm Ø使用10倍或20倍物镜记录轴突的走行路径。
   2. 切换至共聚焦显微镜，并选择488 nm激光二极管以激发标记神经元中含有的荧光素。沿z轴追踪轴突和树突的延伸。
   3. 按顺序记录连续图像，以获取整个细胞的z轴图像序列（z-stack）。将z轴的分辨率（连续图像间的距离）调整为0.5 - 1 µm. 使用低倍（10倍物镜）和高倍（60倍物镜，油浸）放大倍数采集细胞的共聚焦图像。
   4. 使用成像软件（ImageJ）打开共聚焦显微镜获取的神经元图像文件 ⁶⁰将z轴投影图像与红外微分干涉相差（IR-DGC）图像进行目视比对，以在电生理记录过程中精确定位膜片电极的位置。图1、图2A、图3A、图4A、图5A和图5E).
   5. 确定标记神经元的形态测量参数：测量轴突与胞体之间的距离、沿胞体-树突区域记录电极之间的距离，以及树突电极与轴突之间的距离，使用 "测量" ImageJ 中的功能
   6. 使用 NeuronJ（ImageJ）、Imaris 重建部分神经元²⁹ 或 Neuromantic ⁶¹.

8. 电生理数据的分析

1. 使用与放大器配套的软件包对数据进行初步分析（例如，Clampfit）或直接使用其他数据分析软件，例如 Stimfit（一款开源软件） ^62,63 如我们在最近的出版物中所述 ¹³ 或例如 WinWCP。

结果

上述方案旨在促进利用树突膜片钳记录技术采集数据。post hoc 组织化学与该技术相结合，有助于深入理解起源于树突或在树突中传播的多种电信号的机制。尽管使用膜片钳电极直接接触树突存在较大难度，但若在若干方法学细节上给予特别关注，将可提高记录的成功率。对于已熟练掌握稳定胞体记录技术的实验人员而言，通常可在大多数尝试中获得高阻封接（GΩ级）并完成实验。每次脑片制备过程中可获得一至两次高质量的树突记录。

获得含有健康胞体和树突的高质量脑片是记录这些精细结构的前提条件（图1）。筛选此类神经元的标准是：细胞表面光滑均匀，在光学系统调节至最佳状态时，胞体和树突的对比度较低（图1A 和 1B）。选择对比度过强的神经元通常会导致记录不稳定（图1C 和 1C），因此应避免使用此类神经元。

与其他神经元相比，黑质多巴胺能（DA）神经元表现出特定的形态学和电生理学特征。这些特征通常可通过单个胞体电极记录进行评估，也可在双胞体记录（图2）和胞体-树突记录（图3）中观察到。长时间的超极化电流注入会引发膜电位整流现象，称为“下垂”（sag）（图2B 和 5D）。轴突通常起源于树突部位，该结论基于多种互补性标准确定^13,25,26，表明这些神经元的树突区室具有异质性（图3A–3B）。因此，动作电位（AP）最先出现的区室即为轴突发出的区室（图3C–3D）^13,25,26。轴突末端通常表现为轴突膨大（axonal bleb），这是切片过程中轴突被切断所致⁶⁴，但该结构并非总能被系统性地检测到。

