对称双半球尸检脑组织切取技术用于研究人类健康与病理脑状态

摘要

系统化的脑组织切片程序对于将特定的神经精神现象与明确的神经病理学诊断相关联至关重要。根据不同的临床与学术需求，脑组织切片方法存在多种差异。本方案描述了一种对称的双半球脑切片程序，旨在研究人类脑病理学中的半球差异，并最大限度地利用当前及未来的生物分子/神经影像技术。

摘要

神经病理学家有时会因需要掌握大量知识才能对那些被要求进行脑尸检的患者所描述的复杂神经精神现象做出明确诊断而感到压力巨大。尽管生物医学科学和神经影像学的进步已彻底改变了神经精神疾病领域，但这些进展也产生了一种误导性观念，即脑尸检仅具有验证性价值。这种错误观念导致尸检率急剧下降，从而减少了开展更详尽、更广泛神经病理学研究的可能性，而这些研究对于理解人类大脑众多尚未明确的正常与病理特征至关重要。将观察到的神经精神现象与其可能的神经组织学改变进行定位和特征关联的传统推断方法，仍然具有不可否认的价值。在神经精神疾病领域，传统的临床-病理学方法仍是将独特的神经精神特征与其相应的神经病理学基础进行关联的最佳（且常常是唯一可行）的方法，因为它依赖于对脑组织的直接物理评估。死后脑组织的评估基于不同神经病理学中心所采用的脑切片技术，这些技术各不相同。脑切片操作通常根据各机构具体的临床和学术需求，以相对广泛且系统的方式进行。为了深入、连贯地研究人类大脑在正常与病理状态下的特有表现，至少在人类神经病理学研究中，应采用一种解剖结构更全面、双侧半球对称的脑切片方法。即，特定功能的半球特化与偏侧化）。该方法将为当前及未来的生物技术与神经影像学技术提供更多经过完善神经病理学表征的脑组织样本。本文描述了一种对称性双半球脑组织切片技术，用于研究人类脑病理中的半球差异，并适用于当前及未来的生物分子/神经影像学技术。

引言

神经病理学家拥有评估人类大脑的科学特权、学术荣誉和诊断责任。几十年来，人们已对脑部疾病进行了详尽的临床描述，并大力探索这些疾病在人类死后脑组织中可能存在的神经组织学相关性。从历史上看，这些努力代表了现代医学科学，尤其是神经病学领域取得进展的最有效途径。得益于先前杰出的神经病理学家及其奉献精神、决心、学术造诣以及辨别正常与异常脑组织的惊人能力（通常使用非常简陋的工具），我们现在能够研究并针对阿尔茨海默-佩鲁西尼病（不公正地仅被称为阿尔茨海默病；APD/AD）¹、帕金森病（PD）²、克罗伊茨费尔特-雅各布病（CJD）³、卢·格里克病/肌萎缩侧索硬化症（ALS）⁴ 和关岛病⁵ 等疾病开展工作，仅举数例。

先进的神经影像学技术，例如高分辨率计算机断层扫描（即多层螺旋CT扫描；CT血管成像），功能性和形态学磁共振成像（即， fMRI，扩散MRI，示踪成像MRI 等等。）、正电子发射断层扫描（PET）、基于超声的成像技术及其他方法，无疑改变了我们诊断和治疗神经及精神疾病患者的整体策略。然而，尽管神经影像学技术能够在个体存活时观察其大脑，但它们无法在发生时刻直接分析细胞（如神经元）高度复杂的细胞及亚细胞结构，也无法可视化、标记并定量特定类型的细胞内病变，或在环路及亚环路解剖水平上精确定位其神经解剖学或亚区域位置。例如，神经影像学....

方案

涉及尸体人类组织的程序已由机构审查委员会审核，并根据《联邦法规》第45篇（Code of Federal Regulations）获得豁免。

注意：本方案描述了一种对称双侧半球脑组织切片法，用于人类死后脑组织的神经病理学评估。有关执行人脑切片所必需的装置、器械、材料和耗材的详细说明将不予详述。脑解剖所需的材料和耗材由各研究者自行选择，并依据各研究机构允许或批准使用的尸检工具而定。本方案所需的最少工具和材料列于材料/设备表中。针对疑似可传播性脑疾病（如人类克雅氏病 CJD）的特定切片程序和防护措施不在本文目标范围内，相关内容可参见其他文献⁷。

1. 对称双半球脑切片

注意：应确保脑组织已接受必要的组织固定处理（例如使用10%中性缓冲甲醛），固定时间通常为两到三周，具体时长取决于围死亡期、代谢（即 pH值）以及组织保存（即 温度）条件。然而，对于影像-病理学相关性研究，建议采用更长的固定时间（>5.4周）⁸。

1. 将脑组织置于一个平坦的表面上，使其朝向检查者，而额极则朝向与检查者相反的方向。
2. 放置脑组织时应确保能够完整清晰地观察到整个大脑半球的所有皮质脑回和脑沟（图1a）。
3. 首先观察脑膜是否存在异常、大脑半球是否有肉眼可见的不对称（可能是局灶性、叶性或广泛性脑萎缩的征象）、肉眼可见的组织病变（例如....

