方法文章

用于细胞表面引导与生物打印的自动化机器人分配技术

DOI：

10.3791/54604

⸱

2016年11月18日

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种使用自动化机器人沉积系统的生物打印方法，该方法结合了刻蚀的拓扑引导线索与承载细胞的水凝胶生物墨水的精确沉积。打印的细胞被直接递送至刻蚀结构中，并能够感知并沿其定向排列。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本论文描述了一种通过自动化机器人分配系统，在水凝胶生物墨水中引入细胞导向结构，并将细胞直接递送至这些结构的方法。选择该特定生物墨水是因为其允许细胞沉降并感知这些结构特征。该分配系统采用背压辅助打印头，在水凝胶生物墨水中进行活细胞的生物打印。然而，通过将打印头替换为 sharpened stylus 或手术刀，该系统也可用于通过表面刻蚀创建拓扑学提示。stylus 的运动可在 X、Y 和 Z 方向上以 10 µm 的步长进行程序化控制。所形成的图案化沟槽能够引导间充质干细胞定向排列，使其呈现出与沟槽方向一致的伸长形态。这些图案可通过绘图软件设计为直线、同心圆或正弦波形。在后续实验中，成纤维细胞和间充质干细胞被悬浮于2%明胶生物墨水中，用于背压驱动的挤出式打印头进行生物打印。携带细胞的生物墨水随后采用与刻蚀过程相同的程序化坐标进行打印。生物打印的细胞能够感知并响应刻蚀结构，表现为沿刻蚀沟槽方向的伸长取向。

引言

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刻意的细胞定位模式可实现模拟的培养物形成 体内 细胞结构1事实上，通过有序组织多种细胞类型的空间分布，可以促进对它们之间相互作用的研究。2,3大多数图案化系统依赖于表面修饰方法，以促进或抑制细胞黏附，随后进行被动的细胞沉积。生物打印则能够对细胞分布实现空间和时间上的精确控制。1除了这些功能外，生物打印还被认为是一种技术上简单、快速且成本效益高的方法，可用于制造几何结构复杂的支架。4它利用计算机设计软件，并允许在制造过程中引入细胞4.

基于工作原理，生物打印系统可分为基于激光、基于喷墨或基于挤出的类型4。其中，挤出式生物打印被认为最具前景，因其可在合理的时间范围内制造出具有临床相关尺寸的有序结构4-6。该方法通过机械或背压辅助的方式，将含有细胞的水凝胶生物墨水进行挤出实现。本文所述方法采用了背压驱动。如前所述，细胞被包裹在具有细胞相容性的生物墨水中进行递送。此类生物墨水应在递送细胞过程中避免产生有害的剪切应力，同时具备足够的黏度，以维持打印线条的结构完整性，防止塌陷或扩散（即所谓的"墨水渗溢"）7-10。

已知细胞与其附着表面的相互作用会影响细胞行为。表面形貌可控制细胞的形状、取向11，甚至表型。特别是，沟槽和通道的制备已被证明可诱导多种细胞类型呈现拉长、伸展的形态。这种形态的形成已被发现会影响多能性和全能性细胞的表型。例如，当沿沟槽排列时，间充质干细胞（MSC）表现出向心肌细胞分化的迹象12,13，而血管平滑肌细胞则倾向于呈现收缩型而非合成型表型10,14-17。

可通过多种方法在聚合物表面生成用于细胞取向的通道或沟槽，例如深反应离子刻蚀、电子束光刻、直接激光打印、飞秒激光、光刻以及等离子体干法刻蚀18。这些方法通常耗时较长，需要复杂的设备，且所生成图案的形状受限。此外，这些技术无法将图案化过程与生物打印同步，也不能实现即时的细胞接种。自动化分配系统可在协调控制下沿复杂路径移动，实现溶液的精确沉积。本文展示了如何利用微尺度可控的运动来创建用于细胞定向的沟道。将 sharpened stylus 或手术刀片安装在打印头上，取代挤出式注射器，设备即可在绘图软件的引导下对聚合物表面进行刻蚀。该方法在图案设计上具有高度灵活性，适用于生物工程中常用的聚合物材料，如聚苯乙烯（polystyrene）、聚四氟乙烯（PTFE）和聚己内酯（polycaprolactone）。在刻蚀完成后的后续步骤中，可直接将细胞生物打印至划出的沟槽内。本文所使用的明胶生物墨水不仅能够保持刻痕结构，还可使沉积的细胞感知刻蚀形成的微结构特征。实验表明，被生物打印至刻蚀沟槽中的间充质干细胞沿沟槽方向显著伸展，形成清晰的线状排列。

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方案

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注意：本方案描述了一种基于背压辅助的机器人分配系统（图1A）作为表面蚀刻（图1B）和基于挤出的生物打印设备（图1C）的使用方法10。