黑质多巴胺能神经元在激活 I_h 后出现明显的下垂电位（sag），提示其高表达 HCN 亚基。为了确定 I_h 对突触信号整合的影响，在体树突双记录过程中，通过树突记录电极注入模拟的突触样电流（EPSC）波形⁵⁵（图4）。这些模拟 EPSC 的动力学参数基于真实自发 EPSC 的上升和衰减时间常数。所引发的 aEPSP 由胞体电极记录。浴施用 I_h 阻断剂 ZD 7288 后，aEPSP 的持续时间延长，表明 I_h 参与调控突触信号的时间进程（图4B）。ZD 7288 还消除了膜电位的整流现象，证实该下垂电位由 I_h 激活所致（图4C）。采用模拟 EPSP 所得结果可与电刺激诱发 EPSP 的实验结果相互印证⁶⁵。为了精确定位 HCN 通道在多巴胺能神经元体树突区域的分布，实施了细胞贴附式记录（图5）。细胞贴附式记录必须形成高阻封接（>> 1 GΩ）（图5B）。在多巴胺能神经元的树突中，I_h 在长时间超极化电压阶跃下缓慢激活，其电流稳态需数百毫秒才能达到（图5C），这与先前研究结果一致⁶⁶。该现象表明，多巴胺能神经元树突中表达的 HCN 通道亚基与锥体神经元或其他细胞类型的 HCN 通道亚基有所不同^10,16,66。由于该通道在树突区的分布可能不均一，且树突区本身具有异质性，因此需将红外差分干涉对比（IR-DIC）图像与生物胞素染色后的共聚焦图像进行比对，以确定树突的身份（轴突起始树突或非轴突起始树突）（图3A 和 B）。因此，无论是进行体树突双记录，还是通过后续的胞体全细胞记录实施细胞贴附式记录，均需恢复细胞形态。

图1. 利用红外视频显微镜观察黑质多巴胺能神经元的胞体和近端树突。（A） 黑质DA神经元的红外差分干涉对比（IR-DGC）图像，显示了胞体和近端树突，以及分别位于胞体和树突的记录电极。对该健康神经元成功进行了双部位（胞体-树突）记录。注意在整个胞体-树突区域对比度较低，表面平滑。（B） 另一个健康DA神经元的示例。（C） 表面较粗糙且不均匀、对比度较强的DA神经元。尽管获得了双记录，但由于两个电极的接入电阻逐渐升高，记录稳定性欠佳，持续时间较短（约15分钟）。（D） 另一例DA神经元，其胞体和近端树突对比度显著增强。在此情况下，全细胞模式建立后不久即观察到接入电阻急剧上升，尝试通过负压降低电阻未获成功。图C和D中的神经元可能在切片过程中受损，应避免用于实验。（E） 在一个健康DA神经元中，双胞体记录开始时的同步记录图像。（F） 与图E为同一神经元，约17分钟后出现胞体肿胀。注意此时完全缺乏对比度，胞体呈球状，可见明显的大细胞核，而该特征在健康神经元中并不明显。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 对多巴胺能神经元进行同时双胞体记录。（A） 对多巴胺能神经元进行双胞体记录期间的红外差分干涉（IR-DGC）图像。（B） 注入持续1秒的超极化和去极化电流（-160 至 80 pA，步长 80 pA），并用两个膜片电极同时记录到相应的电压变化。注意，在长时间超极化电流脉冲下电压轨迹中出现的“下陷”（sag）现象，以及去极化电流脉冲期间动作电位（AP）后出现的大程度后超极化。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 多巴胺神经元中的双通道体树突记录 （A） DA神经元的IR-DGC图像。树突与胞体电极之间的距离为29 µm。 （B） 共聚焦z轴投影图像显示面板中的神经元 A 用与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的亲和素标记。