结果

方案时长

单次对称双半球固定脑切片操作所需时间估计为1小时（不包括准备解剖台、工具和切割面，以及标记等所花费的时间）； 等等单次对称双半球交替冰冻与固定脑组织切片过程所需时间估计为2小时。对单个人脑/受试者获得明确组织学诊断可能至少需要4至6周。在死后从颅骨中取出脑组织后，必须进行适当时间的组织固定（至少2至3周）。随后需执行一系列操作流程，包括对称双半球脑组织切片、组织处理、组织包埋、切块切片、染色及免疫组织化学检测。最终，在得出神经病理学结论之前，还需完成每侧半球各脑区的显微镜下评估，应用共识确立的病理学诊断标准与分类体系，审查临床病历资料，并可能进行临床与病理结果的相关性分析。在规划特定研究项目时，应充分考虑完成整个人脑神经病理学评估所需的全部时间。此外，应向医学同行、科研人员、捐献者家属以及法律主管部门告知完成现代神经病理学评估所需的总时长、复杂性以及团队所需投入的时间与精力。

讨论

这种脑组织切片方法可根据各神经病理学实验室的具体需求进行调整（例如，减少对每个半球进行评估的脑区数量），同时仍保留双侧半球对称切片程序作为其主要特征之一。本建议方案可用于常规操作流程（以研究为导向的神经病理学中心），或仅在必要时使用（特定以临床为导向的研究）。该方法可选择性地仅用于特定类型的研究调查（即， 免疫组织化学）或分子分析（即，基因组学或蛋白质组学分析）。从技术角度来看，值得注意的是，某些病理学差异（尤其是在免疫组织化学中）可能源于免疫组织染色强度的潜在人为变异。通过使用自动染色仪，可显著降低人为染色效应和变异的可能性，从而最大限度地减少此类问题。事实上，目前借助可靠的自动化染色机器人设备，已能在技术上最大限度地减少大多数由技术性人为因素引起的混杂因素。因此，在评估同一受试者的两个大脑半球，或多个受试者的多组大脑半球时，均可获得具有可比性的结果。

此外，在过去几年中，人类大脑中发现的脑损伤数量显著增加³⁹。这些新型脑损伤增加了既往被归类为正常或对照的大脑实际上并不正常的潜在风险。免疫组织化学技术的进步以及新的神经病理.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
签署的知情同意书副本，允许进行尸检及脑组织捐献用于科研。
受试者的详细临床病史，应包括神经系统和精神科症状与体征的详尽描述。
可获得的医学或非医学视频记录（在运动障碍领域尤其有用）。需获得近亲’s 的同意。
神经影像学、神经生理学、神经精神评估或临床量表。
遗传学和家族史资料。如诊断为神经遗传性疾病，需审阅遗传学报告。
组织学容器	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	64233-24
组织学包埋盒	VWR	18000-142 (橙色)
组织学包埋盒	VWR	18000-132 (深蓝色)
刀柄和一次性刀片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62560-04
长刀片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62561-20
一次性刀片用刀柄	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	72040-08
手术刀片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	72049-22
Accu-Punch 2 mm	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	69038-02
聚苯乙烯容器 – 无菌	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	64240-12
解剖板	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63307-30
中性缓冲福尔马林溶液，10%	Sigma-Aldrich	HT501128 SIGMA
苏木精溶液，Gill No. 2	Sigma-Aldrich	GHS280 SIGMA
伊红Y溶液，水溶性	Sigma-Aldrich	HT1102128 SIGMA
抗β-淀粉样蛋白抗体	Covance, Princeton, NJ	SIG-39220	1:500
抗tau蛋白抗体	Thermo Fisher Scientific	MN1020	1:500
抗α-突触核蛋白抗体	Abcam	ab27766	1:500
抗磷酸化TDP43抗体	Cosmo Bio Co.	TIP-PTD-P02	1:2000
数码相机	任意
热封机	Grainger	5ZZ35