1. 聚苯乙烯表面的修饰

  1. 使用1 mm的聚苯乙烯片材，因为聚苯乙烯组织培养板在中心区域容易向上翘曲，影响刻蚀和打印高度的一致性。
    注意：由于聚苯乙烯片材未经过细胞黏附修饰，需进行等离子体处理。
  2. 氧气等离子体处理。
    1. 首先，在连接等离子体设备的氧气瓶调压器上设定压力为2 bar。然后开启等离子体设备，并在设备控制面板上输入以下参数：功率150 W、氧气流量30 sccm、处理时间10 min（分别对应功率、气体流速和时间）。
    2. 将聚苯乙烯基底放入等离子体腔室，关闭并密封腔门，按下控制面板上的启动按钮。处理完成后，将经氧气等离子体处理的聚苯乙烯基底浸入胎牛血清中，在37 °C孵育2小时，随后用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。

2. 编程打印图案

  1. 使用程序先用探针或手术刀刻蚀表面。
    1. 使用触控笔时，将一根直径为1.5 mm的纺织针（从内侧小心插入）插入点胶注射器（5 ml或10 ml）的喷嘴，直至针头卡紧并固定。若使用手术刀，则选择圆柄手术刀，以便将其固定在打印臂的夹具机构中。
      注意：与手术刀片相比，探针在刻划曲线图案时效果更佳。
    2. 初次尝试创建生物打印排列时，可在带编号坐标轴的方格纸上绘制所需图案，以生成X-Y坐标。然后，将刻蚀/生物打印图案的坐标输入电子表格软件图2).
      注意： "期望的模式" 可以呈现多种形状，例如线形、S形或环形。具体选择取决于所需的实验模型，例如本实验中所示的平行线形图案，用于诱导间充质干细胞向心肌细胞分化。散点图功能可用于可视化所设计的图案布局。
    3. 打开打印/分配软件。选择 "项目 > 添加程序" 随后 "编辑 > 添加点" 设置程序。将从电子表格中获得的 x 和 y 坐标值导出到打印/分配软件中，使用 "复制和粘贴" 功能
    4. 校准 "z" 每次运行前调整机器人的高度，以将触针/打印喷嘴放置到表面。
      1. 在打印/分配软件中，选择 "机器人" 选项，单击 "改变模式" 并实现 "教学模式" 选项。选择后，软件将启用 "慢跑" 机器人的功能。
      2. 开始点动操作前，首先通过从菜单栏选择以下命令将机器人初始化至其默认位置； "机器人 > Meca 初始化"，然后选择 "机器人 > 慢跑". 输入数值（单位：mm） "X 和 Y 插槽" 需要将触控笔精确地放在图案的起点位置。
      3. 接下来，在（以毫米为单位）输入一个数值 "Z形槽" 使触针或打印喷嘴与表面接触，但不使表面发生弯曲或压陷。该点被定义为 "Z" 起始值。
        注意：可利用系统的Z轴高度轻松调节每条沟槽的深度。本实验展示了在1 mm厚的聚苯乙烯片材表面切割出40、80和170 µm深度沟槽的方法。图4 和 表1).
    5. 为每个坐标点选择打印指令， 即, "起始线分配" 定义起始点并启动打印 "传代培养" 用于标记中间点并 "终点分配" 向机器人发出信号以终止打印运行。
    6. 通过从顶部菜单栏中选择以下命令，将程序传输给机器人： "机器人 > 发送 C&T 数据".
    7. 通过将机器人切换至蚀刻/打印运行模式来启动蚀刻/打印程序 "运行" 模式。通过选择 "机器人 > 改变模式 > 切换运行模式" 从顶部菜单栏。
    8. 通过按下绿色按钮开始打印程序 "开始按钮" 在机器人分配仪控制台上。

3. 含细胞明胶生物墨水的制备与打印

  1. 在60 °C条件下，将2%明胶溶于添加了10%胎牛血清（FBS）和2%抗生素/抗真菌剂的最低必需培养基α（αMEM）中，持续2小时，以制备生物墨水溶液。
  2. 使用αMEM/10% FBS，在10 cm组织培养皿中将表达红色荧光蛋白的间充质干细胞（RFP-MSCs）预培养至70%汇合度。移除培养基后，加入1×胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟，使贴壁细胞脱落并悬浮。
  3. 在1,000 × g条件下离心5分钟收集细胞，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于0.5 ml的1× PBS中，并使用血细胞计数板测定细胞密度。
  4. 待生物墨水冷却至室温后，轻柔地将适量RFP-MSC悬浮液混入生物墨水中，使最终细胞浓度达到5 × 106 个细胞 ml−1。
  5. 将含细胞的生物墨水倒入针头已密封的打印注射器中。将装填好的注射器置于4 °C冷藏，以获得可打印的黏度。
  6. 将装填好的注射器安装至自动机器人分配系统，并连接气压管线。取下注射器鲁尔密封盖，安装打印针头。
  7. 使用10 ml注射器，通过27 G针头/喷嘴（推荐锥形而非圆柱形），在0.05 MPa背压和5 mm/sec书写速度下，按照步骤2.1中预设的沉积模式，将含细胞的生物墨水挤出成细线状，沉积于聚苯乙烯薄膜表面的预刻蚀沟槽上。
  8. 室温孵育1小时后，加入10 ml生长培养基（补充10% FBS和抗生素），继续培养24小时（以使细胞感知并响应刻蚀结构），随后在10倍放大倍率下使用倒置荧光显微镜观察。