记录过程中神经元内灌注了生物胞素。轴突起始于靠近胞体的近端树突，如箭头所示。 (C) 同时进行A图神经元的双体树突全细胞电压记录。通过胞体电极（左侧；黑色电流迹线）和树突电极（右侧；红色电流迹线）分别注入持续1秒的电流脉冲，在胞体（黑色电压迹线）和树突（红色电压迹线）记录到的动作电位（AP）。 (D) 动作电位在胞体和树突中的传播以扩展的时间尺度显示。无论是胞体还是树突注入电流，胞体动作电位（黑色）均先于树突动作电位（红色）出现。在此神经元中，胞体与树突动作电位之间的延迟分别为120 µs（胞体电流注入）和210 µs（树突电流注入）。延迟时间定义为动作电位上升相中达到半峰幅时的时间差。动作电位首先出现在轴突起始段附近的胞体区域，这一结果与先前的观察一致 ^25,26在此情况下，树突记录来自无轴突的树突。有关来自含轴突树突记录的一个示例见参考文献。 ¹³ （见其图1）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 4. 人工兴奋性突触后电位（EPSP）在多巴胺能神经元体树突轴上的传播。（A） 多巴胺能神经元的红外差分干涉对比（IR-DGC）图像。树突与胞体记录电极之间的距离为 45 µm。两个膜片钳电极均处于全细胞电流钳记录模式。（B） 通过树突电极在电流钳模式下记录到的电流（上图），用于生成人工 EPSP。该电流通过树突记录电极注入一个类似兴奋性突触后电流（EPSC）的波形（上升时间常数 τ_rise = 0.6 ms；衰减时间常数 τ_decay = 3 ms；幅度 = 100 pA）而获得⁵⁵。下图为在对照条件下（黑色）和浴施加 I_h 阻断剂 ZD7288（30 µM；红色曲线）后，在胞体记录到的传播性 aEPSP。每条电压轨迹均为 40 次单次扫描的平均值。可见在 ZD7288 存在时 EPSP 持续时间显著延长，表明 I_h 对 EPSP 时间进程具有贡献作用。（C） 在对照条件下（黑色）和施加 30 µM ZD 7288 后（红色），对长时程（30 pA；1 s）超极化电流脉冲所记录的胞体电压轨迹。注意在 I_h 被阻断后，膜电位整流现象（sag）消失。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5. 多巴胺能神经元树突中I_h 电流的存在。（A） 一个多巴胺能神经元的 IR-DGC 图像及位于近端树突上的记录电极。（B） 在细胞贴附模式下，施加 5 mV 电压指令时的电容电流和漏电流。本示例中的封接电阻为 5 GΩ。（C） 从 0 mV 膜电位施加一个超极化电压阶跃（90 mV；上方），诱导出缓慢激活的 I_h 电流。该电流迹线经反转后，用单指数函数拟合，得到时间常数 τ = 632 ms。（D） 全细胞记录的胞体（见 A 图）对持续 1 秒的超极化和去极化电流脉冲（-160 至 120 pA，步长 40 pA）所产生的电压响应。全细胞记录在细胞贴附记录完成后进行。注意，由于在细胞外施加了 TTX 和 Cd²⁺ 以抑制细胞贴附记录期间的自发放电，因此未观察到动作电位（APs）。这些电压门控 Na⁺ 和 Ca²⁺ 电流阻断剂被添加以抑制动作电流。A–D 图来自同一个神经元。（E） 另一个多巴胺能神经元的 IR-DIC 图像及树突上的记录电极。（F） 在 E 图神经元近端树突制备的外向膜片中，通过测试脉冲至 0 mV（前脉冲为 -120 mV，持续 50 ms）所激活的电压依赖性电流。保持电位为 -80 mV。注意电流的时间依赖性失活现象。请点击此处查看该图的高清版本。

