本方案描述了一种使用自动化机器人沉积系统的生物打印方法，该方法结合了刻蚀的拓扑引导线索与承载细胞的水凝胶生物墨水的精确沉积。打印的细胞被直接递送至刻蚀结构中，并能够感知并沿其定向排列。
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本文内容
摘要
摘要
本论文描述了一种通过自动化机器人分配系统，在水凝胶生物墨水中引入细胞导向结构，并将细胞直接递送至这些结构的方法。选择该特定生物墨水是因为其允许细胞沉降并感知这些结构特征。该分配系统采用背压辅助打印头，在水凝胶生物墨水中进行活细胞的生物打印。然而，通过将打印头替换为 sharpened stylus 或手术刀，该系统也可用于通过表面刻蚀创建拓扑学提示。stylus 的运动可在 X、Y 和 Z 方向上以 10 µm 的步长进行程序化控制。所形成的图案化沟槽能够引导间充质干细胞定向排列，使其呈现出与沟槽方向一致的伸长形态。这些图案可通过绘图软件设计为直线、同心圆或正弦波形。在后续实验中，成纤维细胞和间充质干细胞被悬浮于2%明胶生物墨水中，用于背压驱动的挤出式打印头进行生物打印。携带细胞的生物墨水随后采用与刻蚀过程相同的程序化坐标进行打印。生物打印的细胞能够感知并响应刻蚀结构，表现为沿刻蚀沟槽方向的伸长取向。
引言
刻意的细胞定位模式可实现模拟的培养物形成 体内 细胞结构1事实上，通过有序组织多种细胞类型的空间分布，可以促进对它们之间相互作用的研究。2,3大多数图案化系统依赖于表面修饰方法，以促进或抑制细胞黏附，随后进行被动的细胞沉积。生物打印则能够对细胞分布实现空间和时间上的精确控制。1除了这些功能外，生物打印还被认为是一种技术上简单、快速且成本效益高的方法，可用于制造几何结构复杂的支架。4它利用计算机设计软件，并允许在制造过程中引入细胞4.
基于工作原理，生物打印系统可分为基于激光、基于喷墨或基于挤出的类型4。其中，挤出式生物打印被认为最具前景，因其可在合理的时间范围内制造出具有临床相关尺寸的有序结构4-6。该方法通过机械或背压辅助的方式，将含有细胞的水凝胶生物墨水进行挤出实现。本文所述方法采用了背压驱动。如前所述，细胞被包裹在具有细胞相容性的生物墨水中进行递送。此类生物墨水应在递送细胞过程中避免产生有害的剪切应力，同时具备足够的黏度，以维持打印线条的结构完整性，防止塌陷或扩散（即所谓的"墨水渗溢"）7-10。
已知细胞与其附着表面的相互作用会影响细胞行为。表面形貌可控制细胞的形状、取向11，甚至表型....
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方案
注意：本方案描述了一种基于背压辅助的机器人分配系统（图1A）作为表面蚀刻（图1B）和基于挤出的生物打印设备（图1C）的使用方法10。
1. 聚苯乙烯表面的修饰
- 使用1 mm的聚苯乙烯片材，因为聚苯乙烯组织培养板在中心区域容易向上翘曲，影响刻蚀和打印高度的一致性。
注意：由于聚苯乙烯片材未经过细胞黏附修饰，需进行等离子体处理。 - 氧气等离子体处理。
- 首先，在连接等离子体设备的氧气瓶调压器上设定压力为2 bar。然后开启等离子体设备，并在设备控制面板上输入以下参数：功率150 W、氧气流量30 sccm、处理时间10 min（分别对应功率、气体流速和时间）。
- 将聚苯乙烯基底放入等离子体腔室，关闭并密封腔门，按下控制面板上的启动按钮。处理完成后，将经氧气等离子体处理的聚苯乙烯基底浸入胎牛血清中，在37 °C孵育2小时，随后用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。
2. 编程打印图案
- 使用程序先用探针或手术刀刻蚀表面。
- 使用触控笔时，将一根直径为1.5 mm的纺织针（从内侧小心插入）插入点胶注射器（5 ml或10 ml）....
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结果
代表性结果表明，背压辅助的机器人分配系统可用作基于挤出的生物打印机，用于执行表面刻蚀和生物墨水打印（图 1 A）。该系统可用于在聚合物表面生成刻蚀沟槽，并随后将携带细胞的生物墨水直接打印至这些结构上（图 1 B 和 C）。
蚀刻和印刷均由程序设定的坐标决定（图2）输入到打印/分配软件中，从而可根据应用需求打印出线性、曲线和放射状图案（图3 A-C）。Z轴设置可用于控制刻蚀凹槽的深度（图4 和 表1).
将探针更换为水凝胶打印头后，原本用于控制刻蚀过程的程序可被重复利用，以驱动机器人分配系统将含有细胞的生物墨水直接递送至按相同设计刻蚀.......
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讨论
该操作的关键步骤是干细胞的实际生物打印递送，此过程必须允许细胞沉降到特定结构中，打印时不发生生物墨水扩散或渗出，递送过程中不产生剪切应力导致细胞死亡，并且不诱导细胞向非目标谱系分化。
如果预期的细胞排列未能实现，则应评估生物墨水的黏度是否适合打印。重要的是，生物墨水应允许细胞沉降到图案化的聚合物表面。可通过降低生物墨水聚合物的浓度或提高其温度（最高不超过37 °C）来降低黏度，促进细胞沉降。然而，这些调整可能导致打印后生物墨水扩散或渗出。本文建议使用2%明胶（w/v）溶于1× PBS中。如果打印后细胞浓度似乎降低，则可能是打印过程中产生的剪切应力影响了打印细胞的活力7。可使用如刃天青荧光激活等活力检测方法，在打印前后检测生物墨水中的细胞活力7。此外，若生物打印的干细胞接触表面但未发生排列，则可能是打印过程中的剪切应力通过触发非预期的分化通路而降低了其多能性。打印后的干性可通过流式细胞荧光分选（FACS）分析进行评估，使用如CD29等干细胞标志物10,19,20。若发现剪切应力对细胞产生不利影响，可通过添加或替换为具有.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究工作由新加坡国家研究基金会（CREATE 计划，NRF-Technion）：心脏修复治疗研究计划中的再生医学倡议项目，以及由科学技术研究局（A*STAR）下属科学与工程研究理事会（SERC）提供的公共部门资助（PSF）2012 年项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器设备 | |||
| 自动化液体处理系统 | Janome | 2300N | |
| 等离子体处理仪 | Femto Science | Covance | |
| USB显微镜 | |||
| 光学显微镜 | Olympus | IX71 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 软件 | |||
| 电子表格软件 | Excel | Excel | |
| 打印坐标软件 | Janome | JR C-Points | |
| 图像分析软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | ImageJ | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 仪器设备 | |||
| 刻划笔（刀片） | OLFA | AK-5 | |
| 5 ml 打印用注射器 | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30 G 打印用针头 | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1 mm 聚苯乙烯板 | 本地采购 | ||
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10270-098 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | ||
| 猪皮来源明胶，凝胶强度 300，A 型 | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| 红色荧光蛋白标记的间充质干细胞（RFP-MSCs） | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
参考文献
- Ma, Z., et al. Cell and Organ Printing. Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P. , Springer. Netherlands. 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys....
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