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结果

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代表性结果表明，背压辅助的机器人分配系统可作为基于挤出的生物打印设备，用于实现表面刻蚀和生物墨水打印（图1 A）。该系统可用于在聚合物表面生成刻蚀沟槽，并随后将携带细胞的生物墨水直接打印至这些结构特征上（图1 B 和 C）。

刻蚀和打印均由输入打印/分配软件中的编程坐标（图2）决定，可根据应用需求打印直线、曲线和径向图案（图3 A-C）。Z轴设置可控制刻蚀凹槽的深度（图4 和 表1）。

将探针更换为水凝胶打印头后，原本用于控制刻蚀过程的程序可被重复利用，以驱动机器人分配系统将含有细胞的生物墨水直接递送至刻蚀形成的沟槽中，且遵循相同的...

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讨论

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该操作的关键步骤是干细胞的实际生物打印递送，此过程必须允许细胞沉降到特定结构中，打印时不发生生物墨水扩散或渗出，递送过程中不产生剪切应力导致细胞死亡，并且不诱导细胞向非目标谱系分化。

如果预期的细胞排列未能实现，则应评估生物墨水的黏度是否适合打印。重要的是，生物墨水应允许细胞沉降到图案化的聚合物表面。可通过降低生物墨水聚合物的浓度或提高其温度（最高不超过37 °C）来降低黏度，促进细胞沉降。然而，这些调整可能导致打印后生物墨水扩散或渗出。本文建议使用2%明胶（w/v）溶于1× PBS中。如果打印后细胞浓度似乎降低，则可能是打印过程中产生的剪切应力影响了打印细胞的活力7。可使用如刃天青荧光激活等活力检测方法，在打印前后检测生物墨水中的细胞活力7。此外，若生物打印的干细胞接触表面但未发生排列，则可能是打印过程中的剪切应力通过触发非预期的分化通路而降低了其多能性。打印后的干性可通过流式细胞荧光分选（FACS）分析进行评估，使用如CD29等干细胞标志物10,19,20。若发现剪切应力对细胞产生不利影响，可通过添加或替换为具有...

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披露

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作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

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本研究工作由新加坡国家研究基金会（CREATE 计划，NRF-Technion）：心脏修复治疗研究计划中的再生医学倡议项目，以及由科学技术研究局（A*STAR）下属科学与工程研究理事会（SERC）提供的公共部门资助（PSF）2012 年项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
自动化液体处理系统Janome2300N
等离子体处理仪Femto ScienceCovance
USB显微镜
光学显微镜OlympusIX71
名称公司货号备注
软件
电子表格软件ExcelExcel
打印坐标软件JanomeJR C-Points
图像分析软件美国国立卫生研究院（NIH）ImageJ
名称公司货号备注
仪器设备
刻划笔（刀片）OLFAAK-5
5 ml 打印用注射器San-ei TechSH10LL-B
30 G 打印用针头San-ei TechSH30-0.25-B
1 mm 聚苯乙烯板本地采购
胎牛血清Invitrogen 10270-098
磷酸盐缓冲液Invitrogen
猪皮来源明胶，凝胶强度 300，A 型Sigma Aldrich9000-70-8
αMEMInvitrogen41061-029
抗生素-抗真菌剂Sigma AldrichA5955-100ML
红色荧光蛋白标记的间充质干细胞（RFP-MSCs）Cyagen Biosciences IncorporationRASMX-01201

参考文献

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  1. Ma, Z., et al. Cell and Organ Printing. Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P. , Springer. Netherlands. 137-159 (2010).
  2. Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
  3. Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
  4. Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 123-152 (2015).
  5. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  6. Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  7. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  8. Skardal, A. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 1-17 (2015).
  9. Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16(2015).
  10. Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
  11. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
  12. Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
  13. Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
  14. Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
  15. Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
  16. Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
  17. Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089(2014).
  18. Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
  19. Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
  20. Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
  21. Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
  22. Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
  23. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  24. Merceron, T. K., Murphy, S. V. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 249-270 (2015).
  25. Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 229-248 (2015).
  26. Lee, K. V., et al. Bioprinting in Regenerative Medicine. Turksen, K. , Springer International Publishing. 33-66 (2015).
  27. Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
  28. Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
  29. Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
  30. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
  31. Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041(2014).
  32. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  33. Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
  34. Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109(2014).
  35. Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
  36. Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105(2014).
  37. Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels - The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).

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