物质	g/mol	浓度	配制 1 L 所需量
NaCl	58.443	125 mM	7.305 g
NaHCO3	84.007	25 mM	2.100 g
KCl	74.551	2.5 mM	0.186 g
NaH2PO4	137.99	1.25 mM	0.172 g
葡萄糖	198.17	25 mM	4.95 g
MgCl2	1 M (溶液)	1 mM	1 mL
CaCl2	1 M (溶液)	2 mM	2 mL
渗透压：~ 310 mOsmol/L（最佳范围：314 – 325 mOsmol/L），pH = 7.4

表1：人工脑脊液（ACSF）。

物质	g/mol	浓度	配制 1 L 所需量
NaCl	58.443	87 mM	5.084 g
NaHCO3	84.007	25 mM	2.1001 g
KCl	7.551	2.5 mM	0.18637 g
NaH2PO4	137.99	1.25 mM	0.17248 g
MgCl2	1 M (溶液)	7 mM	7 mL
葡萄糖	198.17	10 mM	1.9817 g
蔗糖	342.29	75 mM	25.672 g
CaCl2	1 M (溶液)	0.5 mM	0.5 mL
渗透压：约 326 mOsmol/L，pH = 7.4

表2： 制备脑片用的蔗糖-人工脑脊液（sucrose-ACSF）。

物质	g/mol	浓度	配制 100 mL 所需量
KMeSO4	150.2	120 mM	1.8024 g
KCl	74.56	20 mM	0.14912 g
MgCl2	1 M (溶液)	2 mM	200 µl
Na2ATP	551.1	2 mM	0.1102 g
Na2GTP	523.2	0.5 mM	0.02661 g
Na2-磷酸肌酸	255.1	5 mM	0.1275 g
EGTA	380.4	0.1 mM	3.803 mg
Hepes	238.31	10 mM	0.23831 g
生物胞素	1 mg/mL		0.1 g
渗透压：约 302 mOsmol/L，用 KOH 调节 pH 至 7.2

表3： 双记录用细胞内溶液。

物质	g/mol	浓度	配制 100 mL 所需量
KCl	74.56	120 mM	0.8947 g
CaCl2	1 M (溶液)	2 mM	200 µl
MgCl2	1 M (溶液)	1 mM	100 µl
Hepes	238.31	10 mM	0.23831
TEA-Cl	165.7	20 mM	0.3314 g
4-AP	94.11	5 mM	0.04705 g
BaCl2	244.26	1 mM	0.02443 g
CdCl2	183.32	0.02 mM	0.3666 mg
TTX	1 mM	200 nM	20 µl
渗透压：约 290 mOsmol/L，用 D-葡萄糖调节（参考文献 16）；pH = 7.4

表4：细胞贴附记录用的电极液。

讨论

本报告描述了一种实施双体树突全细胞记录和局部树突记录的逐步操作方案。该方法可用于分别确定离子通道（例如，I_h）对突触后电位时程的影响，并绘制黑质多巴胺能（DA）神经元体树突区域中该离子通道（I_h）的分布情况。所获得的电生理学测量结果与post hoc组织化学技术相结合，以重建细胞形态。该方法最初用于研究位于黑质的DA神经元，但也可推广应用于邻近的黑质GABA神经元、腹侧被盖区DA神经元或其他中脑神经元。所有步骤也可在不作重大修改的情况下，用于研究黑质神经元树突中表达的其他离子通道。Post hoc形态学可视化尤其适用于具有轴突起自树突特征的神经元，例如黑质神经元^25,26、海马区oriens-alveus中间神经元²¹或部分CA1锥体神经元⁶⁷。有趣的是，具有此类特征的神经元似乎比普遍认为的更为常见⁶⁷。形态学分析还可精确揭示电极和轴突的位置。通过免疫组织化学标记轴突起始段表达的蛋白质（如电压门控Na⁺通道或Ankyrin G），可进一步优化对轴突的检测^68,69。

树突记录及后续神经元标记所获得数据的可靠性在很大程度上取决于脑片质量。因此，必须尽最大努力维持组织中细胞的活性。这可通过轻柔对待健康动物、使用高质量的工具与试剂、在整个脑片制备过程中保证组织充分供氧以及保持冰冻温度来实现。稳定记录依赖于健康神经元的选取。在全细胞记录模式下，串联电阻应尽可能低，并在整个实验过程中保持恒定。记录的稳定性还取决于高质量的操纵器，其应无漂移和振动。可通过优化移液管稳定性来减少这些干扰：检查移液管与持管器及前置放大器的连接，确保显微操纵器线缆松弛，避免温度骤变或载物台移动，并检查操纵器的机械结构。对于双细胞记录，使用甲基硫酸盐 ^13,15,21 已加入细胞内液，但使用了葡萄糖酸盐 ^9,14,25 可选择性地使用。然而，主要阴离子可能改变膜电位 ^70,71 以及一些电压依赖性电流 ⁷²细胞内液可添加ATP、GTP和磷酸肌酸以维持神经元的生理功能。此外，可在移液管溶液中加入荧光染料例如，Alexa 594 或 Sulforhodamine 101 ⁴¹) 在进行胞体记录时用于观察树突，例如可用于定位压力施加位置（参考文献7中的图7） ⁴¹）或电刺激移液管。用于细胞贴附记录的移液管溶液含有高浓度 K⁺ 浓度且无钠⁺ 记录大规模 我_h值得注意的是 Na⁺/⁺ 浓度比影响电流幅度 ¹⁰，该电流的反转电位 ¹¹ 以及门控的 我_h ⁷³或者， 我_h 也可以使用外向-out记录 ¹⁰然而，在这种记录构型中，通道附近细胞内的微环境可能会受到干扰。因此，电压依赖性激活方面可能存在差异。 我_h 在比较使用细胞贴附式膜片和外向式膜片所获得的电流时，可观察到这一现象 ¹⁰在膜片钳记录过程中偶尔会遇到神经元肿胀现象，其原因通常各不相同，例如水质不佳、细胞内外溶液之间渗透压或pH值存在显著失衡等 ³⁹ 或溶液配制中的错误。电生理记录的质量直接影响所重建神经元形态的质量。双通道记录使用高阻抗的胞体电极（6 - 10 MΩ，如参考文献所示） ^6,11) 以及在进行细胞贴附记录后进行单细胞体记录，以尽量减少细胞内环境的稀释 ¹⁴因此，全细胞体记录在细胞贴附记录之后保持较短时间（< 10 分钟）。来自胞体和树突电极的外翻膜片对于细胞膜的正常闭合以及细胞形态的后续恢复至关重要。除了细胞结构外，还可对记录到的神经元进行神经化学物质含量的测定。 ^59,74例如，可通过免疫标记细胞内蛋白酪氨酸羟化酶来明确鉴定多巴胺能神经元 ¹³.

多巴胺能神经元主要集中在黑质致密部，而在黑质网状部密度较低，且与数量更多的GABA能神经元相互混杂⁷⁵。尽管多巴胺能神经元的胞体通常比GABA能神经元更大，但通过红外视频显微镜进行视觉识别仍存在不确定性，部分原因是致密部组织的不透明性造成观察困难。为克服这些限制，可通过使用在特定神经元群体中表达荧光标记的转基因小鼠（如TH⁶⁵或DAT标记多巴胺能神经元，GAD标记GABA能神经元）结合落射荧光照明，实现对多巴胺能神经元的预先筛选。此外，也可将荧光染料加入胞体电极溶液中，以利于树突结构的可视化。尼普科夫盘共聚焦显微技术^14,22,30或双光子显微技术⁷与红外微分干涉对比显微技术（IR-DGC）⁶联用，可进一步提高荧光标记细胞的分辨率。相较于微分干涉差（DIC）显微技术，微分干涉对比（DGC）具有多项优势：首先，由于无需使用DIC棱镜，IR-DGC图像可直接与荧光图像叠加^49,52,53,76；其次，DGC可与光刺激及光遗传学技术结合使用⁷⁷。

脑片制备的一个缺点是难以完全保持神经元的完整性。多巴胺能神经元的树突在三个空间平面上延伸^78,79，因此在脑片中无法完全避免树突区的截断⁸⁰。脑片切向的选择（冠状面、水平面或旁矢状面）需要权衡利弊，必须根据神经支配的起源及实验设计来确定合适的脑片切向。

直接树突膜片钳技术用于绘制细胞不同区室中功能性离子通道的分布图。此外，该技术还可用于确定通道功能特性的变异程度²⁰。作为补充，可通过免疫组织化学方法在光学显微镜和电子显微镜水平上确定离子通道的位置和密度^17,23。该方法还能够测定那些无法用膜片钳电极触及的细小结构中的通道密度。然而，这些通道可能处于不同的功能状态²⁴，甚至相较于膜片钳记录所获得的通道而言处于失活状态。因此，要全面了解特定细胞区域中离子通道的位置及其特性，这两种技术都是必要的¹⁷。随着电压敏感性染料的发展，电压成像已被用于在多个位点检测神经元中动作电位（APs）和兴奋性突触后电位（EPSPs）的传播情况⁸¹。作为一种双膜片钳记录的替代方法，该技术甚至可用于无法用膜片钳电极记录的细小树突，但需要对信号进行精确校准并进行平均处理。

尽管在生理和病理生理条件下，通常通过胞体记录来广泛研究黑质（SN）和腹侧被盖区的多巴胺能神经元，但在这两种条件下，这些神经元树突的功能特性在很大程度上仍不清楚。已有多个研究团队成功实现了对黑质多巴胺能神经元树突的膜片钳记录^13,25,26，该方法仍是解析这些精细亚细胞结构可兴奋特性的首选手段⁸。树突记录为进一步深入研究突触传递的效率与可塑性，以及树突兴奋性的可塑性提供了可能^82,83。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双蒸馏水	Millipore	超级Q	电阻率 >14 MΩ 厘米，理想值为18.2 MΩ 厘米，25 °C，经滤膜过滤（0.22） µm)，https://www.merckmillipore.com/BE/zh/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
微滤烛式滤器	Robu	孔隙度，直径 3、6 mm 或 13 mm
带有振动探针的组织切片器	Leica	VT1200	切割参数：速度 0.07，振幅 1.40
组织切片器	Dosaka	DTK-1000	切割参数：速度 4，频率 7
剃刀刀片	吉列	超级银
解剖工具	布劳恩，埃斯库拉普
预留室			定制
PP 贝克尔斯	VWR	213-1725	400 ml
注射器滤器	默克密理博	Millex - GV 0.22 µm
氰基丙烯酸酯胶水	UHU	"瞬间胶"	液体胶水
记录室	Luigs &和诺伊曼	切片微型培养室
水平式移液器拉制仪	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
移液器	Hilgenberg	1807524	外径2 mm、内径1 mm的玻璃毛细管，末端经火焰抛光并清洗
牙科蜡	科尔特ène/Whaledent		正畸托盘蜡条
铂金网格			使用自制的铂金圆盘将脑片固定在记录室中
显微操作仪	Narishige	MF-830	拉制毛细管尖端火焰抛光
硫酸甲酯钾	MP Biomedicals	215481
生物胞素	分子探针	B1592
压力计	GREISINGER electronic	GDH 13 AN
显微镜	Zeiss	FS
Dodt梯度反差	Luigs &和 Neumann
操作器	Luigs &和 Neumann	LN Mini 25
图像采集卡	The Imaging Source	DFG/USB2pro
相机	DAGE-MTI	NC-70
聚光镜	Zeiss		高数值孔径油浸式聚光镜
目标	Zeiss	W Plan复消色差物镜 441470-9900 VIS-IR	63倍放大、长工作距离、高数值孔径1.0水浸物镜
四重改变器	Luigs &和 Neumann		在相机与显微镜之间
黑色 &黑白视频监视器	索尼	SSM-175CE	16英寸，850电视线，模拟
样品瓶，琥珀色玻璃，带瓶盖	VWR	215-2409	将切片从实验装置转移至组织学实验室
轴突指南	Molecular Devices		书籍
Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit		电生理数据的分析
多聚甲醛	Sigma	441244	使用前请参阅安全数据表及欧盟危险物质指令
细胞培养板	Greiner-Bio-One	662160	用于固定切片的染色
Triton X-100	Merk	108643	使用前请参阅安全数据表及欧盟危险物质指令
小鼠抗TH单克隆一抗	Immunostar	22941	工作浓度：1/1,000
山羊抗小鼠二抗 - Alexa Fluor 568	Invitrogen - 赛默飞世尔科技	A-11031	工作浓度：1/500
正常山羊血清	Dako	X0907
ProLong Diamond 抗荧光淬灭剂	Molecular Probes - 赛默飞世尔科技	P36961
荧光素亲和素 DCS	Vector Lab	A-2011
共聚焦显微镜	Olympus	FV1000
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ	http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/		ImageJ 插件
Imaris	http://www.bitplane.com		生物素填充神经元的重建
Neuromantic	http://www.reading.ac.uk/neuromantic/		生物素填充神经元的重建
WinWCP	http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm		电生理数据的分析